CN104342472B

CN104342472B - 一种小球藻抑菌肽的制备方法

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Publication number: CN104342472B
Application number: CN201310320983.2A
Authority: CN
Inventors: 张拥军; 张高帆; 唐王裔; 孙佳悦; 唐旋; 陈丽莎; 朱丽云
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: Anhui Hanfang Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2017-07-25
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN104342472A

Abstract

本发明提供了一种小球藻抑菌肽的制备方法。本发明以小球藻为原料，利用超低温冷冻、低温超高压连续流细胞破碎结合超声波处理工艺，对小球藻有效破壁获得可溶性蛋白质，进而用生物酶法获得抑菌效果明显的抑菌肽。由于小球藻具有细胞壁异常坚固，壁内蛋白含量高的特点，发明的技术要点在于超低温冷冻、低温超高压连续流细胞破碎结合超声波处理工艺对小球藻进行处理，对小球藻有效破壁增加可溶性蛋白质含量，通过合适酶的选取与水解度的控制可以获得抑菌效果好的抑菌肽。

Description

一种小球藻抑菌肽的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及一种小球藻抑菌肽的制备方法。

（二）背景技术

国外学者在20世纪40年代就开始了对海洋抗菌活性物质的研究，50年前从海洋生物中发现并成功研制了第一个海洋新抗生素----头孢菌素，开创了开发新海洋抗生素的先河。自1944年Pratt首次从小球藻（Chlorella）中分离到有抗菌活性的小球藻素（chlorellin）脂肪酸混合物以来，从藻类提取对人类致病菌有杀灭作用物质的科学研究日益深化。1962年Starr等发现夏威夷蓝藻Lyngbya majuscula的甲醇提取物具有抗菌活性。此后Susann研究不同的蓝藻，发现其能产生多种抗菌物质，可作为抗生素的重要来源。1988年Murakami从甲藻Alexan-drium hiranoi中分离得到goniodomin A（60），具有较强的抗真菌活性。1988年Richard等研究表明，微藻提取物对革兰氏阳性菌——枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌——大肠杆菌均无抑制作用。Kellam等1988年对132种海水微藻和400种淡水微藻的有机溶剂提取物进行抗菌活性筛选，结果发现其中18种海水微藻及6种淡水微藻具有抗菌活性，表明海水微藻更具开发潜力。1989年Kellam等又从132种海洋微藻种发现27种具有抗菌活性，且海洋微藻的有机相提取物对细菌有较强抑制效果，而水相提取物几乎都没有抗菌活性。1991年Igarashi等指出藻类分泌物对对虾育苗池中细菌有抑制作用。1999年，Naviner等发现硅藻中的中肋骨条藻Skeletonemacostatum的水相提取液能抑制大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌及一些海洋细菌的生长。2006年，Herrero等[从杜氏盐藻中发现了15种不同的挥发性化合物（主要是棕榈酸、α-亚麻酸、油酸等）具有抗菌活性。

微藻抗菌物质具体作用机理目前没有明确定论，认识比较深入的作用机理主要包括：对菌体细胞结构和功能的破坏；对菌体代谢过程的影响；对菌体核酸等生物合成的干扰，而菌体通常不会对宿主产生明显的毒性。有些微藻中含有毒素成分，如引起赤潮的双鞭毛藻产生的石房蛤毒素（Saxitoxin），其LD₅₀为5～10μg/kg，是一种极强的神经毒素。某些微藻毒素在适度的微剂量下具有良好的抗肿瘤、抗病毒等活性，同时也可能通过神经系统的毒性达到抑制微生物的效果，已成为海洋活性物质的研究热点之一。从海洋蓝藻鞘丝藻Lyngbya majuscule中提取到的毒素majusculamide C，对骨髓瘤细胞和HIV病毒具有很强的抑制作用，同时也是一种较好的微生物抑制剂。微藻毒素所产生的抑菌效果应该是其毒性作用的体现之一，对菌体和宿主均产生明显抑制或毒性作用，一般不单独作为抗菌物质使用。此外还有众多学者对多种不同种类微藻的抗菌活性进行了筛选，大量的研究表明，许多微藻含有结构独特的抗菌物质，其有效成分逐渐被确定，已知的有脂肪酸、其它有机酸、溴酚、酚类抑制剂、丹宁、类萜、肽类、多糖和其它碳水化合物及酚类，在一种微藻中可能含有以上几种不同的抗菌成分，发挥不同的抗菌作用，整体表现出协同抗菌能力，不同种类的微藻中也可能存在同一种抗菌物质。由于微藻抗菌成分的多样性，不同藻类对细菌和真菌的抑制活性也有明显的差异。

国内在微藻抗生素的研究和开发方面起步较晚，20世纪80年代开始有零星报道，经过20多年的积累，才逐渐成为研究热点之一。1988年郑天凌用纸片法、涂布法和液体法研究了小等鞭金藻Prymnesium parvum的培养液和细胞抽提物对10株肠道菌或非肠道菌的抗菌作用，发现对其中8个菌株有抗菌作用。2004年叶锦林等研究了紫球藻提取液及其多糖溶液抗病原细菌、真菌性能，表明两者对革兰氏阳性细菌的抑菌作用较为明显。2006年尹鸿萍等对小鼠腹腔注射感染金黄色葡萄球菌，再对其施用盐藻多糖，结果发现100mg/kg和200mg/kg剂量组的盐藻多糖能显著增加感染小鼠24h内存活数，表现出一定的抗菌能力。2007年，王芹等对22种微藻的藻粉萃取液进行了抗菌实验，发现不同提取溶剂对抗菌活性有一定影响，但提取液对革兰氏阳性菌和阴性菌生长的抑制作用并无明显差别。2010年张学超等研究表明等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的水溶性物质及脂溶性物质对鳗弧菌有抑制作用，等鞭金藻、三角褐指藻的水溶性物质及等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的脂溶性物质对假单胞菌有抑制作用。但目前国内的工作与国外研究相比，尚缺乏深度，存在一些亟需解决的问题。

食品工业发展的关键问题之一就是食品的保鲜防腐问题。据统计，全世界每年约有10%-20%的食品损失于各种腐败，其中主要是由微生物造成的腐败。而防腐剂与有害微生物指标超过国家标准的食品也屡见不鲜，防腐剂的安全性问题越来越受到人们的重视。因此，开发广谱抑菌、高效、无毒的天然防腐剂是食品工业发展的必然趋势。近年来，天然抑菌物质的研究报告很多，其中抑菌效果好的植物可以作为抑菌物质的潜在替代源，从而具有了研究的应用价值和经济价值。

自然界中微藻有3万多种，但目前被人类利用开发的只有十余种。小球藻（Chlorella pyrenoidosa FACHB5）是一类普生性单细胞藻类。小球藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，具有很高的应用价值。以小球藻酶水解抑菌肽作为天然防腐剂用于食品中来达到抑菌的目的，不但在食品加工业将有广阔的应用前景，并且在环境保护等方面做出了一定贡献。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种以小球藻为原料，利用超低温冷冻、高压蒸煮结合超声波处理工艺，对小球藻有效破壁，以增加其可溶性蛋白质含量，并进一步采用不同蛋白酶对获得的蛋白质进行酶解，获得抑菌效果明显的抑菌肽。

本发明采用的技术方案是：

一种小球藻抑菌肽的制备方法，所述方法包括：

（1）小球藻蛋白质的预处理：取小球藻粉，加入适量水混合均匀，在-50～-40℃下冷冻2～3h后，室温下融化，补加水至料液比为1（g）：20～40（mL），放入超声波萃取仪中，在20～30℃、20～30KHz下超声波处理10～20min后，再采用低温超高压连续流细胞破碎仪，在4～6℃、180～200Mpa压力下处理5～8min后，在40～60℃、20～30KHz下超声提取2～3小时，提取后离心（10000r/min，离心20min），得到上清液1和滤渣1；

（2）滤渣1按步骤（1）方法重复提取3次，依次得到上清液2、上清液3和上清液4，合并上清液1～4，得到小球藻提取液；

（3）将小球藻提取液浓缩，加入足量80～95%乙醇溶液，在-4℃条件下静置12～24h，离心，取沉淀物，用水溶解后浓缩，冷冻干燥得小球藻蛋白；

（4）取小球藻蛋白，加入至酶解缓冲液中至其质量浓度为5～10%，胰蛋白酶添加为1000～2000U/mL，在pH8.0、37℃下进行酶解反应40～60min后，结束酶解反应，酶解液经聚砜膜进行膜过滤，

收集分子量在1～20kD的浓缩液，得到所述小球藻抑菌肽。所述，

酶解缓冲液为常规适用于胰蛋白酶酶解反应的缓冲液。

具体的，步骤（3）酶解缓冲液为20mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液，配制方法是分别配制Tris与HCl溶液，再按比例混合两种溶液，配制方法如下：分别配制0.1mol/L Tris水溶液（称取1.214g Tris，定容1000mL）与0.1mol/L HCl溶液（量取860uL浓盐酸，定容1000mL），再取100mL的0.1mol/L Tris与58.4mL的0.1mol/L稀HCl，混匀定容至500mL，即得20mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液。

本发明以小球藻为原料，利用超低温冷冻、低温超高压连续流细胞破碎结合超声波处理工艺，对小球藻有效破壁获得可溶性蛋白质，进而用生物酶法获得抑菌效果明显的抑菌肽。由于小球藻具有细胞壁异常坚固，壁内蛋白含量高的特点，发明的技术要点在于超低温冷冻、低温超高压连续流细胞破碎结合超声波处理工艺对小球藻进行处理，对小球藻有效破壁增加可溶性蛋白质含量，通过合适酶的选取与水解度的控制可以获得抑菌效果好的抑菌肽。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

（1）针对小球藻细胞壁异常坚固的特点，首先通过一种比较温和的破壁方式，可以避免高温对原料所造成的营养损失等不良影响，也是使细胞破裂较为彻底的方法，即先在-50℃冷冻、再在室温缓慢融化的超低温冷冻的方法，使小球藻异常坚固的细胞壁变得松脆。再利用超声波产生的空化作用、机械作用加速细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出。在此基础上，进一步采用低温超高压连续流细胞破碎法，利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放，在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下使细胞破碎，使物质均质、分散、乳化、颗粒纳米化。细胞破碎全过程在4℃～6℃的低温循环水浴中进行，保持原有物质活性和性能。小球藻经上述预处理后，采用超声波法进行工艺优化，整个工艺过程完全是单纯的物理方法使小球藻有效破壁，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等优点，获得的小球藻可溶性蛋白营养、安全、无污染。

（2）本发明所得产品纯度高，其中蛋白质含量可高达60%以上，比传统的热水浸提得到的蛋白质提高了7.47倍，比单独超低温冷冻后浸提得到的蛋白质提高了4.84倍，比单独超声浸提得到的蛋白质提高了5.69倍，比超低温冷冻结合超声波处理浸提得到的蛋白质提高了2.60倍，比超低温冷冻、超高压结合超声波处理浸提得到的蛋白质提高了1.15倍；工艺条件温和，绿色环保，符合保健食品的生产要求。

（3）本发明对制备的小球藻蛋白质，采用温和的生物酶法，即胰蛋白酶进行酶解，当酶解时间为40min时，小球藻蛋白质酶解原液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率均可达到100%，远远优于酶解前的10%和11%的抑菌率。

（4）本发明所获得的抑菌肽来自天然小球藻材料，原料易得成本低，安全无毒。

（四）附图说明

图1为蛋白质标准曲线；

图2为提取温度对小球藻蛋白质提取率的影响；

图3为液料比对小球藻蛋白质提取率的影响；

图4为提取时间对小球藻蛋白质提取率的影响。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1．小球藻蛋白的提取工艺优化研究

1.1材料与试剂

小球藻干粉，来自浙江省杭州华丹农产品有限公司；Bio-Rad Protein Assay试剂盒，购自Bio-Rad Laboratories Inc；硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，甲基红指示剂（C₁₅H₁₅N₃O₂），溴甲酚绿指示剂（C₂₁H₁₄Br₄O₅S），亚甲基蓝指示剂（C₁₆H₁₈ClN₃S·3H₂O），氢氧化钠，95%乙醇，硼酸溶液（20g/L），混合指示液（2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合）。

1.2实验仪器

酶联免疫检测仪（Model-550），美国Bio-Rad公司；JN-02C低温超高压连续流细胞破碎机，广州聚能生物科技有限公司；高速冷冻离心机（5415R），德国Eppendorf公司；电子天平（BS224S）；凯氏定氮仪（KDY-9820）AL04型电子天平、HH-2型水浴锅、DHG-9240A型鼓风干燥箱、DL-5M离心机（配更换转头）、SANYO超低温冰箱。

1.3实验方法

1.3.1小球藻中蛋白质总量测定。采用凯氏定氮法（GB5009.5-2010）。

1.3.2提取液中蛋白含量测定

采用Bio-Rad Protein Assay法，按试剂盒说明操作，每个样本设3个平行孔。同时以标准牛血清蛋白的质量浓度（分别为0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL，0.5mg/mL）为横坐标，OD₅₉₅ 值为纵坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。

1.3.3小球藻蛋白质的预处理及提取率

取小球藻粉40g，加200mL水混合均匀，在-50℃超低温冷冻3h后，室温下融化，补水至1000mL，放入超声波萃取仪中，在20℃，30KHz下超声波处理10min，再采用低温超高压连续流细胞破碎仪，在180Mpa压力下处理6min后，再次采用超声波技术提取小球藻蛋白质，超声波功率设定在30KHz，提取时间、温度与料液比按下述1.3.4的提取工艺试验，每次提取后离心（10000r/min，离心20min），取滤渣按1.3.4的提取工艺条件循环提取3次，合并4次上清液。蛋白质提取率按下式计算：

1.3.4小球藻蛋白质提取工艺试验

（1）液料比对小球藻蛋白质提取率的影响

固定温度为60℃，提取时间2h，液料比分别为20:1、30:1、40:1、50:1、60:1的条件下提取小球藻蛋白质。

（2）提取温度对小球藻蛋白质提取率的影响

固定液料比为40:1，提取时间2h，提取温度分别为30、40、50、60、70、80℃的条件下提取小球藻蛋白质。

（3）提取时间对小球藻蛋白质提取率的影响

固定温度为60℃，液料比为40:1，提取时间分别为1.5、2、2.5、3、3.5、4h的条件下提取小球藻蛋白质。

（4）响应曲面优化试验的设计

本试验采用统软的数据处理软件Statistica5.0来设计原理设计响应面试验。根据单因素试验结果，选取液料比、提取温度和提取时间3个因素作为试验因素，以蛋白质提取率为响应值设计试验，试验因素及水平见表1：

表1：响应曲面分析因素与水平

因素	温度(℃),x₁	料水比,x₂	时间(h),x₃
				-1	50	1:30	2
0	60	1:40	2.5
				1	70	1:50	3

1.4实验结果

1.4.1小球藻蛋白质含量

蛋白质标准曲线见图1。测得蛋白质标准曲线为：Y=0.79X+0.3029，R²=0.9958。式中，Y为OD₅₉₅nm值；X为溶液中蛋白质的浓度。

根据蛋白质标准曲线计算小球藻中蛋白质含量为61.28%。

1.4.2单因素对小球藻蛋白质提取率的影响

（1）提取温度对小球藻蛋白质提取率的影响

结果见图2。由图2可以看出，提取温度对小球藻蛋白质提取率有较大的影响。在提取温度比较低时，蛋白质提取率随着提取温度的增大而显著提高，在提取温度为60℃时蛋白质提取率达到最高值，此后，再增加提取温度，蛋白质提取率明显下降。

（2）液料比对小球藻蛋白质提取率的影响

结果见图3。由图3可以看出，液料比对小球藻蛋白质提取率有较大的影响。在液料比较低时，蛋白质提取率随着液料比的增大而显著提高，在液料比为40:1时蛋白质提取率达到最高值，此后，再增加液料比，蛋白质提取率下降。

（3）提取时间对小球藻蛋白质提取率的影响

结果见图4。由图4可以看出，提取时间对小球藻蛋白质提取率有较大的影响。在提取时间比较短时，蛋白质提取率随着提取时间的增大而显著提高，在提取时间为2.5h时蛋白质提取率达到最高值，此后，再增加提取时间，蛋白质提取率下降。

1.4.3提取工艺条件的优化

响应面分析法（RSA），是一种精度高、应用广泛的统计方法。它采用多元二次回归方程来拟合因素与指标（响应值）之间的函数关系，并通过响应面的等值线分析来寻求最优工艺参数。RAS试验设计组合和小球藻蛋白质提取率见表2。

表2：提取工艺RAS试验设计组合和响应值

	料水比	提取时间	提取温度	提取率(%)
					1	-1	-1	0	38.14
2	-1	0	-1	41.18
					3	-1	0	1	47.50
4	-1	1	0	61.78
					5	0	-1	-1	37.91
6	0	-1	1	34.16
					7	0	1	-1	49.84
8	0	1	1	61.66
					9	1	-1	0	39.43
10	1	0	-1	51.25
					11	1	0	1	49.02
12	1	1	0	50.54
					13	0	0	0	56.62
14	0	0	0	53.67
					15	0	0	0	57.45

表2中15个实验点可分为两类：其一是析因点，自变量取值在x₁,x₂,x₃所构成的三维顶点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。实验中数据采用统软的数据处理软件Statistica5.0来处理，三维曲面图和等值线也用它来绘制。以小球藻蛋白质提取率为响应值，经回归拟合后，各试验因子对响应值的影响可用下列函数表示：

对回归方程进行方差分析，结果见表3：

表3：回归方程的方差分析

方差来源	平方和	自由度	平均平方和	F	显著性
						一次项	5.402	3	1.801	947.37	**
二次项	2.521	3	0.840	442.11	**
						交互项	0.135	3	0.045	23.68	*
失拟项	0.484	3	0.161	84.74	*
						误差	0.0038	2	0.0019
总和	8.276	14

其中，F_0.05(3,2)=19.16,F_0.01(3,2)=99.17

对于α=0.01，N₁=9，N₂=5，查F分布表，得Fα=10.15。

分析结果表明，用回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的多元回归关系呈显著性（R>R_0.01）。因此，可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

为了进一步验证最佳期点的值，对回归方程取一阶偏导等于零并整理得：

解得：x₁=0.2786,x₂=0.6192,x₃=0.1057

即小球藻蛋白质提取的最佳参数为：提取温度55.57℃，料水比1:32.36，提取时间2.21h。考虑到实际操作的便利，确定球藻蛋白质提取的最佳工艺参数为：提取温度55℃，料水比1:35，提取时间130min。

2制备小球藻抑菌活性肽的工艺研究

2.1实验材料和仪器

2.1.1实验材料

胰蛋白酶购自国药集团化工试剂公司。菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均为中国计量学院微生物实验室提供。营养肉汤培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl5克，水1000毫升，pH7.0～7.2。营养琼脂培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl5克，琼脂20克，水1000毫升。

2.1.2主要仪器

CT14RD高速冷冻离心机、UV1000紫外分光光度计、Tank60Liter PE超纯水机、VS-840K-U洁净工作台、ZHWY-2102C冷冻恒温培养摇床、ES-315高压蒸汽灭菌锅、GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱、PHX型智能生化培养箱、ZHWY-11030往复式水浴恒温培养摇床、电子天平等。

2.2实验方法

2.2.1胰蛋白酶对小球藻蛋白的酶解反应

按上述1的实验方法，将小球藻经超低温、超高压结合两次超声波处理工艺后的提取液离心，离心机转速为10000r/min，离心20min后，获得上清液536mL，浓缩至体积为300mL后，按1：4比例加入95%医用酒精，在-4℃条件下静置12h，离心，离心机转速为3000r/min，离心15min，取沉淀物，溶于200mL水后再次浓缩，获得浓缩液110mL，冷冻干燥得小球藻蛋白14.51g。取小球藻蛋白10g，设定质量分数浓度为5%，酶添加为1000U/mL，在胰蛋白酶的最适pH（8.0）和最适温度（37℃）下，胰蛋白酶的酶解反应分别为5、10、20、30、40、50、60、90min时，分别取酶解液在85℃钝酶15min结束酶解反应，测定抑菌率。

酶解所用缓冲液配制方法如下：0.1mol/L Tris水溶液：称取1.214gTris，定容1000mL。0.1mol/L盐酸溶液：量取860uL浓盐酸，定容1000mL。20mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液：100mL的0.1mol/L Tris与58.4mL的0.1mol/L稀盐酸，混匀定容至500mL。

2.2.2小球藻抑菌肽的抑菌测定方法

2.2.2.1供试菌种的培养和菌悬液的配制

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基37℃培养。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上或营养琼脂培养基上，37℃培养24h。用接种环分别挑取少许培养好的菌体于装有无菌生理盐水的试管内，振荡均匀，制成菌悬液。用平板菌落计数法测定其菌液浓度，并用稀释法，使菌液含菌数为10⁴个/ml，即为供试菌悬液。

2.2.2.2小球藻抑菌肽的抑菌率测定

抑菌率的大小可以反映小球藻抑菌肽抑菌功能的高低，影响抑菌率的有两个因素，一是酶解时间，二是酶解液浓度。经过预试验的探索比较，发现浓度分为原液、10倍稀释、20倍稀释、40倍稀释这四个梯度比较合理，相应的将这四个梯度设置为C1、C2、C3、C4。将稀释后的酶解液各加3ml到平皿中与约10ml的营养琼脂混合，制成抑菌平板。在灭过菌的含有20ml营养肉汤的试管中，各接入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌种，在摇床中37℃培养4～5小时后，用移液器取50ul菌液涂布到抑菌平板上，恒温箱中37℃培养10小时，菌落计数。

抑菌率（%）=（对照培养菌落数-样品培养菌落数）/对照培养菌落数×100%

2.2.3实验结果

选用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）作为代表菌，胰蛋白酶酶解小球藻蛋白质的酶解产物的抑菌率见表4。

表4：胰蛋白酶不同水解时间酶解液的抑菌率比较

上述实验结果表明，胰蛋白酶对小球藻蛋白质作用不同时间的酶解产物，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率均有差异。当酶解时间为40min时，小球藻蛋白质酶解原液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率是最高的，可达100%。随着酶解液浓度的降低，小球藻蛋白质40min时的酶解液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率均高于同等稀释度的其他时段的酶解液。因此优先胰蛋白酶对小球藻蛋白质作用时间为40min时的酶解产物，为最佳的抑菌物质。

实施例2：

（1）小球藻蛋白质的预处理：取小球藻粉40g，加入200mL水混合均匀，在-40℃下冷冻2h后，室温下融化，补加水1200mL（总料液比为1:35），放入超声波萃取仪中，在30℃、20KHz下超声波处理20min后，再采用低温超高压连续流细胞破碎仪，在200Mpa压力下处理8min后，在55℃、20KHz下超声提取130min，离心（10000r/min，离心20min），得到上清液1和滤渣1；

（2）滤渣1按步骤（1）条件循环提取3次，依次得到上清液2～4，合并上清液1～4得到小球藻提取液；按实施例1方法计算，小球藻中蛋白质的提取率为62%；

（3）将小球藻经超低温、超高压结合两次超声波处理工艺后的3次提取液合并后，获得上清液1644mL，浓缩至体积为300mL后，加入1200mL的95%医用酒精，在-4℃条件下静置12h，离心，离心机转速为3000r/min，离心15min，取沉淀物，溶于200mL水后再次浓缩，获得浓缩液116mL，冷冻干燥得小球藻蛋白14.14g；

（4）取小球藻蛋白10g，加入至酶解缓冲液中至其质量浓度为10%，胰蛋白酶添加为2000U/mL，在pH8.0、37℃下进行酶解反应50min后，酶解液在85℃钝酶15min结束酶解反应，酶解液经聚砜膜进行膜过滤，收集分子量在1～20kD的浓缩液，得到所述小球藻抑菌肽。所述酶解缓冲液为20mM、pH8.0Tris-HCl缓冲液，配制方法如下：100mL的0.1mol/L Tris与58.4mL的0.1mol/L稀盐酸，混匀定容至500mL。

（5）将所述小球藻抑菌肽用蒸馏水配制成质量浓度5%的溶液，按照实施例1方法检测，测得其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率均可达100%。

比较例1：

取小球藻粉20g，加700mL水混合均匀，采用沸水浴抽提，提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h时，分别循环提取3次，按实施例1计算小球藻中蛋白质的提取率，提取5h的提取液按实施例2步骤（2）～（4）提取抑菌肽并测定抑菌率，结果见下表5所示：

表5：不同处理工艺小球藻蛋白质的提取率及抑菌率

由表5可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大，超低温、超高压结合超声波处理工艺可使小球藻内为可溶性蛋白质的提取率大大增加。热水抽提时，随时间增加，小球藻内可溶性蛋白质的提取率不断增加，到4h后，再增加提取时间，蛋白质的提取率趋于平缓。与热水抽提相比，超低温、超高压结合两次超声波处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加7.47倍。

比较例2：

取小球藻粉20g，加100mL水混合均匀，在-50℃超低温冷冻3h后，室温下融化，继续加入至700mL，混合均匀，采用沸水浴抽提，提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h时，分别循环提取3次，按实施例1计算小球藻中蛋白质的提取率，提取5h的提取液按实施例2步骤（2）～（4）提取抑菌肽并测定抑菌率，结果见下表6所示：

表6：不同处理工艺小球藻蛋白质的提取率及抑菌率

由表6可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。小球藻经超低温冷冻预处理后再用热水抽提，提取率高于热水抽提，且随时间增加，小球藻内可溶性蛋白质的提取率不断增加，到3h后，提取时间继续增加时，蛋白质的提取率趋于平缓。与超低温冷冻预处理工艺相比，超低温、超高压结合两次超声波处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加4.84倍。

比较例3：

取小球藻粉20g，加700mL水混合均匀，采用超声波技术提取小球藻蛋白质，超声波功率设定在30KHz，在55℃提取温度下，提取130min，循环提取3次后，按实施例1计算小球藻中蛋白质的提取率，提取液按实施例2步骤（2）～（4）提取抑菌肽并测定抑菌率，结果见下表7所示：

表7：不同处理工艺小球藻蛋白质的提取率及抑菌率

由表7可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。小球藻采用超声波提取工艺，提取率高于热水抽提，且提取时间比热水抽提的时间短。与超声波提取工艺相比，超低温、超高压结合两次超声波处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加5.69倍。

比较例4：

取小球藻粉20g，加100mL水混合均匀，在-50℃超低温冷冻3h后，室温下融化，继续加入至700mL，混合均匀，采用超声波技术提取小球藻蛋白质，超声波功率设定在30KHz，在55℃提取温度下，提取130min，循环提取3次后，按实施例1计算小球藻中蛋白质的提取率，提取液按实施例2步骤（2）～（4）提取抑菌肽并测定抑菌率，结果见下表8所示：

表8：不同处理工艺小球藻蛋白质的提取率及抑菌率

由表8可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。小球藻采用超低温结合超声波提取工艺，提取率明显高于热水抽提，且提取时间比热水抽提的时间短。与超低温结合超声波提取工艺相比，超低温、超高压结合两次超声波处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加2.60倍。

比较例5：

取小球藻粉40g，加200mL水混合均匀，在-50℃超低温冷冻3h后，室温下融化，继续加入至700mL，混合均匀，采用低温超高压连续流细胞破碎仪，在180Mpa压力下处理6min后，再采用超声波技术提取小球藻蛋白质，超声波功率设定在30KHz，在55℃提取温度下，提取130min，循环提取3次后，按实施例1计算小球藻中蛋白质的提取率，提取液按实施例2步骤（2）～（4）提取抑菌肽并测定抑菌率，结果见下表9所示：

表9：不同处理工艺小球藻蛋白质的提取率及抑菌率

由表9可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。小球藻采用超低温、超高压结合超声波提取工艺，提取率与单一处理方式的超低温处理或超声波提取明显提高，且提取时间比热水抽提的时间短。与超低温、超高压结合超声波提取工艺相比，超低温、超高压结合两次超声波处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加1.15倍。

Claims

1.一种小球藻抑菌肽的制备方法，所述方法包括：

（1）取小球藻粉，加入适量水混合均匀，在-50～-40℃下冷冻2～3h后，室温下融化，补加水至料液比为1：20～40，放入超声波萃取仪中，在20～30℃、20～30KHz下超声波处理10～20min后，再采用低温超高压连续流细胞破碎仪，在4～6℃、180～200Mpa压力下处理5～8min后，在40～60℃、20～30KHz下超声提取2～3小时，提取后离心，得到上清液1和滤渣1；

（4）取小球藻蛋白，加入酶解缓冲液中至其质量浓度为5～10%，胰蛋白酶添加为1000～2000U/mL，在pH8.0、37℃下进行酶解反应40～60min后，结束酶解反应，酶解液经聚砜膜进行膜过滤，收集分子量在1～20kD的浓缩液，得到所述小球藻抑菌肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）酶解缓冲液为20mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液。