WO2019027073A1 - 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제, 상기 첨가제를 포함하는 사료 조성물 및 상기 사료첨가제의 제조 방법 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제, 상기 첨가제를 포함하는 사료 조성물 및 상기 사료첨가제의 제조 방법 Download PDF

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김유진
박민아
우서형
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씨제이제일제당(주)
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    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Definitions

  • the present application relates to a feed additive comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis, a feed composition comprising the additive and a process for preparing the feed additive.
  • Ruminants such as cows contain about 20% of the feed for cattle and about 60% for dairy cattle.
  • the ingested feed is decomposed by the microorganisms in the first rumen, and the nutrients and energy Is absorbed.
  • ruminants consume many parts of the rumen, such as protein, energy, fatty acids, minerals and vitamins that are required by microbes and animal tissues in the rumen.
  • Forage is fed to animals in the form of raw, hay or silage, contains 20 to 30% or more crude fiber in dry state, and is composed of hemicellulose, lignin and cellulose, which are relatively difficult to decompose.
  • One object of the present application is to provide a feed additive which is useful for milk improvement including Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis, and which is also useful for increasing the flow rate.
  • Another object of the present application is to provide a feed composition
  • a feed composition comprising a feed additive comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis as described herein.
  • One aspect of the present invention relates to a feed additive for milk fat and milk, comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis.
  • Bacillus subtilis may be used herein as long as it is capable of degrading fibrin and the like by producing digestive enzymes such as cellulase and / or mannanase.
  • Bacillus subtilis mainly lives in soil, doenjang, or kochujang, is gram-positive, and aerobic bacillus.
  • Bacillus subtilis include Bacillus subtilis CJBS62 and Bacillus subtilis CJBS16.
  • Bacillus subtilis CJBS62 can be used.
  • Bacillus subtilis CJBS62 was deposited with KCCM (Korea Microorganism Conservation Center: KCCM12039P) on June 22, 2017 in the name of KCCM12039P in the name of KCCM12039P.
  • the base sequence (5 '- > 3') of the 16s ribosomal DNA of the Bacillus subtilis CJBS62 strain is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Bacillus ricinifomis can be used herein as long as it can decompose lactic acid to synthesize acetic acid.
  • the acetate conversion rate relative to the initial lactic acid content of the Bacillus ricinifomice is 30% to 70%, specifically 50% to 65% Or the acetate conversion rate of the Bacillus ricinifomice to lactic acid consumption may be 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more.
  • the conversion rate to the initial lactic acid amount can be determined by the following formula 1, and the conversion rate of acetate to lactic acid consumption can be expressed by the following formula 2:
  • the Bacillus ricinifomis may further be a strain capable of producing a cellulase and / or mannanase.
  • Bacillus ricinifomis mainly lives in miso or kochujang, is gram-positive, and aerobic bacillus.
  • Bacillus licheniformis include Bacillus licheniformis CJBL215 and Bacillus licheniformis CJBL219.
  • Bacillus licheniformis CJBL219 can be used.
  • Bacillus ricinifomis CJBL215 and Bacillus ricinifomis CJBL219 were deposited on KCCM12040P and KCCM12041P on June 22, 2017, respectively, in KCCM (Korea Microorganism Conservation Center: Haejil Bldg. 45, Seodaemun- Was deposited.
  • the base sequence (5 '- >3') of the 16s ribosomal DNA of Bacillus licheniformis CJBL215 and Bacillus ricinifomice CJBL219 are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
  • Feed additives including Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis, according to the present application can stabilize the ruminal pH of a ruminant and increase the feed digestibility of a ruminant.
  • the feed additive is effective not only in improving the milking chamber in milk produced by milking wool, but also in efficiently increasing the flow rate produced.
  • Bacillus subtilis and bacillus ricinifomis per gram of feed additive may each independently include 1 x 10 7 cfu or more, specifically 1 x 10 8 cfu or more, more specifically 1 x 10 9 cfu or more. With this concentration, it is possible to provide a feed additive that effectively decomposes fibrin and is effective in increasing the milk fat.
  • the amount of the feed additive to be used may be 0.1 g to 1 kg / day / day, specifically 5 g to 900 g / day / day, more specifically 10 g to 800 g / day / day.
  • the weight ratio of Bacillus subtilis to Bacillus ricinifomis is 1: 9 to 9: 1, specifically 2: 8 to 8: 2, specifically 3: 7 to 7: 3, more particularly 1: 2 to 2 It can be 1 day.
  • the feed additive may be in the form of a liquid or solid, and in the case of a liquid, Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis may be present in the form of cells of Bacillus subtilis, cells of Bacillus ricinifomis, a culture thereof, or a concentrate thereof.
  • Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis may be present in the form of cells of Bacillus subtilis, cells of Bacillus ricinifomis, a culture thereof, or a concentrate thereof.
  • a solid phase it may include a cell of Bacillus subtilis, a cell of Bacillus ricinifomis, a culture thereof, or a concentrate thereof, and may be a powder, a tablet, a pellet , Granules, coatings, and the like.
  • feed additive content in the feed composition may be in the range of 0.1% to 50% by weight, specifically 0.1% to 40% by weight, more specifically 1% to 20% by weight, based on the weight of the feed composition have.
  • the feed composition may further include an optional component such as a component effective for promoting growth of an animal, a nutritional component, a nutritional supplement component, a component for enhancing storage stability, and a coating component.
  • the feed composition may contain other probiotics; Enzymes such as amylase and lipase; Vitamins such as L-ascorbic acid, choline chloride, and inositol; Minerals such as potassium chloride, iron citrate, magnesium oxide and phosphates; Amino acids such as lysine, alanine, and methionine; Organic acids such as fumaric acid, butyric acid, and lactic acid or salts thereof; Antioxidants such as vitamin C and vitamin E, fungicides such as calcium propionate; Emulsifiers such as lecithin and glycerin fatty acid esters; Pigment, and the like.
  • the feed can be animal feed, specifically a ruminant feed, and examples of ruminants include, but are not limited to, cattle, buffalo, goat, sheep, goat or deer.
  • the amount of feed to be ingested can be appropriately controlled depending on the kind of animal, weight, age, sex, health condition, feed composition and the like.
  • Another aspect of the present application relates to a method of producing a feed additive as described herein, wherein the method comprises culturing Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis and culturing the cultured bacterium, the culture thereof, And drying the concentrate.
  • the cultivation may specifically include culturing the strain at 30 ° C to 50 ° C for 2 hours to 60 hours, for example, at 32 ° C to 40 ° C for 5 hours to 50 hours after inoculation of the strain.
  • the culture is firstly incubated at 30 ° C to 50 ° C for 2 hours to 60 hours, for example, at 32 ° C to 40 ° C for 5 hours to 50 hours after inoculation with the strain, 1 x 10 < 7 > cfu per gram, and thereafter adding at least one raw material of corn, wheat bran, soybean meal or molasses to the culture and heating the mixture at 30 DEG C to 50 DEG C for 2 to 60 hours, , And secondary culturing at 32 DEG C to 40 DEG C for 5 hours to 50 hours.
  • the drying may be performed by drying the cultured cells, the culture thereof, or the concentrate thereof at 40 ° C to 70 ° C for 5 hours to 120 hours, for example, at 40 ° C to 60 ° C for 5 hours to 60 hours .
  • the manufacturing method may further include a step of further pulverizing after drying.
  • Another aspect of the present application relates to a method for increasing the milk chamber and flow rate of an animal, comprising administering to the animal a feed additive comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis. Specific descriptions of such embodiments are as set forth in other embodiments described herein.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for stabilizing the ruminal pH of an animal, particularly a ruminant, comprising administering to the animal a feed additive comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis. Specific descriptions of such embodiments are as set forth in other embodiments described herein.
  • Another aspect of the present application relates to a method of increasing the digestibility of an animal, particularly a ruminant, comprising administering to the animal a feed additive comprising Bacillus subtilis and Bacillus ricinifomis. Specific descriptions of such embodiments are as set forth in other embodiments described herein.
  • the feed additive according to the present application not only helps to improve the fattening of animals, especially ruminants, but also improves fat loss due to summer high temperature stress. In addition, it is effective for decomposition of lactic acid in rumen, so it is considered to be useful for reduction of rumen pH caused by lactic acid and prevention of high acidosis.
  • FIG. 1 is an electron micrograph of Bacillus subtilis CJBS62 strain, Bacillus ricinifomice CJBL215, and CJBL219 strain according to an embodiment of the present application.
  • Figure 2 shows the color change of the medium used in the selection of lactic acid consuming strains in one embodiment of the present application.
  • the color of the medium changed from yellow (left side) to purple (right side), it was judged that the strain in the medium consumed lactic acid.
  • Figure 3 is a bar graph showing the conversion of each strain to acetate in one embodiment of the present application.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of lactic acid, the amount of acetate (left y-axis) and the conversion rate to acetate (right y-axis) of Bacillus ricinifomys CJBL215 and CJBL219 strain according to the culture of 9h and 48h Respectively.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of hemolysis determination of Bacillus subtilis CJBS62 strain, Bacillus ricinifomice CJBL215, and CJBL219 strain according to one embodiment of the present application.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in lactic acid concentration according to changes in culture time when a feed additive according to one embodiment of the present application is added to a concentrated feed.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in acetate concentration according to the change of culture time when a feed additive according to an embodiment of the present application is added to a concentrated feed.
  • FIG. 8 is a bar graph showing the effect of adding a feed additive to a concentrated feed according to an embodiment of the present application in comparison with a control.
  • FIG. 9 is a bar graph showing the degree of improvement in digestibility when the feed additive is added to a concentrated feed according to one embodiment of the present application.
  • 10 is a bar graph showing the degree of improvement in digestibility when the feed additive is added to the TMR feed according to one embodiment of the present application.
  • the obtained samples were diluted in stages and cultured in BHI (Brain Heart Infusion, Difco) solid medium and cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • the strains isolated from each sample were transferred to a new medium and purely isolated.
  • the pure and isolated microorganisms were stored in a medium containing 20% by weight of glycerol, and stored at -70 ° C or lower. Among them, strains excellent in cellulase activity and strains excellent in ability to produce acetic acid by the decomposition of lactic acid were isolated by the following method.
  • Party result Party result CJBL215 CJBL219 CJBS62 CJBL215 CJBL219 CJBS62 control - - - Esculine + + + Glycerol + + + Salicine + + - Ertythritol - - - Cellobiose + + - D-Arabinose - - - Maltose + + + L-Arabinose + + + + Lactose - + - Ribose + + + + Melibiose - - - D- - D- - Saccharose + + + L-Xylose - - - Trehalose + + + + Adonitol - - - Inuline - - + beta methyl-xyloside - - - Melezitose - - - Galactose - + - D-Raffinose + - + D-Glucose + + + Amidon + + + + D
  • CJBL215 belonged to Bacillus ricinifomis (reliability 99.7%) and CJBL219 belonged to Bacillus ricinifomis (reliability 99.9%).
  • CJBS62 also belonged to Bacillus subtilis / amylolipidicus (reliability 99.6%).
  • CJBL215 and CJBL219 were identified as Bacillus ricinifomis, and CJBS62 as a microorganism having 99% homology with Bacillus subtilis.
  • the isolated strains were named 'Bacillus ricinifomis CJBL215', 'Bacillus ricinifomis CJBL219' and 'Bacillus subtilis CJBS62', respectively .
  • novel microorganisms of the present invention identified by the above-described method were named as Bacillus ricinifomis CJBL215, Bacillus ricinifomis CJBL219 and Bacillus subtilis CJBS62 on June 22, 2017, respectively, at the Korean Microorganism Preservation Center (KCCM) , KCCM12040P, KCCM12041P and KCCM12039P.
  • KCCM Korean Microorganism Preservation Center
  • Enzymatic activity of mannase and cellulase was evaluated for isolated strains derived from soybean. Enzyme activities were measured according to the degree of clear zone formation using a medium containing substrates for each enzyme.
  • the isolated strain was cultured in a BHI (Brain Heart Infusion, Difco) liquid medium for 24 hours, and the obtained culture was used as a crude enzyme solution for enzyme activity analysis.
  • the medium containing each substrate for each enzyme was used as follows To determine the extent of substrate degradation.
  • 1% CMC (carboxymethylcellulose) substrate supplemented with YM medium was prepared. 1.5 ⁇ l of crude enzyme solution was added to the substrate medium and reacted at 37 ° C for 15 to 18 hours. In order to measure the transparency, the cells were stained with 0.2% Congo red solution for 30 minutes and decolorized with 1M NaCl aqueous solution. The activity of the enzyme was measured according to the degree of formation of the transparent ring formed by decomposition of the substrate around the strain, and the results are shown in Table 2.
  • Bacillus subtilis CJBS16 and CJBS62 strains having excellent cellulase activity and excellent cellulase activity were selected from the selected strains.
  • the strain was cultured for 24 hours, centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was filtered using a 0.2 ⁇ m syringe filter to confirm the cellulase resolution in the culture supernatant of the selected strain.
  • the results are shown in Table 3. It was confirmed that the selected Bacillus subtilis CJBS62 strain was the best in the culture supernatant evaluation.
  • lactic acid supplemented medium was cultured and the presence or absence of lactic acid was determined by BCP method.
  • BCP method 15 mM lactate, 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of peptone, 10 g / L of NaCl and 0.0004 g / L of Bromophenol blue (BCP)) for the color development were prepared.
  • BCP Bromophenol blue
  • Each 1.5 ml of the above medium was dispensed into a microcentrifuge tube, and 50 ⁇ l of each of the pre-cultured strains were inoculated in a BHI (Brain Heart Infusion, Difco) medium.
  • BHI Brain Infusion, Difco
  • the selected CJBS16, CJBL215, CJBL219 and CJBS62 were inoculated into BHI (Brain Heart Infusion, Difco) medium and cultured at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours to activate the bacteria.
  • the bacteria were inoculated at 5% in a medium containing 15 mM lactic acid (15 mM lactic acid, 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of peptone and 10 g / L of NaCl) and cultured at 37 DEG C and 200 rpm for 48 hours. After completion of the culture, 10% BCP in the culture medium was added to confirm the lactic acid consumption again. It was confirmed that all of the above four strains consumed lactic acid (color change of cultures: yellow -> purple).
  • the selected CJBS16, CJBL215, CJBL219 and CJBS62 were inoculated into BHI (Brain Heart Infusion, Difco) medium and cultured at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours to activate the bacteria.
  • the bacteria were inoculated at 5% in a medium containing 15 mM lactic acid (15 mM lactic acid, 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of peptone and 10 g / L of NaCl) and cultured at 37 DEG C and 200 rpm for 48 hours.
  • the culture solution was centrifuged, and 0.2 ml of 25% metaphosphoric acid was added to 1 ml of the supernatant recovered.
  • the supernatant recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was filtered with 0.2um filter, and the acetate content was analyzed using GC (Agilent Technologies 7890A).
  • Lactic acid was consumed for four strains consuming lactic acid, and the content of acetate was determined.
  • the conversion rate was calculated according to Equation (1).
  • the conversion rate of the CJBL219 strain was 59.4%
  • the conversion rate of the CJBL215 strain was 44.9% (Table 4, FIG. 3).
  • the amount of lactate consumption and acetate production in the culture medium of the selected strain was determined.
  • the selected CJBS16, CJBL215, CJBL219 and CJBS62 were inoculated into a BHI (Brain Heart Infusion, Difco) medium and cultured at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours to activate the bacteria.
  • BHI Brain Heart Infusion, Difco
  • the cultured bacterium was inoculated at 5% by weight in a medium containing 15 mM lactic acid (15 mM lactate, 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of peptone and 10 g / L of NaCl) and incubated at 37 ° C and 200 rpm for 48 hours , And 48 hours, respectively.
  • 15 mM lactic acid 15 mM lactate, 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of peptone and 10 g / L of NaCl
  • the supernatant obtained by centrifuging the culture was collected by filtration through a 0.2- ⁇ m filter.
  • the filtered culture supernatant was loaded into a microcentrifuge tube and the lactic acid content was measured using a Cedex Bio (ROCHE) lactic acid bio (ROCHE) apparatus. The results are shown in Table 5.
  • the culture solution was centrifuged, and 0.2 ml of 25% metaphosphoric acid was added to 1 ml of the supernatant recovered.
  • the supernatant recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes was filtered with a 0.2- ⁇ m filter and assayed for acetate content using GC (Agilent Technologies 7890A). The results are shown in Tables 5, 4 and 5.
  • the CJBL215 strain consumed 49.8% of lactic acid in the initial lactic acid amount for 48 hours and converted about 91.1% of the consumed lactic acid to acetate.
  • the CJBL219 strain consumed 48.6% of the lactic acid in the initial lactic acid amount when cultured for 48 hours, and converted all the consumed lactic acid to acetate (FIG. 4).
  • Lactic acid content, acetate content and conversion rate in medium 0h 9h 48h CJBL215 Amount of lactate (mM) 13.12 8.35 6.59 Amount of acetate (mM) 0 2.50 5.94 Conversion rate (%) by Equation 2 52.4 91.1 CJBL219 Amount of lactate (mM) 13.12 8.52 6.74 Amount of acetate (mM) 0 2.87 6.49 Conversion rate (%) by Equation 2 62.4 101.8
  • ⁇ -hemolysis is an action that produces phospholipid enzymes from harmful bacteria and hydrolyzes phospholipids supplied by red blood cells to hemolyze red blood cells.
  • blood agar plate medium serum 5%, Hanil Chem Med, Korea
  • the cells were streaked on a prepared blood agar plate medium and then streaked at 37 ° C for 24 hours to confirm the hemolysis. As a result, it was confirmed that hemolysis did not occur as shown in FIG.
  • the selected strain was inoculated into BHI (Brain Heart Infusion, Difco) medium and cultured at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours. Immerse the cultured bacteria in a sterile swab and spread on a Mueller Hinton II Agar plate (Difco). The antibiotic disc is placed on the plate-coated plate and incubated at 37 ° C for 15 to 18 hours.
  • BHI Brain Heart Infusion, Difco
  • the antibiotic disc is placed on the plate-coated plate and incubated at 37 ° C for 15 to 18 hours.
  • Ampicillin, Clindamycin, Gentamicin, Kanamycin, Tetracyclin, Vancomycin, Erythromycin, Ampcillin / Sulbactam, Chloramphenicol and Streptomycin disks (OXOID) were prepared. Antibiotic susceptibility was confirmed by the degree of clear zone formation around the antibiotic disc after incubation. As a result of the antibiotic susceptibility test of the selected strain, the selected strain
  • the Bacillus strains CJBL215, CJBL219 and CJBL62 (two kinds of Bacillus licheniformis and one kind of Bacillus subtilis ) were respectively inoculated into 9 L of Tryptic Soy broth and cultured at 36 DEG C for 36 hours.
  • each strain was cultured until 1 x 10 9 cfu or more out of 1g per each strain.
  • As a raw material for solid phase fermentation a mixture of 20 kg of corn, 30 kg of wheat bran, 45 kg of soybean meal, and 5 kg of molasses was prepared.
  • the cultures of the three cultivated Bacillus strains were mixed with 9 L each, and a total of 27 L of the culture broth was prepared and added to 100 kg of the solid fermentation raw material.
  • the strain was fermented at 34 DEG C for 48 hours while stirring so that it could be evenly fermented in the solid fermentation raw material. After fermentation, the mixture was dried at 50 ° C for 48 hours and pulverized to obtain a feed additive.
  • Treatment 50 ml of the feed additive prepared in Example 6 and 0.5 g of the substrate prepared in Example 6 were added to a 200 ml serum bottle, 37.5 ml of a buffer reduced with carbon dioxide gas, and 12.5 ml of ruminant solution were anaerobically maintained with carbon dioxide gas. After the carbon dioxide gas was filled for about 30 seconds, the inlet of the serum bottle was sealed with a rubber cap and sealed with an aluminum cap. The cells were cultured in a 39 ° C incubator for 24 hours. At this time, concentrated feed or TMR (total mixed ration) was used as the substrate, and the feed additive was added in an amount of 10 wt% per 0.5 g of the substrate.
  • TMR total mixed ration
  • the buffer solution contained 9.3 g / L of sodium phosphate (monobasic, NaH 2 PO 4 -2H 2 O), 9.8 g / L of sodium bicarbonate (NaHCO 3 ), 0.47 g of sodium chloride / L, potassium (potassium chloride, KCl) 0.57g / L, magnesium chloride (magnesium chloride, MgCl 2) 0.256g / L, calcium chloride (calcium chloride, CaCl 2) 0.106g / L, casein (Caseine, NZ-Amine) 2.5 g / L, and 1.25 ml / L of resazurine solution.
  • the lactose content, acetate content, pH, and dry digestibility of each of the treatments and the control were measured by the following method after culturing in a 39 ° C incubator,
  • Lactic acid content was determined by centrifugation of the culture broth and the supernatant was filtered with a 0.2- ⁇ m filter and then loaded in a microcentrifuge tube and measured using a Cedex Bio (ROCHE) lactic acid bio (ROCHE) instrument.
  • the acetate content was determined by centrifuging the culture broth, adding 1 ml of the supernatant to 1 ml of 25% metaphosphoric acid, centrifuging at 10,000 rpm for 5 minutes, collecting the supernatant, filtering it with 0.2um filter, and using GC (Agilent Technologies 7890A) Respectively.
  • the digestibility of the building was calculated by Equation 3 below.
  • Dry digestibility (%) (pre-incubation amount - post-incubation amount) / pre-incubation amount * 100
  • the culture medium was filtered on a filter paper using a vacuum pump, and dried (60 ° C, overnight).
  • the change in the concentration of lactic acid and the concentration of acetate, measured according to the time of culture, in the treatment and control groups are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
  • the minimum lactic acid concentration in the treatment was about 10% lower than the minimum lactic acid concentration in the control. Also, referring to FIG. 7, the maximum acetate concentration in the treatment was about 2.5 times higher than the maximum acetate concentration in the control.
  • the pH and dry digestibility (%) of the treatments and controls are shown in FIGS. 8, 9 and 10, respectively.
  • the pH of the control was decreased by 0.5 from the initial value, but the pH of the treatment was decreased by 0.42 from the initial value.
  • the feed additive according to the present application was effective in stabilizing the rumen.
  • the feed additive according to the present application not only can improve the digestibility in rumen but also can increase the amount of acetic acid synthesis, which means that it can positively affect the increase of milk fat.
  • the feed additive according to the present application used in the following milking specification test was prepared by the method mentioned in Example 6 above. Through the known dairy specification tests, the effect of the feed additives of the present application on the milk productivity of the milking ward was evaluated.
  • the control diet consisted of 72 milking treatments (36 treatments) and treatment (36 treatments). During the 4 weeks treatment period, only the conventional diet was applied to the control diet, and the feed additives according to the present application were top dressed at 20 g / day They were mixed with the existing diets and fed. Before starting and after feeding, the milk fat, milk protein and flow rate were measured and the results are shown in Tables 7, 8 and 9.
  • the feed additive according to the present application can positively improve milk fat, milk protein and milk yield, and as a result, milk productivity and milk quality of milking milk can be increased.
  • the feed additive according to the present application used in the following milking specification test was prepared by the method mentioned in Example 6 above.
  • the effect of the feed additive according to the present application on the milk productivity of milking wool in a high temperature stress environment was evaluated.
  • the period of exposure to high temperature stress environment was selected (5/26 ⁇ 6/23, 4 weeks), and during this period, 150 dairy cows were fed with feed containing 0.2 wt% of feed additive according to the present application Before and after feeding.
  • milk feeding with feed containing no feed additive was set as a control group, and during 4 weeks in a high temperature stress environment, milk feeding with feed containing 0.2 wt% of the feed additive was set as the treatment group.
  • the basic feed composition fed to each treatment and control was the same.

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Abstract

본 출원은 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료첨가제, 상기 사료첨가제를 포함하는 사료 조성물, 및 상기 사료 첨가제의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제, 상기 첨가제를 포함하는 사료 조성물 및 상기 사료첨가제의 제조 방법
본 출원은, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제, 상기 첨가제를 포함하는 사료 조성물 및 상기 사료 첨가제의 제조 방법에 관한 것이다.
소와 같은 반추동물은 섭취하는 조사료의 양이 비육우의 경우 사료의 약 20%, 낙농우의 경우 약 60%를 차지하고 있으며, 섭취한 조사료는 제1위인 반추위내에서 미생물에 의해 분해되고 필요한 영양소 및 에너지가 흡수된다. 영양적/생리적 측면에서 보면, 반추동물은 반추위에 서식하는 미생물과 동물의 조직이 필요로 하는 단백질, 에너지, 지방산, 광물질 및 비타민 등의 많은 부분을 조사료로부터 섭취한다. 조사료는 생초, 건초 또는 사일리지의 형태로 동물에 급여되고 건조상태에서 20~30% 이상의 조섬유를 함유하고 있으며 비교적 분해되기 어려운 헤미셀룰로오스, 리그닌, 셀룰로오스로 이루어져 있다. 이런 조사료의 소화율을 높여 사료가치를 증진시키기 위하여 과거부터 여러 연구가 이루어 졌는데 대표적으로 물리적 처리방법(침지, 분쇄, 가압 증기처리, 팽창, 감마선 조사, 펠렛팅)과 화학적 처리방법(가성소다, 요소, 암모니아, 석회, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 염소, 오존, 과산화수소 등), 생물학적 처리방법(발효, 효소처리, 사일리지 등)이 있다. 그러나 이 중 물리적 처리방법은 가공에 많은 비용이 드는 문제점이 있고, 화학적 방법은 가공비용의 증가는 물론 취급 시 위험성이 따르며 토양을 오염시키거나 동물의 정상적인 생리현상에 변화를 줄 수 있는 문제점이 있어 지양하고 있는 실정이다. 따라서 섬유소를 분해하는 효소나 그러한 효소를 많이 생산하는 미생물을 첨가하는 생물학적 처리방법을 많이 활용하고 있으며 특히 셀룰로오스의 분해율을 높이기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다.
낙농우와 비육우에게 조사료만으로는 부족한 에너지 요구량을 충족시키고, 생산성을 향상시키기 위하여 부피가 작고 에너지 함량이 높으며 조사료에 비해 소화가 잘 되는 농후사료를 함께 급여한다. 하지만 농후사료를 많이 급여하는 경우 전분이 분해되는 과정에서 젖산의 농도가 증가하게 되고 이는 반추위내 pH를 급격히 감소시켜 반추위 유용 미생물의 생장에 악영향을 미치게 되고, 과산증으로까지 이어져 사료섭취량 감소, 소화장애, 심한 탈수증상과 설사를 유발하게 된다.
따라서, 셀룰로오스 및 젖산 분해능을 높일 수 있는 사료첨가제의 개발이 요구된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 특허 등록 제10-1721900호
본 출원의 일 목적은 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 유지방 개선에 도움되며, 유량 증진에도 유용한 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 일 목적은 본원에 기술된 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료첨가제가 포함된 사료 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원에 대해 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되어 있지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 이해할 수 있으므로 그 설명을 생략한다.
본 출원의 일 양태는, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 유지방 및 유량 증진용 사료 첨가제에 관한 것이다.
바실러스 서브틸리스는 소화효소, 예를 들어, 셀룰라아제 및/또는 만나아제를 생산하여 섬유소 등을 분해할 수 있는 것이라면 본원에서 사용할 수 있다. 바실러스 서브틸리스는 주로 토양, 된장, 또는 고추장 속에서 서식하며, 그람 양성균이며, 호기성 간균이다. 바실러스 서브틸리스의 예로, 바실러스 서브틸리스 CJBS62(Bacillus subtilis CJBS62), 또는 바실러스 서브틸리스 CJBS16을 들 수 있다. 특히 바실러스 서브틸리스 CJBS62를 사용할 수 있다. 바실러스 서브틸리스 CJBS62는 KCCM(한국 미생물 보존 센터: 대한민국 서울시 서대문구 홍제내-2가-길, 유림 빌딩 45)에 2017. 6. 22. 자로 기탁명: KCCM12039P로 기탁되었다. 바실러스 서브틸리스 CJBS62 균주의 16s 리보좀 DNA의 염기서열(5'→3')은 서열번호 3과 같다.
바실러스 리체니포미스는 젖산을 분해하여 아세트산을 합성할 수 있는 것이라면 본원에서 사용할 수 있다. 일 예에서, 상기 바실러스 리체니포미스를 젖산 함유 배지에서 9 시간 내지 48 시간 배양한 경우, 상기 바실러스 리체니포미스의 초기 젖산량 대비 아세테이트 전환율은 30% 내지 70%, 구체적으로 50% 내지 65%일 수 있고, 또는, 상기 바실러스 리체니포미스의 젖산 소모량 대비 아세테이트 전환율은 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상일 수 있다. 상기 초기 젖산량 대비 전환율은 하기의 식 1을 참고할 수 있으며, 상기 젖산 소모량 대비 아세테이트 전환율은 하기의 식 2를 참고할 수 있다:
[식 1]
초기 젖산 대비 아세테이트 전환율 = (아세트산 생성량/ 초기 젖산 량)*100
[식 2]
젖산 소모량 대비 전환율(%) = (아세트산 생성량/ 젖산 소모량)*100
바실러스 리체니포미스는 추가로, 셀룰라아제 및/또는 만나아제를 생산할 수 있는 균주일 수 있다.
바실러스 리체니포미스는 주로 된장, 또는 고추장 속에서 서식하며, 그람 양성균이며, 호기성 간균이다. 바실러스 리체니포미스의 예로, 바실러스 리체니포미스 CJBL215(Bacillus licheniformis CJBL215) 및 바실러스 리체니포미스 CJBL219(Bacillus licheniformis CJBL219) 를 들 수 있다. 특히 바실러스 리체니포미스 CJBL219 를 사용할 수 있다. 바실러스 리체니포미스 CJBL215 및 바실러스 리체니포미스 CJBL219는 각각 KCCM (한국 미생물 보존 센터: 대한민국 서울시 서대문구 홍제내-2가-길, 유림 빌딩 45)에 2017. 6. 22. 자로 기탁명: KCCM12040P 및 KCCM12041P 로 기탁되었다. 바실러스 리체니포미스 CJBL215 및 바실러스 리체니포미스 CJBL219의 16s 리보좀 DNA의 염기서열(5'→3')은 각각 서열번호 1 및 2와 같다.
본 출원에 따른, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제는, 반추동물의 반추위 pH 를 안정화 시킬 수 있으며, 반추동물의 사료 소화율을 높일 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는, 착유우가 생산하는 우유 내 유지방 개선에 효과적일 뿐 아니라, 생산되는 유량을 효율적으로 증가시킬 수 있다.
사료 첨가제 1g 당 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포미스는 각각 독립적으로, 1 x 107 cfu 이상, 구체적으로 1 x 108 cfu 이상, 보다 구체적으로 1 x 109 cfu 이상 포함될 수 있다. 상기 농도이면, 섬유소를 효과적으로 분해하고 유지방 증가에 효과적인 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
사료 첨가제의 사용량은, 0.1g 내지 1kg/마리/1일, 구체적으로 5g 내지 900g/마리/1일, 보다 구체적으로 10 g 내지 800 g/마리/1일일 수 있다.
바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포미스의 중량비는 1:9 내지 9:1, 구체적으로는 2:8 내지 8:2, 구체적으로는 3:7 내지 7:3, 보다 구체적으로는 1:2 내지 2:1 일수 있다.
사료 첨가제는 액상 또는 고상일 수 있고, 액상인 경우, 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포미스는, 바실러스 서브틸리스의 균체, 바실러스 리체니포미스의 균체, 이의 배양액, 또는 이의 농축액 형태로 존재할 수 있다. 고상인 경우, 바실러스 서브틸리스의 균체, 바실러스 리체니포미스의 균체, 이의 배양액, 또는 이의 농축액 등을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 열 또는 동결 건조 등에 의해 제조된, 분말, 정제, 펠릿제, 과립, 피복제 등의 형태를 가질 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 본원에 기술된 사료 첨가제를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다. 사료 조성물 중 사료 첨가제의 함량은 사료 조성물의 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 중량% 내지 40 중량%, 보다 구체적으로는 1 중량% 내지 20 중량%의 범위로 포함될 수 있다.
사료 조성물은 본원의 사료 첨가제 외에, 동물의 성장 촉진에 유효한 성분, 영양 성분, 영양 보조 성분, 보존 안정성을 높이는 성분, 피복제 성분 등의 임의 성분을 추가 포함할 수 있다. 사료 조성물은, 다른 생균제; 아밀라아제, 리파아제 등의 효소; L-아스코르브산, 염화콜린, 이노시톨 등의 비타민; 염화칼륨, 시트르산철, 산화마그네슘, 인산염류 등의 미네랄; 리신, 알라닌, 메티오닌 등의 아미노산; 푸마르산, 부티르산, 락트산 등의 유기산 또는 이의 염; 비타민 C, 비타민 E 등의 항산화제, 프로피온산칼슘 등의 곰팡이 방지제; 레시틴, 글리세린 지방산 에스테르 등의 유화제; 색소 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사료는 동물 사료일 수 있고, 구체적으로 반추 동물 사료일 수 있으며, 반추 동물의 예로는 소, 물소, 산양, 양, 염소 또는 사슴일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 섭취시키는 사료의 양은 동물의 종류, 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 사료의 성분 등에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 본원에 기술된 사료 첨가제의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제조 방법은, 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포미스를 배양하고, 상기 균주들의 배양된 균체, 이의 배양액, 또는 이의 농축액을 건조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 구체적으로 균주를 접종한 후 30℃ 내지 50℃에서, 2 시간 내지 60 시간 동안, 예를 들어, 32℃ 내지 40℃에서, 5시간 내지 50 시간 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 보다 구체적으로, 균주를 접종한 후 30℃ 내지 50℃에서, 2시간 내지 60 시간 동안, 예를 들어, 32℃ 내지 40℃에서 5시간 내지 50 시간 동안 1차 배양하여 균주가 배양물 1g 당 1 x 107 cfu 이상이 되도록 하고, 이후, 상기 배양물에 옥수수, 소맥피, 대두박, 당밀 중 하나 이상의 원료를 첨가하여 30℃ 내지 50℃에서, 2시간 내지 60 시간 동안, 예를 들어, 32℃ 내지 40℃에서 5시간 내지 50 시간 동안 2차 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 건조는, 배양된 균체, 이의 배양액, 또는 이의 농축액을 40℃ 내지 70℃에서 5시간 내지 120 시간 동안, 예를 들어, 40℃ 내지 60℃에서, 5시간 내지 60 시간 동안 건조하는 것일 수 있다. 상기 제조 방법은 일 구체예에서, 상기 건조 후 추가로 분쇄하는 공정을 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 유지방 및 유량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 당해 양태에 대한 구체적인 설명은 본원에 기재된 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 출원의 또 다른 양태는, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물, 특히 반추 동물의 반추위 pH를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 당해 양태에 대한 구체적인 설명은 본원에 기재된 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 출원의 또 다른 양태는, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 사료 첨가제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물, 특히 반추 동물의 소화율 증진 방법에 관한 것이다. 당해 양태에 대한 구체적인 설명은 본원에 기재된 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 출원에 따른 사료 첨가제는 동물, 특히 반추 동물의 유지방 개선에 도움이 될 뿐만 아니라 하절기 고온 스트레스에 따른 유지방 감소 현상을 개선시킬 수 있다. 또한, 반추위 내 젖산 분해에 효과가 있어 젖산으로 인한 반추위 pH 감소와 이로 인한 고산증 예방에도 유용할 것으로 판단된다.
도 1은 본 출원의 일 실시예에 따른 바실러스 서브틸리스 CJBS62 균주, 바실러스 리체니포미스 CJBL215, CJBL219 균주의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 본 출원의 일 실시예에서 젖산 소모 균주의 선발에 이용된 배지의 색 변화를 도시한다. 여기서, 배지의 색이 노란색(좌측)에서 보라색(우측)으로 변하면 배지 내 균주가 젖산을 소모한 것으로 판단하였다.
도 3은 본 출원의 일 실시예에서, 각 균주별 아세테이트로의 전환율을 보여주는 막대그래프이다.
도 4는 본 출원의 일 실시예에서, 9h, 48h 배양에 따른, 바실러스 리체니포미스 CJBL215, CJBL219 균주의 젖산 양, 아세테이트 양(좌측 y축)과, 아세테이트로의 전환율(우측 y축)을 도시하는 그래프이다.
도 5는 본 출원의 일 실시예에 따른 바실러스 서브틸리스 CJBS62 균주, 바실러스 리체니포미스 CJBL215, CJBL219 균주의 용혈성 확인 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 본 출원의 일 실시예에 따른 사료첨가제를 농후사료에 첨가시 배양 시간에 변화에 따른 젖산 농도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 출원의 일 실시예에 따른 사료첨가제를 농후사료에 첨가시 배양 시간에 변화에 따른 아세테이트 농도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 출원의 일 실시예에 따른 사료첨가제를 농후사료에 첨가시 pH 안정화 효과를 대조구와 비교하여 보여주는 막대 그래프이다.
도 9는 본 출원의 일 실시예에 따른 사료첨가제를 농후사료에 첨가시 소화율개선 정도를 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 본 출원의 일 실시예에 따른 사료첨가제를 TMR 사료에 첨가시 소화율개선 정도를 보여주는 막대 그래프이다.
이하, 본 출원을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1: 균주 분리 및 선발>
(1) 시료 확보 및 균주 분리
전통 장류인 된장, 고추장 등의 시료를 확보하여, 확보된 시료를 단계적으로 희석하여 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 고체배지에 도말 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리된 균주들을 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였으며, 순수 분리되어 배양된 균을 총 중량대비 20중량% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 -70℃ 이하에서 보존하였다. 이 중 아래의 방법으로 셀룰라아제 활성이 우수한 균주와, 젖산을 분해하여 아세트산을 생산하는 능력이 우수한 균주들을 분리하였다.
(2) 형태학적, 생화학적 특성 조사
상기 분리된 균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였다. 형태학적인 특징으로 그람 염색결과 분리된 균주들 모두 그람 양성이였으며, 전자현미경 촬영결과, 간균임을 확인하였다(도 1).
분리된 균주들의 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB system(biomerieux Vitek, Inc, 프랑스)을 사용하여, 각 균주의 당 발효 패턴을 분석하여 표 1에 나타내었다.
당 결과 당 결과
CJBL215 CJBL219 CJBS62 CJBL215 CJBL219 CJBS62
control - - - Esculine + + +
Glycerol + + + Salicine + + -
Ertythritol - - - Cellobiose + + -
D-Arabinose - - - Maltose + + +
L-Arabinose + + + Lactose - + -
Ribose + + + Melibiose - - -
D-Xylose + - - Saccharose + + +
L-Xylose - - - Trehalose + + +
Adonitol - - - Inuline - - +
β Methyl-xyloside - - - Melezitose - - -
Galactose - + - D-Raffinose + - +
D-Glucose + + + Amidon + + +
D-Frutose + + + Glycogene + + -
D-Mannose + + - Xylitol - - -
L-sorbose - - - β Gentiobiose - - -
Rhamnose - + - D-Turanose + + -
Dulcitol - - - D-Lyxose - - -
Inositol + - + D-Tagatose + + -
Mannitol + + + D-Fucose - - -
Sorbitol - + + L-Fucose - - -
α Methyl-D-mannoside - - - D-Arabitol - - -
α Methyl-D-glucoside + + - L-Arabitol - - -
N Acetyl gllucosamine - - - Gluconate - - -
Amygdaline + + - 2 ceto-gluconate - - -
Arbutine + + - 5 ceto-gluconate - - -
+ 양성, - 음성
균주의 당 발효 패턴을 분석한 결과, CJBL215 는 바실러스 리체니포미스에 속하는 것으로 나타났으며(신뢰도 99.7%), CJBL219 도 바실러스 리체니포미스에 속하는 것으로 나타났다(신뢰도99.9%). 또한 CJBS62는 바실러스 서브틸리스/아밀로리퀴펜셔스에 속하는 것으로 나타났다(신뢰도 99.6%).
(3) 균주 동정
균주의 보다 정확한 동정을 위하여, DNA 염기서열에 의한 분자계통분류학적 방법을 실시하였다. 염기서열분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 유니버셜 프라이머 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3')와 1492R(5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3')을 사용하여 16s rDNA의 유전자 증폭을 시켰다. 유전자 증폭 시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기서열을 분석하였다. 분리 균주의 분석된 16s rDNA의 염기서열은 서열번호 1 내지 3과 같다. 상기 분석결과, CJBL215와 CJBL219는 바실러스 리체니포미스, CJBS62는 바실러스 서브틸리스와 99% 상동성을 가지는 미생물로 동정되었다. 이에 상기 분리된 균주를 '바실러스 리체니포미스 CJBL215', '바실러스 리체니포미스 CJBL219', '바실러스 서브틸리스 CJBS62'로 각각 명명하였다. 상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규한 미생물들은 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 6월 22일자로 바실러스 리체니포미스 CJBL215, 바실러스 리체니포미스 CJBL219, 바실러스 서브틸리스 CJBS62를 각각 기탁명, KCCM12040P, KCCM12041P, KCCM12039P로 기탁하였다.
<실시예 2: 분리 균주의 소화효소 활성 측정>
(1) 균주의 소화 효소 활성
복합 소화 효소 활성이 있는 균주를 선별하기 위해, 분리된 장류 유래균에 대해서 만나아제(mannase), 셀룰라아제 2종에 대한 효소 활성 평가를 실시하였다. 효소 활성 평가는 각 효소에 대한 기질이 들어있는 배지를 사용하여 투명환(clear zone) 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.
상기 분리한 균주를 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 액체 배지에서 24시간 배양 후 얻어진 배양액을 채취하여 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 사용하였고, 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.
1) 만나아제 활성 측정
1% 만난(logust bean gum, sigma, USA)이 첨가된 기질배지(Yeast extract 3g/L, Peptone 5g/L, KH2PO4 1g/L, Agar 20g/L, Ph 5)를 제조하였다. 조효소액을 1.5 ㎕씩 기질배지에 점적한 후, 37℃에서 15~18 시간 반응 후 투명환 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
2) 셀룰라아제 활성 측정
1% CMC(carboxymethylcellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 조효소액을 1.5 ㎕씩 기질 배지에 점적하여 37℃에서 15~18 시간 동안 반응시켰다. 투명환을 측정하기 위해 0.2% 콩고 레드(Congo red) 용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 균주 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 형성 정도에 따라 효소의 활성 능력을 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
상기 평가를 바탕으로 선발 균주 중 만나아제 활성이 우수하면서 셀룰라아제 활성이 가장 우수한 바실러스 서브틸리스 CJBS16, CJBS62 균주를 선발하였다.
선발 균주의 소화효소 활성 (단위 : mm)
　 CJBS16 CJBL215 CJBL219 CJBS62
만나아제 5 0 2.5 3.5
셀룰라아제 2 3 2 3.5
(2) 배양 상등액 내의 셀룰로스 분해 활성
선발된 균주의 배양 상등액에서의 셀룰로스 분해능을 확인하기 위해, 균주를 24시간 배양하여 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 0.2㎛ 주사기필터를 이용하여 필터링하였다. 이 상층액을 Cellulose 가 함유된 배지(Carboxymethylcellulose sodium salt 10g/L, Bacto agar 15g/L)에 20㎕ 떨어뜨리고 37℃에서 1일 반응한 후, 0.4% 콩고 레드 용액을 부어 20분간 염색한다. 염색 후 1M NaCl 용액으로 탈색하여 투명환의 크기를 측정하여 배양 상등액 내의 셀룰로스 분해능을 확인하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 선발된 바실러스 서브틸리스 CJBS62 균주가 배양 상등액 평가에서도 가장 우수함을 확인하였다.
선발 균주의 배양상등액내 셀룰로스 분해 활성 (단위 : mm)
　 CJBS16 CJBL215 CJBL219 CJBS62
셀룰로스 분해 활성 16.5 16.5 14 24
<실시예 3 : 젖산 소모 균주 및 아세테이트 생산 균주 선발>
젖산을 소모하는 균주를 선별하기 위해, 젖산를 첨가한 배지를 이용하여 배양 후 BCP 발색법을 통하여 젖산 소모 유무를 정성적인 방법으로 확인하였다. 발색을 위한 Bromophenol blue (BCP) 및 15mM 젖산을 함유한 배지(15mM lactate, Yeast extract 10g/L, Peptone 20g/L, NaCl 10g/L, Bromophenol blue (BCP) 0.0004g/L) 를 제조하였다. Microcentrifuge tube에 상기 배지를 1.5ml씩 분주한 후, BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 배지에서 전배양된 균주들을 각각 50㎕ 접종하였다. 상기 균주들을 튜브 내에서 37℃에서 4~5일 정치 배양하였다. 배지의 색을 관찰하여 배지의 색이 노란색에서 보라색으로 변하면 배지 내의 젖산을 소모한 것으로 판단하여 1차로 젖산 소모균을 선별하였다. 시료에서 분리된 177주의 균주들을 배양한 결과, CJBS16, CJBL215, CJBL219, CJBS62 총 4주를 선발하였다(도 2).
상기 선발된 CJBS16, CJBL215, CJBL219 및 CJBS62를 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 배지에 접종하고, 37℃, 200rpm에서 16시간 배양하여 균을 활성화시켰다. 15mM 젖산을 함유한 배지(15mM 젖산, Yeast extract 10g/L, Peptone 20g/L, NaCl 10g/L)에 상기 균을 5% 접종하여, 37℃, 200rpm에서 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양액의 10% BCP를 첨가하여 젖산 소모 유무를 다시 한번 확인하였다. 상기 4종 균주 모두 젖산을 소모한다는 것을 확인하였다 (배양액 색 변화: 노란색->보라색).
<실시예 4 : 젖산 소모 및 아세테이트 생산 함량 측정>
(1) 아세테이트 생산량 측정
상기 선발된 CJBS16, CJBL215, CJBL219 및 CJBS62를 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 배지에 접종하고, 37℃, 200rpm에서 16시간 배양하여 균을 활성화시켰다. 15mM 젖산을 함유한 배지(15mM 젖산, Yeast extract 10g/L, Peptone 20g/L, NaCl 10g/L)에 상기 균을 5% 접종하여, 37℃, 200rpm에서 48시간 배양하였다.
상기 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액 1ml에 25% metaphosphoric acid 0.2ml을 첨가하였다. 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 상등액을 0.2um 필터로 필터링 후 GC(Agilent Technologies 7890A)를 이용하여 아세테이트 함량을 분석하였다.
젖산을 소모하는 균주 4종에 대해 젖산을 소모하여 아세테이트를 생성한 함량을 측정하였고, 그 전환율을 식 1에 의해 환산하였다. 그 결과, CJBL219균주의 전환율이 59.4%로 전환율이 가장 높았으며, CJBL215 균주의 전환율은 44.9% 였다(표 4, 도 3).
[식 1]
초기 젖산 대비 아세테이트 전환율 = (아세트산 생성량/ 초기 젖산 량.)*100
배지 내 젖산 소모 후 아세테이트 생성량 및 전환율
균주 No. 아세테이트함량(mM) 식 1에 의한 전환율(%)
CJBL219 8.91 59.4
CJBL215 6.74 44.9
CJBS16 3.74 24.9
CJBS62 1.99 13.3
(2) 선발균주의 젖산 소모량 및 아세테이트 생성량 측정
선발균주의 배지 내 젖산 소모량 및 아세테이트 생성량을 정량하고자 하였다.
상기 선발된 CJBS16, CJBL215, CJBL219 및 CJBS62를 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 배지에 접종하여, 37℃, 200rpm에서 16시간 배양하여 균을 활성화 시켰다.
15mM 젖산을 함유한 배지(15mM 젖산, Yeast extract 10g/L, Peptone 20g/L, NaCl 10g/L)에 상기 배양된 균을 5중량% 접종하여, 37℃, 200rpm에서 48시간 배양하면서, 9시간, 48시간에 각각 샘플링하였다.
1) 젖산의 정량
상기 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액을 0.2um 필터로 필터링하여 준비하였다. 필터링된 배양상등액을 microcentrifuge tube에 담아 Cedex Bio(ROCHE)의 젖산 bio(ROCHE) 장비를 이용하여 젖산 함량을 측정하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
2) 아세테이트의 정량
상기 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액 1ml에 25% metaphosphoric acid 0.2ml을 첨가하였다. 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 상등액을 0.2um 필터로 필터링 후 GC(Agilent Technologies 7890A)를 이용하여 아세테이트 함량을 분석하였고, 그 결과를 표 5, 도 4 및 도 5에 나타내었다.
[식 2]
소모된 젖산 대비 아세테이트 전환율 = (아세트산 생성량/ 젖산 소모량)*100
표 5를 참고하면, CJBL215 균주는 48시간 배양 시, 초기 젖산량 중에서 49.8%의 젖산을 소모하였으며, 소모된 젖산의 약 91.1%를 아세테이트로 전환시켰다. CJBL219균주는 48시간 배양시, 초기 젖산량 중에서 48.6%의 젖산을 소모하였으며, 소모된 젖산을 모두 아세테이트로 전환시켰다(도 4).
시간 경과에 따른 배지 내 젖산 함량, 아세테이트 함량 및 전환율
　 0h 9h 48h
CJBL215 젖산양(mM) 13.12 8.35 6.59
아세테이트 양(mM) 0 2.50 5.94
식 2에 의한 전환율(%) 　 52.4 91.1
CJBL219 젖산 양(mM) 13.12 8.52 6.74
아세테이트 양(mM) 0 2.87 6.49
식 2에 의한 전환율(%) 　 62.4 101.8
< 실시예 5 : 균주의 안전성>
(1) 균주의 용혈성 확인
β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다. 분리균주의 용혈성을 알아보기 위하여 혈액한천평판배지(sheep blood 5%, ㈜한일코메드, 대한민국)를 이용하였다. 준비된 혈액한천평판배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과, 도 5와 같이 용혈성을 나타내지 않았음을 확인할 수 있었다.
(2) 균주의 항생제 감수성 확인
선발 균주의 항생제 감수성을 확인하고자 실험을 진행하였다. 선발균주를 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 배지에 접종하여, 37℃, 200rpm에서 16시간 배양하였다. 배양된 균을 멸균된 면봉에 적셔 Mueller Hinton Ⅱ Agar plate(Difco)에 도말한다. 균이 도말된 평판배지에 항생제 디스크를 올려 37℃에서 15~18시간 배양한다. 항생제 검사를 위해 Ampicillin, Clindamycin, Gentamicin, Kanamycin, Tetracyclin, Vancomycin, Erythromycin, Ampcillin/Sulbactam, Chloramphenicol, Streptomycin 디스크(OXOID)를 준비하여 실험을 수행하였다. 배양 후 항생제 디스크 주위의 성장저해영역(clear zone) 형성 정도에 따라 항생제 감수성을 확인하였다. 선발 균주의 항생제 감수성 검사에 대한 결과, 선발 균주는 위의 항생제에 내성을 갖지 않는 것으로 확인되었다(표 6).
항생제에 따른 균주의 성장저해도
항생제(Antibiotics) 항생제를 중심으로 한 성장저해영역 반지름(mm)
CJBL215 CJBL219 CJBS62
Amp10 (Ampicillin) 10 8 10
C30 (Clindamycin) 14 4 9
CN120 (Gentamicin) 18 12 12
K30 (Kanamycin) 13 9 10
TE30 (Tetracycline) 5 8 12
VA30 (Vancomycin) 9 6 7
E15 (Erythromycin) 13 13 11
SAM20 (Ampicillin/Sulbactam) 15 12 13
S10 (Chloramphenicol) 3 3 6
DA2 (Streptomycin) 6 7 9
< 실시예 6. 균주를 포함하는 사료첨가제의 제조>
상기 바실러스 균주 CJBL215, CJBL219 및 CJBL62 (Bacillus licheniformis 2종, Bacillus subtilis 1종)를 각각 Tryptic Soy broth 9L 에 접종한 후 36℃에서 36시간 배양하였다. Tryptic Soy agar 배지에 상기 균주를 도말하여 콜로니 수를 측정하였을 때, 각 균주 당 1g 중 1 x 109 cfu 이상이 될 때까지 각 균주를 배양하였다. 또한 고상발효의 원료로는 옥수수 20kg, 소맥피 30kg, 대두박 45kg, 및 당밀 5kg이 혼합된 혼합물을 준비하였다. 상기 배양한 바실러스 균주 3종의 배양액을 각각 9 L씩 혼합하여 총 27L의 배양액 혼합액을 만들고, 고상발효 원료 100kg에 추가하였다. 상기 균주가 고상발효 원료 내에서 고르게 발효될 수 있도록 교반을 하면서 34℃ 온도에서 48시간 동안 발효되었다. 발효가 끝난 후, 50℃ 온도에서 48시간 동안의 건조 과정을 거친 뒤 분쇄하여 사료첨가제를 얻었다.
< 실시예 7. 사료 첨가제의 기질별 반추위 발효 성상에 미치는 효과 측정>
하기, 건물소화율 개선 및 아세트산 증진 효과 실험은 다음과 같이 반추위 모형 정치배양 시스템을 이용하여 진행하였다.
* 처리구: 200ml 세럼바틀에 상기 실시예 6 에서 제조한 사료 첨가제 50mg과 0.5g의 기질을 투입하고 이산화탄소 가스로 환원시킨 버퍼 37.5ml과 반추위액 12.5ml을 이산화탄소 가스로 혐기 상태를 유지하였다. 이산화탄소 가스를 약 30초 동안 충진시킨 후, 고무마개로 세럼바틀 입구를 막고 알루미늄캡으로 밀봉하였다. 이를 39℃ 정치배양기에서 24시간 배양하였다. 이 때 기질은 농후사료 또는 TMR(Total Mixed Ration, 완전배합사료)을 사용하였으며, 사료첨가제는 기질 0.5g 당 10 wt%의 비율만큼 첨가하였다. 버퍼용액은 인산수소나트륨(Sodium Phosphate, monobasic, NaH2PO4-2H2O) 9.3g/L, 탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate, NaHCO3) 9.8g/L, 염화나트륨(Sodium chloride, NaCl) 0.47g/L, 염화칼륨(Potassium chloride, KCl) 0.57g/L, 염화마그네슘(Magnesium chloride, MgCl2) 0.256g/L, 염화칼슘(Calcium chloride, CaCl2) 0.106g/L, 카제인(Caseine, N-Z-Amine) 2.5g/L, 및 레자주린(resazurine) 용액 1.25ml/L을 혼합하여 제조하였다.
* 대조구: 사료첨가제가 추가되지 않은 기질이 준비되었으며, 상기 처리구와 동일한 조건에서 배양되었다.
상기 처리구 및 대조구를 39℃ 정치배양기에서 배양한 후, 각각의 젖산 함량, 아세테이트 함량, pH, 및 건물소화율을 다음 방법으로 측정하였다:
젖산 함량은 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액을 0.2um 필터로 필터링한 후 microcentrifuge tube에 담아 Cedex Bio(ROCHE)의 젖산 bio(ROCHE) 장비를 이용하여 측정하였다. 아세테이트 함량은 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액 1ml에 25% metaphosphoric acid 0.2ml을 첨가하고, 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 상등액을 0.2um 필터로 필터링 후 GC(Agilent Technologies 7890A)를 이용하여 측정하였다. 건물소화율은 아래 식 3으로 계산하였다.
[식 3]
건물소화율(%) = (배양전 기질양 - 배양후 기질양)/배양전 기질양 * 100
상기'배양 전 기질양' 또는 '배양 후 기질양'은, 배양 전 또는 배양 후 배양액을 진공펌프를 이용하여 Filter paper에 필터링 한 후 건조하여(60℃, overnight) 측정하였다.
처리구 및 대조구에서, 배양시간에 따라 측정된 젖산의 농도 변화 및 아세테이트의 농도 변화를 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6를 참고하면, 상기 처리구에서의 최소 젖산 농도는, 상기 대조구에서의 최소 젖산 농도보다 약 10% 더 낮았다. 또한, 도 7을 참고하면, 상기 처리구에서의 최대 아세테이트 농도는, 상기 대조구에서의 최대 아세테이트 농도보다 약 2.5배 높았다.
처리구 및 대조구의 pH 및 건물소화율(%)을 각각 도 8, 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 8을 참고하면, 대조구의 pH는 초기 대비 0.5 감소하였으나, 처리구의 pH는 초기 대비 0.42 감소하였는 바, 본 출원에 따른 사료첨가제가 반추위안정화에 효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
또한, 도 9 및 도 10을 참고하면, 농후사료 및 TMR을 각각 기질로 사용한 경우에, 대조구의 건물소화율 대비 처리구의 건물소화율이 각각 4% 및 1.3% 높은 것으로 측정되었다. 즉, 본 출원에 따른 사료첨가제는 반추위 내 소화율을 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 아세트산 합성량을 증가시킬 수 있는 바, 이는 유지방 증가에 긍정적 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다.
< 실시예 8. 유지방 증진용 사료 첨가제가 착유우의 생산성에 미치는 효과 >
하기, 착유우 사양시험에 사용된, 본 출원에 따른 사료 첨가제는 상기 실시예 6 에서 언급된 방법으로 제조되었다. 공지된 낙농사양시험을 통하여, 본 출원의 사료첨가제가 착유우의 우유 생산성에 미치는 영향에 대해 평가하였다. 착유우 72두를 대조구(36두)와 처리구(36두)로 배치하였으며, 4주의 시험기간 동안 대조구에는 기존의 사료만을 투여하고 처리구에는 본 출원에 따른 사료첨가제를 탑 드레싱 형태로 두당 20g/day씩 기존사료에 섞어 급여하였다. 개시 전과 급여 후의 유지방, 유단백 및 유량을 측정하여 그 결과를 표 7, 표 8, 표 9에 나타내었다.
상기 사료첨가제를 착유우에 지속적으로 두당 20g/day씩 급여한 결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이 유지방이 0.3%p 증가한 것으로 확인하였다. 또한 하기 표 8에서 볼 수 있듯이 대조구에서는 유단백의 변화가 없었으나, 처리구에서 0.1%p 개선됨을 확인 할 수 있었다. 유량의 측정시에도 대조구에서는 변화가 없었으나, 처리구에서는 0.4kg 증가하였다(표 9).
상기 결과를 통하여, 본 출원에 따른 사료첨가제는 유지방, 유단백 및 유량을 모두 긍정적으로 개선시킬 수 있으며, 결과적으로는 착유우의 우유 생산성과 우유의 질을 높일 수 있다는 점을 확인하였다.
사료첨가제의 유지방 개선 효과
　 대조구 처리구
개시 전(3주 평균) 4.7 % 4.7 %
급여 후(4주 평균) 4.7 % 5.0 %
유지방 개선효과( %p ) 0.0 0.3
사료첨가제의 유단백 개선 효과
　 대조구 처리구
개시 전(3주 평균) 3.4 % 3.2 %
급여 후(4주 평균) 3.4 % 3.3 %
유단백 개선효과( %p ) 0.0 0.1
사료첨가제의 유량 개선 효과
　 대조구 처리구
개시 전(3주 평균) 27.9 kg 31.9 kg
급여 후(4주 평균) 28.0 kg 32.3 kg
유량 개선효과(kg) 0.1 0.4
< 실시예 9. 유지방 증진용 사료첨가제가 하절기 고온스트레스시 착유우 생산성에 미치는 효과>
하기, 착유우 사양시험에 사용된, 본 출원에 따른 사료 첨가제는 상기 실시예 6 에서 언급된 방법으로 제조되었다. 공지된 낙농사양시험을 통하여, 고온 스트레스 환경에서 본 출원에 따른 사료첨가제가 착유우의 우유 생산성에 미치는 영향에 대해 평가하였다. 통상적으로 낙농우가 고온 스트레스 환경에 노출되는 기간을 선정하여(5/26~6/23, 4주), 해당 기간 동안에 착유우 150두에게 본 출원에 따른 사료첨가제가 0.2wt% 포함된 사료를 급여하여 급여 전/후를 비교하였다.
고온 스트레스가 없는 환경에서 4주 동안, 어떠한 사료첨가제도 포함되지 않은 사료가 급여된 착유우를 대조군으로 설정하였으며, 고온 스트레스 환경에서 4주 동안, 상기 사료첨가제가 0.2wt% 포함된 사료가 급여된 착유우를 처리구로 설정하였다. 각각의 처리구와 대조구에게 급여된 기본 사료 조성은 동일하였다.
사료첨가제가 하절기 유생산성에 미치는 효과
유지방 유량
대조구 3.7 % 36.2 kg
처리구 3.9 % 36.7 kg
개선효과 0.2 %p 0.5 kg
상기 표 10을 참고하면, 대조구에서 측정된 유지방 및 유량에 비하여, 처리구에서 측정된 유지방 및 유량은 각각 0.2%p 및 0.5kg가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
통상적으로 착유우가 고온 스트레스 환경에 노출되는 경우, 착유우로부터 생산되는 유량과 유지방이 감소하는 것이 일반적이다. 하지만, 본 발명에 따른 사료첨가제가 제공된 착유우에서는, 고온 스트레스 환경에 노출되더라도 유지방 및 유량 감소 현상이 나타나지 않고, 오히려 유지방 및 유량이 개선될 수 있다.
Figure PCTKR2017008455-appb-I000001
Figure PCTKR2017008455-appb-I000002
Figure PCTKR2017008455-appb-I000003

Claims (7)

  1. 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 포함하는 유지방 및 유량 증진용 사료첨가제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스는 바실러스 서브틸리스 CJBS62(Bacillus subtilis CJBS62(KCCM12039P))를 포함하는, 유지방 및 유량 증진용 사료첨가제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 리체니포미스는 바실러스 리체니포미스 CJBL215(Bacillus licheniformis CJBL215(KCCM12040P)) 및 바실러스 리체니포미스 CJBL219(Bacillus licheniformis CJBL219(KCCM12041P))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유지방 및 유량 증진용 사료첨가제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 사료첨가제 1g당 상기 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스를 각각 1 x 107 cfu 이상 포함하는, 유지방 및 유량 증진용 사료첨가제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 리체니포미스는, 젖산 함유 배지에서 9시간 내지 48시간 배양되어 아세테이트를 생성하는 것이고, 상기 바실러스 리체니포미스의 초기 젖산량 대비 아세테이트 전환율은 30% 내지 70%인, 유지방 및 유량 증진용 사료 첨가제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 및 상기 바실러스 리체니포미스의 배합 중량비가 1: 9 내지 9:1 인, 유지방 및 유량 증진용 사료 첨가제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 사료첨가제를 포함하는 사료 조성물.
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