CN103509736B - 一种产磷脂酶c的菌株及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产磷脂酶C的菌株及其筛选方法。该菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonas？fluorescens)P.f-9103，菌种保藏号为CCTCC？No.M2013298。本发明所述菌株从油脂车间附近的土壤中筛选分离得到，菌落形态：圆形、表面凸起、白色不透明菌落，老龄泛黄色；光滑、较粘稠、易挑起、边缘整齐；有鞭毛，可运动，不产芽胞；革兰氏阴性菌，需氧，最适生长温度25-30℃，pH7.0-7.6。筛选方法为在添加卵黄的LB培养基上进行初筛，然后以磷脂为底物进行酶促反应，用HPLC分析反应产物进行复筛。该方法以天然磷脂为底物进行复筛，避免了磷脂酶C对磷脂底物类似物NPPC无活性带来的弊端。初筛原料来源丰富、操作方便，复筛准确、快速，适合产磷脂酶C菌株的高通量筛选。

Description

一种产磷脂酶C的菌株及其筛选方法

技术领域

本发明涉及到一株产磷脂酶C菌株及其筛选方法，属于微生物领域。

背景技术

磷脂酶C(PLC，EC3.1.4.3)是专一水解天然磷脂Sn-3位磷脂酰酯键的水解酶，在生物的生命活动中起着第二信使的作用，广泛分布于细菌、酵母菌、粘菌、果蝇、蛙及各种哺乳动物体中，可应用于医药、饲料改良和食品工业领域。医药方面，用于研制抗血小板聚集药物，预防血栓形成和心脑血管疾病。在饲料改良方面，磷脂酶添加于饲料中水解磷脂，改善饲料的利用效率和促进动物生长。在食品工业方面，PLC可被应用于油脂脱胶；同时由于磷脂酶可使面团形成胶状复合体，减少淀粉回生，应用于烘焙行业。

近年来，随着PLC在食品、医药、饲料等领域的广泛应用，国内外学者对其进行了大量的研究。与其他来源的PLC相比，微生物具有生长繁殖快、培养周期短、产酶量高等特点。已知产PLC菌株有蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfrinsens)、水肿梭菌(C.oedematiens)、溶血梭菌(C.haemslyticum)、双酶梭菌(C.bifermentans)、蕈状芽孢杆菌(B.mucoiddes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluore-scens)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。

国外对PLC的研究一直处于领先水平，国外已经有用于工业化油脂脱胶的PLC(VereniumCorporation,USA)。我国PLC酶制剂，目前主要依赖进口，研究具有自主知识产权的PLC酶制剂具有现实意义，菌株筛选是其中的一个重要环节。

目前，PLC酶活定量方法为NPPC法，也作为一种复筛方法来应用。因采用磷脂酰胆碱的结构类似物一对硝基磷酸胆碱(p-nitrophehylphosphoryl-choline，简称NPPC)作为磷脂酶C反应的底物而得名。利用磷脂酶C水解NPPC产生对硝基苯酚，对硝基苯酚是一种黄色物质，在410nm处有最大吸收。利用分光光度计测定反应前后吸光度的变化可测定出酶反应所产生的对硝基苯酚的量，从而可计算出检测样品的酶活力。该法最早由KuriokaS等人创立，因其操作方便、重现性好、反应时间短(3omin)而得到广泛的应用。缺点是NPPC合成成本较高，导致测定成本较高。2000年AntjeFlieger等人报道称除了PLC，其他几种能够作用于磷酸酯类的酶也可以作用于NPPC，干扰筛选结果(AntjeFliegera,*,ShimeiGonga,b,MarionFaiglea,BirgidNeumeistera.Criticalevaluationofp-nitrophenylphosphorylcholine(p-NPPC)asartificialsubstrateforthedetectionofphospholipaseC.EnzymeandMicrobialTechnology26(2000)451–458)。另外，NPPC作为一种磷脂类似物，在结构上与天然磷脂存在差别，2003年，GraemeC.Clark等报道称从患有气性坏疽的病人体内分离得到一株产PLC的Clostridiumabsonum，该菌所产PLC与Clostridiumperfringens相比，对卵磷脂活性为其2倍，溶血活性是其1.5倍，对以磷脂酰胆碱为基质的脂质体的活性是其7倍，而对于NPPC的活性则弱于ClostridiumperfringensPLC。所以，以PPC这种天然磷脂类似物作为活性评价标准与其真实活性存在一定的偏差。

另外，野生株产酶量一般较低，且发酵液往往有一定颜色，也会干扰NPPC为底物时对硝基苯酚的测定。所以有必要寻找一种新的复筛方法来克服NPPC测定PLC的缺点。

发明内容

鉴于上述和/或现有微生物领域中存在的问题，提出了本发明。

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一株能够产生磷脂酶C的菌株，以扩大PLC菌源。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种产磷脂酶C的菌株，所述菌株保藏名称为P.f-9103，保藏编号为CCTCCNo.M2013298，该菌株为需氧菌，最适生长温度为25～30℃,pH值为7.0～7.6。

本发明另一个目的是在于提供了一种产PLC菌株筛选方法，该方法能够准确快速的确定产PLC的菌株，可以克服传统NPPC法筛选的缺点。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种筛选方法，包括如下步骤，

(1)菌株分离，取样品涂布到培养基，30℃～37℃过夜培养微生物；

(2)菌株初筛，将所述微生物在含卵黄的LB培养基上进行初筛得到初筛的菌株；

(3)菌株复筛，将初筛的菌株进行发酵，取发酵上清液在卵黄硼砂琼脂培养基上继续复筛；

(4)菌株分析，将发酵上清与天然磷脂进行酶促反应，有机溶剂萃取反应产物进行HPLC分析。

作为本发明所述筛选方法的一种优选方案，其中：步骤(1)所述培养基为LB琼脂培养基，其是以胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4-7.6并121℃灭菌20min得到。

作为本发明所述筛选方法的一种优选方案，其中：步骤(2)所述含卵黄的LB培养基为卵黄LB琼脂培养基，其是取10ml50%卵黄液加入到已灭菌并已冷却至90ml55℃的LB琼脂培养基中得到。

本发明提供一种产PLC菌株筛选方法，该方法以卵黄平板初筛出具有酯酶活性的菌株，操作方便，然后用HPLC分析酶解卵磷脂产物，看是否生成了甘二酯，准确快速的确定产PLC的菌株。该方法可以克服传统NPPC法筛选的缺点，简单准确。

具体实施方式

本发明公开了一种产PLC菌株的筛选方法及其筛选出的菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当更改工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被包括在本发明。本发明所示筛选方法及产PLC菌株已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更和组合，来实现和应用本发明技术。

申请人从油脂脱胶车间及其附近取样，实验初期将培养得到的菌株在含卵黄的LB琼脂培养基上培养，从中挑选出能够产生水解圈的菌株，然后挑取阳性菌株在24孔板中用液体LB摇菌培养，发酵上清液一方面注入卵黄硼砂平板上的牛津杯中，进一步验证水解圈，另外一方面将确证无误之后的发酵上清用来与天然磷脂过夜反应，然后用一定比例的正己烷：异丙醇进行萃取，用HPLC分析酶解产物，看是否有甘二酯生成来确定PLC。

经过以上步骤筛选，得到一株能够产PLC的菌株P.f-9103，经形态特征、生理生化特征和16srDNA鉴定，该菌株在分类学上属于为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，命名为P.f-9103，申请人于2013年6月28日将该菌株保藏于湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNo.M2013298。

依照本发明，一种产PLC菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1、菌株分离：取土样1g加到100ml带玻璃珠的无菌水中，在30-37度恒温摇床上150-300r/min振摇破碎20min，然后梯度稀释为10-3、10-4、10-5浓度，取100ul涂布到LB培养基，37℃过夜培养。

步骤2、菌株初筛：取单菌落均匀分布的平板，将单菌落用灭菌牙签点植到含10%卵黄液的LB培养基上，30-37℃培养6-10h。在24孔板中加1.5mlLB液体培养基，挑取菌落周围产生白色水解圈的菌落到24孔板中30-37℃摇菌培养过夜。

步骤3、菌株复筛：取24孔板中菌液离心得发酵上清，取1ml发酵上清液加到1ml含3%卵磷脂悬浊液中，30-37℃于恒温气浴摇床上过夜反应。第二天采用2ml流动相A萃取，离心、过针头式滤器(0.22μm)除去杂质后，HPLC梯度洗脱分析有无1,2-甘二酯(DAG)、游离脂肪酸FFA生成。若只有1,2-DAG而没有FFA则可以说明所筛菌株产PLC。

初筛培养基的制备：

卵黄LB琼脂培养基：取10ml50%卵黄液加入到已灭菌并已冷却至90ml55℃左右的LB琼脂培养基中，趁热摇匀后倒平板。

复筛培养基的制备：

卵黄硼砂琼脂平板：NaCl:0.66%，硼酸:1.09%，硼砂:0.19%，琼脂:1.5%，卵黄液:10%。先称取NaCl1.32g、硼酸2.18g、硼砂0.38g，溶于180g水中，调整pH至7.2；加入3g琼脂，加热使琼脂充分溶解，补水至准确体积后灭菌。取10ml50%卵黄液加入到已灭菌并已冷却至55℃左右的硼砂琼脂液中，趁热摇匀后倒平板。

以下通过具体实施例对本发明所述技术方案做进一步说明。

实施例：利用本发明所述方法筛选本发明所述产PLC菌株，

1、采样：从山东鲁花、山东渤海粮油、张家港东海粮油、丰益上海研发中心、浙江台州某油厂共五个地方采集土样

2、按上述方法进行筛选，得到一株产PLC的菌株，经分析无脂肪酶活性。

3、菌株鉴定：生理生化特征鉴定、16SrDNA鉴定。结果如下：

表2本发明所述菌株P.f-9103的生理生化特征

序号

检测项目

结果

1	蛋白胨水（色氨酸肉汤)	+
			2	MR	—
3	VP	—
			4	西蒙氏柠檬酸盐	+
5	绿脓色素	—3 -->
			6	明胶	+
7	硝酸盐产气	—
			8	营养琼脂(41-42℃)	—
9	氧化酶试纸	+
			10	OF	发酵型
11	DNA	—
			12	麦芽糖	—
13	甘露醇	—
			14	木糖	+
15	精氨酸双水解酶	+
			16	硝酸盐还原	—

序列分析：菌株P.f9103的16SrDNA序列在GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中进行比对分析鉴定菌株。序列分析结果表明，菌株P.f-9103与荧光假单胞菌同源性为99%，该菌株为需氧菌，最适生长温度为25～30℃,pH值为7.0～7.6。

综上，该菌株P.f-9103形态学、生理生化特征菌株P.f-9103符合假单胞菌属(Pseudomonas)，且序列分析表明该菌株与荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)同源性相似性为98%。由此鉴定，菌株P.f-9103属于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种产磷脂酶C的菌株，其特征在于：所述菌株保藏名称为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)P.f-9103，保藏编号为CCTCCNo.M2013298。