CN111893070A - 一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，首选从荷斯坦奶牛瘤胃液中培养筛选出革兰氏阳性杆菌，然后通过高温成活率检测、基因测序以及糖发酵试验确定革兰氏阳性杆菌即为地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌可在纤维二糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素为唯一碳源的固体培养基上生长，具有纤维降解活性，对于反刍动物纤维素物质降解具有促进作用，可以作为动物饲料的添加剂，能提升反刍动物营养物质的吸收利用效率，可以减少抗生素的使用，提升动物的生产性能。

Description

一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法
技术领域
本申请涉及农业微生物学技术领域，尤其涉及一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法。
背景技术
抗生素替代是目前饲料添加剂产业研究的热点问题。无残留、无污染的益生菌作为抗生素的替代品之一，潜力巨大。其中地衣芽胞杆菌作为益生菌的一种，在调节肠道微生态功能、促进有益菌群增值、提高机体免疫功能等方面具有重要作用。
益生菌的应用以往主要集中在单胃动物和家禽上，随着研究不断深入，发现其对反刍动物瘤胃菌群结构具有独特的作用，尤其幼龄反刍动物。厌氧菌是反刍动物胃肠道微生物菌群中优势菌，对动物机体营养物质的消化、吸收及动物机体健康具有重要作用。地衣芽胞杆菌具有生物夺氧功能，可通过消耗胃肠道的氧而促进厌氧菌的增殖；可分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶类，促进机体对营养物质的消化吸收，从而提高动物体对饲料的利用率。这对于幼龄反刍动物瘤胃发育及菌群结构的快速构建具有积极作用，是保证成年反刍动物瘤胃功能发挥的重要基础。另外，地衣芽胞杆菌作为益生菌添加剂，对成年反刍动物同样具备菌群调节及分泌多种高活性酶的功能。
可见，地衣芽胞杆菌在反刍动物上的应用具有巨大潜力，对来源于反刍动物本身的地衣芽孢杆菌进行筛选应用更具有重要的理论与现实意义。
发明内容
本申请提供了一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，为反刍动物提供更安全高效的饲料添加剂，对反刍动物瘤胃微生物区系的稳定及纤维素降解发挥积极作用，通过安全有效的饲料添加剂提升反刍动物营养物质的吸收利用效率提供科学支撑，同时对于抗生素的减少使用，动物生产性能的提升，环境友好健康发展提供技术支撑。
为解决上述技术问题，本申请提供了一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，包括：
预先配置500ml的富集培养基，并将所述富集培养基、试管架以及洗干净的亨氏滚管于121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台；
采样当天在500ml的塑料瓶中充满CO2，并将采集的500ml瘘管荷斯坦奶牛瘤胃液置于所述塑料瓶中，并将盛满瘤胃液的塑料瓶置于保温箱中恒温带回实验室；
将所述富集培养基分装到所述亨氏滚管中，并使每管中的富集培养基占管容积的1/3，封好瓶盖和瓶塞，使用1ml无菌注射器接种1ml所述瘤胃液于所述亨氏滚管内，混匀后置于细菌培养箱，并在37℃条件下进行培养；
配置500ml的分离筛选培养基，在121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台，并待温度在55℃-65℃时，分装在一次性培养皿中，每个培养皿倒25ml-35ml，待培养基温度降至室温并凝固；
将富集培养后的菌液摇晃均匀，使用一次性无菌接种环接种所述菌液至所述分离筛选培养基，将接种好的分离筛选培养基使用封口膜进行封口，在细菌培养箱37℃条件下进行培养；
在无菌操作台内对培养后的细菌菌落采用刚果红染液进行染色，将具有透明圈的菌落再次接种到准备好的另一个分离筛选培养基上，在37℃条件下培养48小时，再采用革兰氏对细菌菌落进行染色，如此反复直至细菌菌落的菌体颜色、形态一致后将菌种进行保存；
选取表面粗糙皱褶、边缘不整齐的污白色菌落做纯化培养，对纯化培养后的纯培养物经革兰氏染色进行形态学观察以初步筛选出革兰氏阳性杆菌；
对所述革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测、基因测序以及糖发酵试验以确定所述革兰氏阳性杆菌为地衣芽孢杆菌，并对所述革兰氏阳性杆菌进行保存。
优选地，所述富集培养基包括纤维二糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、酵母膏、蛋白胨以及蒸馏水。
优选地，所述分离筛选培养基包括羧甲基纤维素钠、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、硝酸钠、琼脂以及蒸馏水。
优选地，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测为：
在菌株接种到纯化培养基，并在80℃条件下培养两个小时后，判断菌株是否成活。
优选地，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行糖发酵试验具体为：
将纯化培养后的菌株接种到糖发酵试剂盒，在37℃条件下培养，判断糖发酵试剂盒的颜色是否发生变化。
优选地，在初步筛选出所述革兰氏阳性杆菌之后，还包括：
对所述革兰氏阳性杆菌的抗性基因检测进行检测。
优选地，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行保存具体为：
用无菌注射器将所述革兰氏阳性杆菌接种到分装有1/3富集培养基的亨氏滚官中，37℃条件下培养24h后，按照菌液与60％甘油2:1的比例装入无菌无酶冻存管中，将冻存管用封口膜进行封口，在-20℃条件下冻存24h后放入-80℃条件下进行保存。
本申请所提供的一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，首选从荷斯坦奶牛瘤胃液中培养筛选出革兰氏阳性杆菌，然后通过高温成活率检测、基因测序以及糖发酵试验确定革兰氏阳性杆菌即为地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌可在纤维二糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素为唯一碳源的固体培养基上生长，具有纤维降解活性，对于反刍动物纤维素物质降解具有促进作用，可以作为动物饲料的添加剂，能提升反刍动物营养物质的吸收利用效率，可以减少抗生素的使用，提升动物的生产性能。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。
本申请的核心是提供一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，为反刍动物提供更安全高效的饲料添加剂，对反刍动物瘤胃微生物区系的稳定及纤维素降解发挥积极作用，通过安全有效的饲料添加剂提升反刍动物营养物质的吸收利用效率提供科学支撑，同时对于抗生素的减少使用，动物生产性能的提升，环境友好健康发展提供技术支撑。
一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，包括以下步骤：
步骤一，预先配置500ml的富集培养基，并将富集培养基、试管架以及洗干净的亨氏滚管于121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台，备用。
优选地，富集培养基包括纤维二糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、酵母膏、蛋白胨以及蒸馏水，表1为富集培养基的组分及含量。
表1富集培养基(500ml)
组分 含量(g)
纤维二糖 1.0
磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 0.5
七水硫酸镁(MgSO4·7H20) 0.5
硫酸锰(MnSO4) 0.025
酵母膏 5.0
蛋白胨 5.0
蒸馏水 补齐至500ml
步骤二，采样当天在500ml的塑料瓶中充满CO2，并将采集的500ml瘘管荷斯坦奶牛瘤胃液置于塑料瓶中，并将盛满瘤胃液的塑料瓶置于保温箱中恒温带回实验室。
步骤三，将富集培养基分装到亨氏滚管中，并使每管中的富集培养基占管容积的1/3，封好瓶盖和瓶塞，使用1ml无菌注射器接种1ml瘤胃液于亨氏滚管内，混匀后置于细菌培养箱，并在37℃条件下进行培养。37℃条件下培养的时间为24小时。
步骤四，配置500ml的分离筛选培养基，在121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台，并待温度在55℃-65℃时，分装在一次性培养皿中，每个培养皿倒25ml-35ml，待培养基温度降至室温并凝固。在实际操作时，在温度为60℃时，分装在一次性培养皿中，并在每个培养皿倒30ml。
优选地，分离筛选培养基包括羧甲基纤维素钠、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、硝酸钠、琼脂以及蒸馏水。表2为分离筛选培养基的组分及含量。
表2分离筛选培养基(500mL)
组分 含量(g)
羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 2.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 0.5
无水硫酸镁(MgSO4) 0.25
硝酸钠(NaNO3) 1.5
琼脂 8.5
蒸馏水 补至500mL
步骤五，将富集培养后的菌液摇晃均匀，使用一次性无菌接种环接种菌液至分离筛选培养基，将接种好的分离筛选培养基使用封口膜进行封口，在细菌培养箱37℃条件下进行培养。具体地，每份菌液接种重复3个，并留3个凝固好的分离筛选培养基作为空白对照，将接种好的培养基及空白对照培养基使用封口膜进行封口，在37℃条件下在细菌培养箱培养48小时。
步骤六，在无菌操作台内对培养后的细菌菌落采用刚果红染液进行染色，将具有透明圈的菌落再次接种到准备好的另一个分离筛选培养基上，在37℃条件下培养48小时，再采用革兰氏对细菌菌落进行染色，如此反复直至细菌菌落的菌体颜色、形态一致后将菌种进行保存。另一个分离筛选培养基是指步骤四中配置的分离筛选培养基，并且是没有用过的。
步骤七，选取表面粗糙皱褶、边缘不整齐的污白色菌落做纯化培养，对纯化培养后的纯培养物经革兰氏染色进行形态学观察以初步筛选出革兰氏阳性杆菌。纯化培养培养基是将分离筛选培养基中的碳源换为纤维二糖，也就是将羧甲基纤维素钠(CMC-Na)换为纤维二糖，其他组分不变。革兰氏阳性杆菌呈长杆状，单个、成对或链状排列。
步骤八，对革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测、基因测序以及糖发酵试验以确定革兰氏阳性杆菌为地衣芽孢杆菌，并对革兰氏阳性杆菌进行保存。基因测序后将测序结果在NCBI数据库进行比对，显示筛选出的革兰氏阳性杆菌与地衣芽孢杆菌的人相似度达98.59％。
优选地，对革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测为：
在菌株接种到纯化培养基，并在80℃条件下培养两个小时后，判断菌株是否成活。
对革兰氏阳性杆菌进行糖发酵试验具体为：
将纯化培养后的菌株接种到糖发酵试剂盒，在37℃条件下培养，判断糖发酵试剂盒的颜色是否发生变化。具体为，购买HiBio-ID糖发酵试剂盒，试剂盒含35项糖发酵检查，其中A盒和B盒各含12项糖发酵试验，C盒含11项糖发酵试验和1个对照试验，将纯化培养后的菌株接种到对应的试剂盒中，并在37℃条件下培养两个小时后，通过微生物发酵反应，判断相应试剂盒的颜色是否发生变化，如果变化就说明菌株可以在相应的糖发酵试剂盒中生长，如果没有变化就说明菌株不能在相应的糖发酵试剂盒中生长，结合常见细菌手册和伯杰氏细菌手册初步鉴定为地衣芽孢杆菌。
在实际实验操作时，还需要对革兰氏阳性杆菌的纤维素降解活性进行检测，具体就是将分离筛选培养基中的碳源换为微晶纤维素，也就是将羧甲基纤维素钠(CMC-Na)换为微晶纤维素，使用一次性接种环划线接种，37℃条件下培养48小时后，判断菌体是否继续生长，实验证明菌体生长良好，具有纤维素降解活性。也就是革兰氏阳性杆菌对于纤维二糖，羧甲基纤维素钠，微晶纤维素，三种不同形式的纤维素降解均可以起作用，能对反刍动物瘤胃内纤维物质进行降解。
进而进一步确定革兰氏阳性杆菌就是地衣芽孢杆菌，作为优选地实施方式，在初步筛选出革兰氏阳性杆菌之后，还包括：
对革兰氏阳性杆菌的抗性基因检测进行检测，即对筛选地衣芽孢杆菌的抗性基因进行检测。对菌株进行原核转录组测序，对菌株抗性基因含量进行测定，经测定菌株抗性基因有19种，但含量均很低，且除前4种外，其余抗性基因与本菌株基因序列相似度均小于50％。菌株涉及的抗性基因包括大肠杆菌EF-Tu突变体对基罗霉素产生抗性、枯草芽孢杆菌的mprF、BcI、屎肠球菌的adeC，利福平磷酸转移酶、cat，结核分枝杆菌的murA、抗氨基香豆素的alaS、lmrB、屎肠球菌对达托霉素耐药、mphE、mecA、blaR1、desR、双歧杆菌对莫匹罗星产生抗药性、salA、sav1866、对利福平耐药的金黄色葡萄球菌rpoB突变株、TriC。
与抗生素自身抗药性有关的基因、产生抗生素耐药性的外排泵、抗生素耐药基因变异或突变，脂肽类抗生素耐药基因、elfamycin耐药基因、抗生素耐药、抗生素靶基因或内酰胺类耐药、抗生素靶保护蛋白、氟喹诺酮耐药基因、大环内酯类耐药基因、磷霉素抗性基因、利福平耐药基因、耐药基因变异或突变。
表三 革兰氏阳性杆菌(地衣芽孢杆菌)抗性基因种类
Figure BDA0002628979420000071
Figure BDA0002628979420000081
Figure BDA0002628979420000091
优选地，对革兰氏阳性杆菌进行保存具体为：
用无菌注射器将革兰氏阳性杆菌接种到分装有1/3富集培养基的亨氏滚官中，37℃条件下培养24h后，按照菌液与60％甘油2:1的比例装入无菌无酶冻存管中，将冻存管用封口膜进行封口，在-20℃条件下冻存24h后放入-80℃条件下进行保存。
当需要对菌株进行复状时：就将冻存的菌株置于室温，待融化后用无菌注射器接种到装有富集培养基的亨氏滚官内，培养24小时后，使用一次性无菌接种环接种到纯化培养基，37℃培养48小时。复壮，指对已衰退的菌种(群体)进行纯种分离和选择性培养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重新成为纯种群体的措施。狭义的复壮是一消极措施，一般指对已衰退的菌种进行复壮；广义的复壮是一积极的措施，即在菌种的生产性状未衰退前就不断进行纯种分离和生产性状测定，以在群体中获得生产性状更好的自发突变株。菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定比例后，所表现出群体性能变差的现象。因此，在已经退化的群体中，仍然有一定数量尚未退化的个体。
本申请所提供的一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，首选从荷斯坦奶牛瘤胃液中培养筛选出革兰氏阳性杆菌，然后通过高温成活率检测、基因测序和纤维素降解活性检测确定革兰氏阳性杆菌即为地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌可在纤维二糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素为唯一碳源的固体培养基上生长，具有纤维降解活性，对于反刍动物纤维素物质降解具有促进作用，可以作为动物饲料的添加剂，能提升反刍动物营养物质的吸收利用效率，可以减少抗生素的使用，提升动物的生产性能。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其他实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包含本申请公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为实例性的，本申请的真正范围由权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。

Claims (7)

1.一种荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，包括：
预先配置500ml的富集培养基，并将所述富集培养基、试管架以及洗干净的亨氏滚管于121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台；
采样当天在500ml的塑料瓶中充满CO2，并将采集的500ml瘘管荷斯坦奶牛瘤胃液置于所述塑料瓶中，并将盛满瘤胃液的塑料瓶置于保温箱中恒温带回实验室；
将所述富集培养基分装到所述亨氏滚管中，并使每管中的富集培养基占管容积的1/3，封好瓶盖和瓶塞，使用1ml无菌注射器接种1ml所述瘤胃液于所述亨氏滚管内，混匀后置于细菌培养箱，并在37℃条件下进行培养；
配置500ml的分离筛选培养基，在121℃高压下灭菌15min后置于无菌操作台，并待温度在55℃-65℃时，分装在一次性培养皿中，每个培养皿倒25ml-35ml，待培养基温度降至室温并凝固；
将富集培养后的菌液摇晃均匀，使用一次性无菌接种环接种所述菌液至所述分离筛选培养基，将接种好的分离筛选培养基使用封口膜进行封口，在细菌培养箱37℃条件下进行培养；
在无菌操作台内对培养后的细菌菌落采用刚果红染液进行染色，将具有透明圈的菌落再次接种到准备好的另一个分离筛选培养基上，在37℃条件下培养48小时，再采用革兰氏对细菌菌落进行染色，如此反复直至细菌菌落的菌体颜色、形态一致后将菌种进行保存；
选取表面粗糙皱褶、边缘不整齐的污白色菌落做纯化培养，对纯化培养后的纯培养物经革兰氏染色进行形态学观察以初步筛选出革兰氏阳性杆菌；
对所述革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测、基因测序以及糖发酵试验以确定所述革兰氏阳性杆菌为地衣芽孢杆菌，并对所述革兰氏阳性杆菌进行保存。
2.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，所述富集培养基包括纤维二糖、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸锰、酵母膏、蛋白胨以及蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，所述分离筛选培养基包括羧甲基纤维素钠、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、硝酸钠、琼脂以及蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行高温成活率检测为：
在菌株接种到纯化培养基，并在80℃条件下培养两个小时后，判断菌株是否成活。
5.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行糖发酵试验具体为：
将纯化培养后的菌株接种到糖发酵试剂盒，在37℃条件下培养，判断糖发酵试剂盒的颜色是否发生变化。
6.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，在初步筛选出所述革兰氏阳性杆菌之后，还包括：
对所述革兰氏阳性杆菌的抗性基因检测进行检测。
7.根据权利要求1所述的荷斯坦奶牛瘤胃地衣芽孢杆菌的培养筛选方法，其特征在于，所述对所述革兰氏阳性杆菌进行保存具体为：
用无菌注射器将所述革兰氏阳性杆菌接种到分装有1/3富集培养基的亨氏滚官中，37℃条件下培养24h后，按照菌液与60％甘油2:1的比例装入无菌无酶冻存管中，将冻存管用封口膜进行封口，在-20℃条件下冻存24h后放入-80℃条件下进行保存。
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