CN103509742A - 一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其筛选方法，本发明所述菌株ELAT4的分类命名为地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年2月10日，保藏号为：CGMCC No.5700。本发明所述筛选方法的具体步骤依次包括：土样采样、菌株富集培养、菌株初筛、菌株分离纯化和菌株复筛。本发明的产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株容易培养，生产安全性高，筛选所得菌株液体发酵培养酶活达到175-211U/ml,遗传稳定性好，其代谢产物弹性蛋白酶容易分离纯化，且其代谢产物弹性蛋白酶的酶活性较高。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其筛选方法。
背景技术
弹性蛋白酶（elastase）是一种以水解不溶性弹性蛋白质为主的广谱蛋白水解酶，它主要从动物胰脏中分离获得。该酶在微生物类群中也广有分布，如细菌、放线菌、真菌中都可分泌胞外蛋白酶。自Mandl 和Cohen 首次分离到了产弹性蛋白酶的微生物Flavobacterivm elastolyticium 以来，相继发现假单孢菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)
、链球菌属(Staphylococcus)、短杆菌属(Brevibacterium) 、芽孢杆菌属都有产酶的能力。在食品工业，因其在不同种类蛋白质存在的情况下，对不溶性的弹性蛋白具有较高的水解活性，故在肉类加工中，弹性蛋白酶可以用于肉的嫩化处理，使肉类的品质变得柔软、多汁和易于咀嚼，并可缩短肉的烹调时间、改善肉的风味、增加其营养价值。在生物防治中，弹性蛋白酶能降解昆虫坚硬的表皮结构蛋白，再侵入昆虫体内。在医药领域，弹性蛋白酶主要作为治疗高血脂症、防止动脉粥样硬化的生化药物。目前我国生产弹性蛋白酶产品的方法是从猪胰脏提取，但脏器资源不足，限制了弹性蛋白酶的应用，由于微生物弹性蛋白酶与猪胰脏弹性蛋白酶一样, 具有广泛的水解活性, 不但能降解弹性硬蛋白，而且对明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都有降解作用, 是一种广谱的肽链内切酶。但现有公知的用于产酶菌株的方法还存在不易培养、生产安全性不高和遗传稳定性差等不足。如何克服现有技术的不足已成为当今生物工程技术领域中亟待解决的重点难题之一。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其筛选方法，本发明的产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株容易培养，生产安全性高，遗传稳定性好，其代谢产物弹性蛋白酶容易分离纯化，且其代谢产物弹性蛋白酶的酶活较高。
根据本发明提出的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4的分类命名为地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年2月10日，保藏号为：CGMCC No. 5700；
所述菌株ELAT4（CGMCC
No. 5700）具有以下特性：
(1)菌落形态：菌落呈灰白色，较粘稠、易挑起，表面湿润；
(2)菌体形态：菌体产耐热芽孢，孢囊不膨大，革兰氏染色阳性，显微镜下呈单个菌体，直杆状，两端钝圆，芽孢椭圆中生；
(3)生长条件：最低温度18℃，最高温度55℃，最适生长温度34～37℃；
(4)生理生化特征：V.P试验阳性，吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，硝酸盐还原阳性，过氧化氢酶试验阳性，明胶液化阳性，淀粉水解阳性，酪素水解阳性。
经16S rDNA 序列比对以及系统发育分析：本发明的菌株ELAT4的16S rDNA经克隆测序，核苷酸序列大小为1421bp，利用ClustalX1.8软件采用Neighbour-joining方法构建系统发育树，菌株ELAT4的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis（EF173323）的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(max ident)达到99%；综合ELAT4菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株ELAT4鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
根据本发明提出的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤：
步骤一，土样采样：土样取自牛羊屠宰场的受污染物；
步骤二，菌株富集培养：称取土样2g，放入盛有100ml无菌水的锥形瓶中，摇床上160r/min震荡30min，取3-4ml浑浊液接入富集培养基，条件37℃、160r/min、振荡培养3d，其中：富集培养基（g/v）为：1%弹性蛋白、0.1%KH2PO4、0.2%NaNO3、0.05%KCL、0.1%NH4Cl和0.01%MgSO4·7H2O以及每100mL培养基中加入0.1mL浓缩微量元素，条件pH7.5、121℃、灭菌20min；其中：浓缩微量元素：2g/L CaCl2、0.1g/L MnSO4·4H2O、0.6g/LFeSO4·7H2O、0.4g/LZnSO4·7H2O、2g/LCoCl2·6H2O和1g/L NaCl；
步骤三，菌株初筛：采用平板稀释分离法，取0.2ml富集培养样品涂布于固体牛肉膏蛋白胨平板上，培养48h后，将平板上长出的单菌落再点接于弹性蛋白初筛分离培养基上，37℃培养48-72d，挑选水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌落径之比值较大的菌株；其中：弹性蛋白初筛分离培养基为：0.5g弹性蛋白、0.1g酵母膏、0.1g葡萄糖、0.1g K2HPO4、0.05g
KH2PO4、0.01g MgSO4·7H2O、蒸馏水100ml和1.5g琼脂粉，在 pH7.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌15min；
步骤四，菌株分离纯化：将初筛出来的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，再置于34-37℃恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；
步骤五、菌株复筛：初筛得到的菌株经斜面活化后接种于装有种子培养基的摇瓶中，培养基装液量30mL/250mL三角瓶，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，培养16-24h后将培养好的菌液按2-8%的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中，三角瓶容量250mL，装量20-40mL，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，发酵时间48-72h。
本发明与现有技术相比其显著优点在于：一是筛选得到的地衣芽孢杆菌能够产弹性蛋白酶,该菌株容易培养，生产安全性高，遗传稳定性较好，其代谢产物弹性蛋白酶容易分离纯化，且其代谢产物弹性蛋白酶的酶活较高，平均酶活为187U/mL、最高酶活为211U/ml，具有很高的应用价值。二是本发明提供的筛选方法简单可靠、效果显著，发酵48-72h，菌株产弹性蛋白酶达到最高水平，为211U/mL，且采用本发明所述筛选方法可从受蛋白质污染的的样品中筛选出产弹性蛋白酶的菌株，筛选得到的菌株可在本发明的检测平板上得到快速有效的检测。
附图说明
图1是本发明所述的弹性蛋白酶平板初筛结果示意图。
图2 是本发明所述的酶活复筛检测结果示意图。
图3 是本发明所述的菌株ELAT4依据16S rDNA序列建立的遗传进化树示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。
实施例1，本发明提出的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法的实施过程如下：
步骤一、土样采集：在牛羊屠宰场长期堆积牛肉、牛血管、气管的地方以及下水道中取样，或者挑选那些被微生物污染而造成降解腐败的牛动脉血管污染物，用灭过菌的镊子或药勺取污染物，放入无菌的空三角瓶中，塞上棉花塞备用；
步骤二、菌株富集培养：称取采集的样品2g，放入盛有100ml无菌水的锥形瓶中，摇床上160r/min震荡30min，取3-4ml浑浊液接入装有30ml富集培养基的250ml三角瓶中，37℃、160r/min振荡培养3-5d；其中，富集培养基（g/v）为：1%弹性蛋白、0.1%KH2PO4、0.2%NaNO3、0.05%KCL、0.1%NH4Cl、0.01%MgSO4·7H2O，每100mL培养基中加入0.1mL浓缩微量元素，在pH7.5、121℃条件下灭菌 20 min；其中：浓缩微量元素为：2g/L CaCl2、0.1g/L MnSO4·4H2O、0.6g/L FeSO4·7H2O、0.4g/L ZnSO4·7H2O、2g/L CoCl2·6H2O、1g/L NaCl；
步骤三、菌株初筛：取富集后的培养液按照10倍梯度稀释至10-5，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度的稀释液0.2mL涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，34-37℃倒置培养48h；将平板上长出的单菌落再点接于弹性蛋白初筛分离培养基上，32-37℃培养48-72d，观察菌落大小和菌落周围水解圈的大小，以菌株水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌落径之比值为筛选依据，选取二者比值较大的菌株进一步复筛，初筛平板如图1所示；弹性蛋白初筛分离培养基为：0.5g弹性蛋白、0.1g酵母膏、0.1g葡萄糖、0.1g K2HPO4、0.05g
KH2PO4、0.01g MgSO4·7H2O、蒸馏水100ml和1.5g琼脂粉，在 pH7.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌15min；
步骤四，菌株分离纯化：将初筛出来的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，再置于34-37℃恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；
步骤五、菌株复筛：初筛得到的菌株经斜面活化后接种于装有种子培养基的摇瓶中，培养基装液量30mL/250mL三角瓶，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，培养16-24h后将培养好的菌液按2-8%的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中，三角瓶容量250mL，装量20-40mL，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，发酵时间48-72h。
以上所述的步骤一至步骤五中部分条件的优选实施方案如下：
复筛酶活性检测：上述制备好的发酵液12000r/min，离心5min，保留上清液，液体酶活测得为175-211U/ml；
酶活性检测平板制备：弹性蛋白0.3g，琼脂粉1.5g，0.02mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5) 100ml，加热煮沸至琼脂熔化，冷却至45-50℃时，充分摇动三角瓶使不溶性弹性蛋白混合均匀，然后倒平板，培养基凝固后，用直径6mm的打孔器在平板上打孔，取150μl离心后的发酵液上清加到孔中，37℃静置8-15h，查看水解圈大小情况，复筛检测平板如图2所示；
种子培养基的制备：0.4g牛肉膏、0.8g蛋白胨、0.1g酵母粉、0.5g葡萄糖、0.5g NaCl、0.1g KH2PO4、0.04g MgSO4·7H2O和100ml蒸馏水，在 pH7.0-8.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌20min；
发酵培养基的制备：0.5g葡萄糖、0.4g弹性蛋白、1g干酪素、0.4g蛋白胨、0.5酵母粉、0.5g NaCl、0.1g KH2PO4、0.04g MgSO4·7H2O和100ml蒸馏水，在 pH7.0-8.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌20min。
实施例2：本发明提出的筛选用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的形态特征的实施过程如下：
用本发明的弹性蛋白酶筛选方法，筛选到一株高产菌株，菌落在普通牛肉膏蛋白胨培养基上，菌落呈灰白色，菌体产耐热芽孢，孢囊不膨大，革兰氏染色阳性，显微镜下呈单个菌体，直杆状，两端钝圆，芽孢椭圆中生，具运动性，菌落较粘稠、易挑起，表面湿润；菌株ELAT4具体的形态学及生理生化特征见表1；菌落、染色特征和生理生化特征与《伯杰细菌鉴手册》（第八版）中的地衣芽孢杆菌比较接近，初步确定菌株ELAT4为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
实施例3：本发明所述用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的生理生化特征的实施过程如下：
本发明的菌株ELAT4形态学及生理生化特性详见表1。
表1 菌株ELAT4形态学及生理生化特性
| 特性 | 结果 | 特性 | 结果 |
| 形态学 | 培养特性 | ||
| 大小 | 0.7µm×2.7µm | 生长温度 | |
| 革兰氏染色 | + | 最低温度 | 18℃ |
| 运动性 | + | 最高温度 | 55℃ |
| 孢子囊 | + | 水解实验 | |
| 芽孢 | + | 明胶 | + |
| 生化特性 | 淀粉 | + | |
| 产H2S | － | 酪素 | + |
| pH5.7生长 | + | 糖利用情况 | |
| V.P试验 | + | D-葡萄糖 | + |
| 吲哚试验 | － | 甘露醇 | + |
| 甲基红试验 | + | 乳糖 | － |
| 硝酸盐还原 | + | 蔗糖 | + |
| 过氧化氢酶试验 | + | 木糖 | + |
| 5% NaCl生长 | + | 柠檬酸利用 | + |
| 7%NaCl生长 | + | 丙酸盐利用 | + |
备注:表中“+ ”表示反应为阳性；“－”反应为阴性。
实施例4：本发明所述的用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株16S rDNA序列分析的实施过程如下：
依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物，其中正向引物为F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系20µL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物是1条大小约1.4kb的特异性条带。扩增获得的序列经测序，菌株ELAT4的16S rDNA核苷酸序列大小为1421bp，将序列同GenBank数据库中17个菌株的16S rDNA核苷酸序列进行比较，采用ClustalⅩ1.81软件和MEGA 4软件对菌株的测序结果进行了系统发育分析，采用Neighbour-joining方法构建系统发育树，并进行Bootstrap分析，重复次数为1000次。构建的系统发育树如图3。结果显示菌株ELAT4的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(登记号EF173323)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(max ident)达到99%。综合ELAT4菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株ELAT4鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
将分离纯化的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年2月10日，保藏号为：CGMCC
5700。
实施例5：本发明所述的用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的产酶活性检测的实施过程如下：
复筛菌株液体发酵活性初步检测：发酵液12000r/min，离心5min，保留上清液。酶活性检测平板制备：弹性蛋白0.3g，琼脂粉1.5g，0.02mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.0)
100ml，加热煮沸至琼脂熔化，冷却至45-50℃时，充分摇动三角瓶使不溶性弹性蛋白混合均匀，然后倒平板。培养基凝固后，用直径6mm的打孔器在平板上打孔，取150μl离心后的发酵液上清加到孔中，37℃静置12h。查看水解圈大小情况。若有清晰的透明水解圈出现，则表明该菌株产生弹性蛋白酶。水解圈越大说明酶活性越高。
经过第一轮通过打孔法检测水解圈较大的菌株，进一步定量测定酶活性。该法以与染料偶联的不溶性底物经酶作用而溶解至水相，反应上清液的光密度反应底物被酶消化的程度，称取20mg刚果红-弹性蛋白溶于1mL水中，加入1mL、pH8.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液，取1mL稀释后的酶液于25℃下振荡反应20min，加入pH6.0、0.7mol/L的磷酸钠缓冲液2mL，终止反应，离心后取上清液测495nm处的光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白，在此反应条件下溶解1mg刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位（U）。通过该方法测得的酶活为175-211U/ml。
本发明经反复试验验证，取得了满意的应用效果。
Claims (5)
1.一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4的分类命名为地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年2月10日，保藏号为：CGMCC
No. 5700。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4（CGMCC No.
5700）具有以下特性：
(1)菌落形态：菌落呈灰白色，较粘稠、易挑起，表面湿润；
(2)菌体形态：菌体产耐热芽孢，孢囊不膨大，革兰氏染色阳性，显微镜下呈单个菌体，直杆状，两端钝圆，芽孢椭圆中生；
(3)生长条件：最低温度18℃，最高温度55℃，最适生长温度34-37℃；
(4)生理生化特性：V.P试验阳性，吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，硝酸盐还原阳性，过氧化氢酶试验阳性，明胶液化阳性，淀粉水解阳性，酪素水解阳性。
3.基于权利要求1所述的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下具体步骤
：
步骤一，土样采样：土样取自牛羊屠宰场的受污染物；
步骤二，菌株富集培养：称取土样2g，放入盛有100ml无菌水的锥形瓶中，摇床上160r/min震荡30min，取3-4ml浑浊液接入富集培养基，条件37℃、160r/min、振荡培养3d，其中：
富集培养基（g/v）为：1%弹性蛋白、0.1%KH2PO4、0.2%NaNO3、0.05%KCL、0.1%NH4Cl和0.01%MgSO4·7H2O，每100mL培养基中加入0.1mL浓缩微量元素，在pH7.5、温度121℃条件下灭菌20 min；其中：浓缩微量元素为：2g/L
CaCl2、0.1g/L MnSO4·4H2O、0.6g/L FeSO4·7H2O、0.4g/L ZnSO4·7H2O、2g/L CoCl2·6H2O和1g/L NaCl；
步骤三，菌株初筛：采用平板稀释分离法，取0.2ml富集培养样品涂布于固体牛肉膏蛋白胨平板上平板上，培养48h后，将平板上长出的单菌落再点接于弹性蛋白初筛分离培养基上，37℃培养48-72d，挑选水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌落径之比值较大的菌株；其中：弹性蛋白初筛分离培养基为：0.5g弹性蛋白、0.1g酵母膏、0.1g葡萄糖、0.1g K2HPO4、0.05g KH2PO4、0.01g MgSO4·7H2O、蒸馏水100ml和1.5g琼脂粉，在 pH7.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌15min；
步骤四，菌株分离纯化：将初筛出来的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，再置于34-37℃恒温培养箱中培养48h，重复划线培养三次以上，连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化；
步骤五、菌株复筛：初筛得到的菌株经斜面活化后接种于装有种子培养基的摇瓶中，培养基装液量30mL/250mL三角瓶，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，培养16-24h后将培养好的菌液按2-8%的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中，三角瓶容量250mL，装量20-40mL，培养温度34-37℃，摇床转速160-180r/min，发酵时间48-72h。
4.根据权利要求3所述的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于步骤五所述的种子培养基为：0.4g牛肉膏、0.8g蛋白胨、0.1g酵母粉、0.5g葡萄糖、0.5g NaCl、0.1g KH2PO4、0.04g MgSO4·7H2O和100ml蒸馏水，在 pH7.0-8.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌20min。
5.根据权利要求3或4所述的一种用于产弹性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于步骤五所述的发酵培养基为：0.5g葡萄糖、0.4g弹性蛋白、1g干酪素、0.4g蛋白胨、0.5g酵母粉、0.5g NaCl、0.1g KH2PO4、0.04g MgSO4·7H2O和蒸馏水100ml，在 pH7.0、温度121℃的条件下蒸汽灭菌20min。
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