WO2012169842A2 - 차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸 - Google Patents

차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸 Download PDF

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    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a novel Lactobacillus plantarum isolated from tea leaves.
  • Tea for drinking is inactivating and removing water from oxidases present in the shoots or leaves of Camellia sinensis of the Camellia family. These teas contain vitamins, caffeine, tannins, flavonoids and essential oils, and are widely used in various fields such as food.
  • the present invention seeks to provide a novel Lactobacillus plantarum strain.
  • a composition comprising the novel Lactobacillus plantarum strain or its culture.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain.
  • One aspect of the present invention provides a Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum) APsulloc 331263 strain.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 strain.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331269 strain.
  • compositions comprising one or more of Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain, and APsulloc 331269 strain or a culture thereof.
  • the novel Lactobacillus plantarum strain according to the present invention Since the novel Lactobacillus plantarum strain according to the present invention has excellent acid resistance, it can survive in the stomach ( ⁇ ) when ingested as food, and furthermore, the intestinal reach rate can be high.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention is excellent in bile acid performance, and therefore has excellent intestinal fixation ability.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention is excellent in antimicrobial activity and excellent in inhibiting harmful bacteria.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention has a low ratio of D-lactic acid in the produced lactic acid compared to the existing Lactobacillus plantarum, so that adults or infants vulnerable to lactic acid can be freely ingested.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention produces a smaller amount of lactic acid than the existing Lactobacillus plantarum, so that the food has a soft taste when the food is fermented using the same. Therefore, the novel Lactobacillus plantarum strain according to the present invention can be widely used in various fields, for example, the food field.
  • Lactic acid bacteria refers to bacteria that produce lactic acid by breaking down sugars such as glucose and are also referred to as lactic acid bacteria. Lactic acid produced by lactic acid fermentation of lactic acid bacteria can inhibit the growth of pathogens and harmful bacteria, and this property is used for the production of foods such as dairy products, kimchi and brewed foods. In addition, lactic acid bacteria live in the intestines of mammals to prevent abnormal fermentation by various bacteria, so it is an important bacterium that is also used as a formal agent.
  • Lactobacillus plantarum is a strain belonging to lactic acid bacteria is known to grow mainly when the fermentation of kimchi has a lot of sour taste.
  • the optical isomers of lactic acid produced are D-type and L-type. Since Lactobacillus plantarum can be widely used in various foods requiring fermentation, if Lactobacillus plantarum having excellent acid resistance, bile acid performance and antibacterial activity is developed, it may be usefully used.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 (Accession Number: KCCM11179P) strain.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331263 (Accession Number: KCCM11180P) strain.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331266 (Accession Number: KCCM11181P) strain.
  • One aspect of the invention provides a Lactobacillus plantarum APsulloc 331269 (Accession Number: KCCM11182P) strain.
  • At least one of Lactobacillus plantarum APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 according to the present invention belongs to Lactobacillus plantarum as a strain isolated from Camellia sinensis leaves.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention comprises the steps of pickling the tea leaves with a salt of 5 to 15% by weight relative to the tea leaf weight; Mixing the pickled tea leaves with a sugar solution, for example 0.1% to 3% of fructo oligosaccharides, and incubating at 25 to 35 ° C. for 1 to 5 days; And it can be separated by a method comprising the step of taking the culture medium to less than pH 5 and incubating for 1 to 5 days at 25 to 35 °C anaerobic conditions.
  • At least one of Lactobacillus plantarum APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 has excellent acid resistance.
  • a lactic acid bacterium for example, Lactobacillus plantarum is taken as a probiotic
  • a high intestinal attainment rate is preferable in order to exert an effect peculiar to lactic acid bacteria.
  • gastric acid secretion requires a high survival rate in the lower pH.
  • the fasting pH of the stomach is about 1.2 to 2, but the intake of food pH is known to be about 2-3.
  • Lactobacillus plantarum strains according to the present invention have excellent acid resistance at pH 2 to 4, specifically pH 2 to 3.5 or pH 2.5 to 4, more specifically pH 2.5 to 3.5, even more specifically at pH 2.5 to 3 Has On the other hand, when ingesting food, the average stomach residence time of the food is known to be about 1 to 3 hours.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention is pH 2 to 4, specifically pH 2 to 3.5 or pH 2.5 to 4, more specifically pH 2.5 to 0.5 hours to 5 hours, specifically 1 to 4 hours. 3.5, even more particularly have good acid resistance at pH 2.5 to 3. Therefore, the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention has a high intestinal attainment rate when ingested as food because it can survive even at low pH of the stomach during the stomach retention period.
  • Lactobacillus plantarum strain according to one aspect of the present invention has excellent bile acid capacity. Food passing through the stomach is delivered to the small intestine, at which time bile acids are secreted to help digest food. Strains that are highly resistant to bile acids are known to have good intestinal fixation ability. The Lactobacillus plantarum strain according to one aspect of the present invention is excellent in the intestinal fixability because it has excellent bile acid performance.
  • Lactobacillus plantarum strain has the ability to produce lactic acid.
  • lactic acid produced by lactic acid bacteria includes L-type and D-type.
  • D-lactic acid has a slower metabolic rate than L-lactic acid, and thus, high concentrations of D-lactic acid in the blood may cause lactic acid poisoning. Therefore, it is desirable that adults and infants who are vulnerable to lactic acid should not consume lactic acid bacteria that produce large amounts of D-lactic acid.
  • the Lactobacillus plantarum strain may produce lactic acid having a D-type of 75% or less, specifically 70% or less, and more specifically 65% or less of the produced lactic acid.
  • Lactobacillus plantarum strain according to another aspect of the present invention is 17.5 g / L or less, specifically 17 g / L or less, more specifically 16.5 g / L or less, more specifically 15 g / L or less, more More specifically 14.5 g / L or less, even more specifically 14 g / L or less, even more specifically 13.5 g / L or less lactic acid.
  • the Lactobacillus plantarum strain according to the present invention generates lactic acid having a lower D-type ratio than the existing Lactobacillus plantarum, so that adults or infants vulnerable to lactic acid can be freely ingested.
  • the amount of lactic acid produced is lower than conventional Lactobacillus plantarum, so when the food is fermented by using the food may have a softer taste.
  • One aspect of the invention provides an extract or culture of one or more of Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain and APsulloc 331269 strain.
  • Another aspect of the present invention provides a composition comprising one or more of Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain and APsulloc 331269 strain, extracts thereof, or a culture thereof.
  • One aspect of the present invention provides a food composition comprising one or more of the Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain, and APsulloc 331269 strain, extracts thereof, or a culture thereof.
  • the food composition may be a health food composition, it may be a fermented food composition that requires fermentation, such as tea, dairy products, kimchi, brewed foods.
  • the formulation of the food composition is not particularly limited, but may be, for example, formulated into tablets, pills, soft and hard capsules, granules, drinks, caramels, diet bars, tea bags, and the like.
  • the food composition of each formulation may be suitably selected by a person skilled in the art according to the formulation or purpose of use in addition to the active ingredient, and may be synergistic when applied simultaneously with other raw materials.
  • Determination of the dosage of the active ingredient is within the level of those skilled in the art, and its daily dosage is, for example, Lactobacillus plantarum 10 5 to 10 13 CFU / day, more specifically 10 6 to 10 10 CFU / day.
  • the present invention is not limited thereto and may vary depending on various factors such as age, health condition, complications, etc. of the subject to be administered.
  • One aspect of the present invention provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising one or more of the Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain, and APsulloc 331269 strain, extracts thereof, or a culture thereof.
  • the cosmetic composition may be provided in any formulation suitable for topical application.
  • it may be provided in the form of a solution, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder, a paste, a foam, or an aerosol composition.
  • Compositions of such formulations may be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition may contain, in addition to the above-mentioned materials, other ingredients that can give a synergistic effect to the main effect within a range not impairing the main effect.
  • the cosmetic composition according to the present invention may include a substance selected from the group consisting of vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides and sphingolipids.
  • the cosmetic composition according to the present invention may include a moisturizer, an emulsifier, a surfactant, a ultraviolet absorber, a preservative, a fungicide, an antioxidant, a pH adjuster, organic and inorganic pigments, flavoring agents, cooling agents or limiting agents. .
  • the blending amount of the above components can be easily selected by those skilled in the art within the range that does not impair the object and effect of the present invention, the blending amount may be 0.01 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3% by weight based on the total weight of the composition. have.
  • One aspect of the invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more of the Lactobacillus plantarum APsulloc 331261 strain, APsulloc 331263 strain, APsulloc 331266 strain, and APsulloc 331269 strain, extracts thereof, or a culture thereof.
  • the pharmaceutical composition may be used for the prevention or treatment of intestinal diseases, such as irritable bowel syndrome, constipation, diarrhea and the like.
  • compositions according to one aspect of the present invention may be administered orally, parenteral, rectal, topical, transdermal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous.
  • Formulations for oral administration may be tablets, pills, soft and hard capsules, granules, powders, granules, solutions, emulsions or pellets, but are not limited thereto. It is not.
  • Formulations for parenteral administration may be, but are not limited to, solutions, suspensions, emulsions, gels, injections, drops, suppositories, patches or sprays.
  • the formulations can be readily prepared according to conventional methods in the art and include surfactants, excipients, hydrating agents, emulsifiers, suspending agents, salts or buffers for controlling osmotic pressure, colorants, spices, stabilizers, preservatives, preservatives or Other commercially available auxiliaries can be used as appropriate.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention will vary depending on the age, sex, weight, pathology and severity of the subject to be administered, the route of administration or the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one skilled in the art, the daily dosage of which is for example from 0.1 mg / kg / day to 5000 mg / kg / day, more specifically from 50 mg / kg / day to 500 mg / kg May be, but is not limited to.
  • Lactobacillus plantarum APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269, as of March 28, 2011, are located at the Korea Microbiological Conservation Center located at 361-221 Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea. of Microorganisms) were deposited with microbial accession numbers KCCM11179P, KCCM11180P, KCCM11181P and KCCM11182P, respectively.
  • tea leaves 200g are washed twice with distilled water to remove foreign substances. Drain the washed tea leaves and mix with salt equivalent to 8% of tea leaves weight and leave at room temperature for 3 hours.
  • the salted tea leaves are mixed with 1000 mL of a 1% fructo oligosaccharide solution and incubated in a 32 ° C. incubator for 3 days. Three days confirmed that the pH of the culture solution drop to less than 5 and less than pH 5 after taking them deep nose galactosidase is cultured in MRS agar Bashile ® (Difco Lactobacilli MRS Agar ®) medium. At this time, the culture takes 32 days, incubated in an anaerobic chamber for 2 days, and takes colonies showing white colonies.
  • MRS agar Bashile ® Difco Lactobacilli MRS Agar ®
  • Lactobacillus plantarum APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 were isolated from the leaves of the tea tree.
  • APsulloc 331263 isolated in Example 1 was streaked on an MRS agar plate and incubated at 37 ° C. for 2 days. A single colony obtained was inoculated in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 ° C. to prepare a Lactobacillus plantarum strain culture. Lactobacillus plantarum strain cultures are prepared in substantially the same manner for APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269, respectively.
  • APsulloc 331261 strain culture solution prepared as in (1) was inoculated with 0.5% of 10 mL MRS broth and incubated overnight at 37 ° C. The culture solution was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, only the cells were collected, and suspended by adding 2 mL of 0.85% saline buffer. Since the API 50CHL kit (Biomerieux) was used according to the manufacturer's protocol. The details are as follows.
  • the suspension amount of the strain was gradually added to 5 mL of API suspension medium (MecFarland Standard 2) (Biomerieux) to measure the amount of suspension required for turbidity. Two times the amount of the measured suspension was added to 10 mL of API 50CHL medium, followed by shaking. After the mixture was placed in a cupule containing different substrates, mineral oil was dropped one by one, incubated at 37 ° C. for 2 days, and then the sugar fermentation pattern was analyzed. The sugar fermentation patterns were analyzed in substantially the same manner for strain cultures of APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269, respectively.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum) match degree (% index) is indicated by more than 99% Lactobacillus Planta room (Lactobacillus plantarum) for You can see that belongs to.
  • APsulloc 331261 has different properties of ⁇ -methyl-mannoside and raffinose
  • APsulloc 331263 is ⁇ -methyl-mannoside
  • raffinose and D- D-turanose uses different properties
  • APsulloc 331266 has different properties of ⁇ -methyl-mannoside and raffinose
  • APsulloc 331269 uses L-arabinose and raffinose. Because of their different properties, they can be confirmed that they are all different from the standard strain.
  • APsulloc 331261 strain culture solution prepared as in (1) was inoculated with 0.5% of 10 mL MRS broth and incubated overnight at 37 ° C. The culture solution was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, only the cells were collected, and suspended by adding 2 mL of 0.85% saline buffer. Thereafter, using the API ZYM kit (Biomerieux) was performed according to the manufacturer's protocol. The details are as follows.
  • the suspension amount of the strain was gradually added to 5 mL of API suspension medium (MecFarland Standard 2) (Biomerieux) to measure the amount of suspension required for turbidity. Two times the measured amount of suspension was added to 10 mL of API 50CHL medium, followed by shaking. 65 ⁇ l of the mixture was added to each cupule and incubated at 37 ° C. for 4 hours. ZYM A reagent and ZYM B reagent were dropped one drop into each Kupul, and after 5 minutes, scored from 0 to 5 according to the intensity of color, and 3 or more was determined as positive.
  • API suspension medium MecFarland Standard 2
  • ZYM A reagent and ZYM B reagent were dropped one drop into each Kupul, and after 5 minutes, scored from 0 to 5 according to the intensity of color, and 3 or more was determined as positive.
  • Enzyme activity patterns were analyzed for APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 strain cultures in substantially the same manner.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 are all standard strains (KCTC3108), acid phosphatease, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase (Naphthol-AS-). There were differences in the enzymatic activity of BI-phosphohydrolase, ⁇ -galactosidase and N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase. Therefore, it can be seen that APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 are all different from the standard strain.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 are also known as ⁇ -glucuronidase ( ⁇ -), which is known to be one of the representative carcinogenic enzymes that can induce cancer by acting on carcinogens in the intestine and transforming them into carcinogens. negative for glucuronidase) activity.
  • ⁇ - ⁇ -glucuronidase
  • APsulloc 331263 inhibits the activity of ⁇ -glucosidase. Therefore, it can be seen that APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 may all be used in food compositions.
  • Antibiotic resistance was evaluated in the same manner for APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 strain cultures, respectively.
  • Antibiotic susceptibility assessment disc concentrations and criteria are shown in the table below.
  • Antimicrobial resistance evaluation results of APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 compared to Lactobacillus plantarum strain (KCTC3108) as standard strains are as follows. Table 11: APsulloc 331261 and APsulloc 331263, Table 12: APsulloc 331266 and APsulloc 331269.
  • the standard strain (KCTC3108) and APsulloc 331261 showed differences in the antibiotic resistance patterns of ceftazidime, clindamycin, and nitrofurantoin, and APsulloc 331263 was ceftazidime. (ceftazidime) and nitrofurantoin showed differences in antibiotic resistance patterns.
  • the standard strain (KCTC3108) and APsulloc 331266 showed differences in antibiotic resistance patterns of ceftazidime, nitrofurantoin and peniciilin, while APsulloc 331269 cefazidime and clindamycin Clindamycin, nitrofurantoin and peniciilin showed differences in antibiotic resistance patterns. Therefore, it can be seen that APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 are all different from the standard strain.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 all belong to the Lactobacillus plantarum and differ from the Lactobacillus plantarum standard strain (KCTC3108). It can be seen that the new strain.
  • APsulloc 331261 strain culture was inoculated in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 ° C. The pH was adjusted to 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 with HCl, and then, 50 ⁇ l of the culture solution was inoculated into 5 mL of sterilized MRS broth, followed by incubation at 37 ° C. for 1 hour. One hour later, the cells were diluted with peptone saline buffer to measure the number of bacteria per mL. After measuring the number of bacteria in the culture solution was multiplied by 0.01 as a control (Control), the survival rate was calculated by the control bacteria as 100%.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all showed higher survival than standard strains at pH 2.5 to 3.5. That is, it can be seen that the Lactobacillus plantarum has excellent acid resistance. Considering the pH of the stomach when the food intake is 2-3, it can be seen that the survival rate of the stomach will be high if the Lactobacillus plantarum is included in the food composition.
  • APsulloc 331261 culture was inoculated 0.5% in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 °C. After inoculating 50 ⁇ l of the culture solution adjusted to pH 2.5 with HCl to 5 mL of sterilized MRS broth, the cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours. After 1 and 3 hours, the cells were diluted with peptone saline buffer and the number of bacteria per mL was measured. After measuring the culture number of the culture medium was multiplied by 0.01 as a control (control), the control cell was counted to 100% survival rate.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all have a higher survival rate than the standard strain even after 1 hour and 3 hours at pH 2.5. That is, the Lactobacillus plantarum strains can be confirmed that all have excellent acid resistance for a long time. Considering that the average gastric residence time is 1 to 3 hours when the food is ingested, it can be seen that if the Lactobacillus plantarum strains are included in the food composition, the survival rate will be high even during gastric residence.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 are all able to survive the low pH of the stomach during the residence period of the stomach, so they can survive in the stomach when consumed as food, furthermore, the intestinal reach rate is high.
  • APsulloc 331261 culture was inoculated 0.5% in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 °C. Ox bile (ox gall) was added 0.3% and 0.5% respectively to prepare a MRS agar plate. As a control, MRS agar without ox bile was used. The strain culture solution was diluted and incubated for 2 days at 37 ° C. after smearing in MRS agar medium. After counting each colony, the survival rate (%) of APsulloc 331261 was calculated using the control cell number as 100%.
  • strain cultures of APsulloc 331263, APsulloc 331266, and APsulloc 331269 were also evaluated for bile acid performance in substantially the same manner, respectively, and the results are shown in the table below.
  • APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all showed excellent bile acid resistance. Since strains with excellent bile acid capacity are known to have excellent intestinal fixation ability, it can be seen that APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all have excellent intestinal fixation ability and intestinal reach rate.
  • APsulloc 331261 culture was inoculated 0.5% in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 °C. The culture was centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes to recover only the supernatant. The recovered supernatant was treated at 80 ° C. for 15 minutes to stop the enzyme reaction. The supernatant heat-treated with distilled water was diluted 100 times. D-lactic acid / L-lactic acid UV method kit (R-biopharm) was used according to the manufacturer's protocol. The details are as follows.
  • kit solution 1 glyciglycine buffer / L-glutamate
  • solution 2 NAD solution
  • GPT suspension solution 3 0.02 mL
  • 0.1 mL each of the supernatant prepared above was added to the cuvette.
  • 1 mL of tertiary distilled water and 0.9 mL of tertiary distilled water were added to the control group.
  • the absorbance (A1) was measured at 340 nm after 5 minutes.
  • 0.02 mL of D-LDH solution 4 each, the mixture was mixed well and reacted for 30 minutes, and the absorbance (A2) was measured at 340 nm.
  • strain cultures of APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 were also evaluated for the lactic acid production ability in substantially the same manner, respectively, and the results are shown in the table below.
  • APsulloc 331263, APsulloc 331266 and APsulloc 331269 all produced both D-lactic acid and L-lactic acid.
  • the total amount of lactic acid produced was lower than that of the standard strain, and the ratio of D-lactic acid in the produced lactic acid was small. Therefore, the food containing the Lactobacillus plantarum strains can be freely ingested even adults and infants vulnerable to lactic acid, the food may have a softer taste when fermenting the food using the Lactobacillus plantarum strains.
  • APsulloc 331261 culture was inoculated 0.5% in 10 mL of MRS broth and incubated overnight at 37 °C. After sterile MRS agar was dispensed into 15 mL petri dishes, 1 ⁇ l of the APsulloc 331261 culture solution was added dropwise, and then cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • Shigella flexneri Shigella flexneri
  • Tryptic soy agar Tryptic soy agar
  • BHI soft agar agar 1%) was sterilized and cooled to 45 ⁇ 50 °C and then inoculated with Shigella flexneri (1% Shigella flexneri ) culture.
  • Shigella flexneri culture was hardened by stacking 10 mL of the culture on the APsulloc331261 medium. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, the size of the clear zone was measured. The results of comparing Lactobacillus plantarum strain (KCTC3108) as a standard strain are shown in the table below.
  • APsulloc 331261 can be confirmed that the antibacterial effect on Shigella flexneri ( Shigella flexneri ) than the standard strain.
  • APsulloc 331266 culture was inoculated 0.5% in 10 mL MRS broth overnight incubation at 37 °C.
  • BHI soft agar (agar 1%) was sterilized and cooled to 45 ⁇ 50 °C and then inoculated with 1% of Listeria monocytogenes and Bacillus cereus culture. Petri dishes were dispensed in 15 mL and cooled for 1 hour to prepare a medium. Sterilized MRS soft agar (1% agar) was layered and solidified on the prepared medium by 5 mL. APsulloc 331266 culture solution was added dropwise to the cultured medium and 5 ⁇ l each was dried. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, the size of the clear zone was measured. The results of comparing Lactobacillus plantarum strain (KCTC3108) as a standard strain are shown in the table below.
  • APsulloc 331266 can be confirmed that the antibacterial effect against Listeria monocytogenes and Bacillus cereus than the standard strain.
  • APsulloc 331269 culture was inoculated 0.5% in 10mL MRS broth overnight incubation at 37 °C. The culture solution was centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes and only the supernatant was recovered. 10 mL of the supernatant was prepared by sterilization with a 0.22 ⁇ L syringe filter.
  • Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), and stapling Pyrococcus fringing mouse (Staphylococcus aureus), each Tryptic Soy agar and plated on (Tryptic soy agar) after overnight incubation at 37 °C inoculated colonies on BHI broth overnight Incubated.
  • BHI agar was sterilized and put in 20 mL of Petri dishes to cool to prepare a medium.
  • Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus cultures were diluted 50-fold with sterile physiological saline and then evenly spread on the prepared medium with a sterile swab.
  • the sterile paper discs were raised and 100 ⁇ l of the APsulloc 331269 culture supernatant prepared above was dropped onto the paper discs. After standing at room temperature for about 3 hours to be absorbed and incubated at 37 °C 24 hours. The size of the clear zone was measured, and the results of comparing Lactobacillus plantarum strain (KCTC3108) as a standard strain are shown in the table below.
  • APsulloc 331269 can be confirmed that the antibacterial effect against Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus than the standard strain.

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Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 개시한다. 또한 본 발명은 상기 신규 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물을 개시한다.

Description

차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸
본 발명은 차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸에 관한 것이다.
마시는 용도의 차는 동백나무과의 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 싹이나 잎 속에 존재하는 산화 효소를 불활성화하고 수분을 제거한 것이다. 이러한 차는 비타민을 비롯하여 카페인, 탄닌, 플라보노이드 및 정유 등을 함유하고, 식품 분야를 예로 들 수 있는 다양한 분야에서 널리 활용되고 있다.
본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공하고자 한다. 또한 상기 신규 락토바실러스 플란타룸 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331263 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331266 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331269 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상 또는 그 배양액을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 락토바실러스 플란타룸 균주는 내산성이 우수하므로 이를 식품으로 섭취시 위(胃)에서도 생존 가능하며, 나아가 장내 도달률이 높을 수 있다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 내담즙산능이 우수하므로, 장내 정착력이 뛰어나다. 또한 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 항균력이 뛰어나므로 유해 세균 억제 효과가 우수하다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 생성한 락트산 중 D-락트산의 비율이 기존 락토바실러스 플란타룸에 비해 낮으므로, 락트산에 취약한 성인 또는 영유아도 자유롭게 섭취 가능하다. 그리고 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 기존 락토바실러스 플란타룸에 비해 적은 양의 락트산을 생성하므로, 이를 이용하여 식품을 발효시키는 경우 식품은 부드러운 맛을 가지게 된다. 따라서 본 발명에 따른 신규 락토바실러스 플란타룸 균주는 식품 분야를 예로 들 수 있는 다양한 분야에서 널리 활용될 수 있다.
유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 락트산(lactic acid)을 생성하는 세균을 가리키며, 젖산균이라고도 한다. 유산균의 락트산 발효에 의해 생성되는 락트산은 병원균과 유해 세균의 생육을 저지할 수 있으며, 이러한 성질은 유제품, 김치류, 양조 식품 등의 식품 제조에 이용되고 있다. 또한 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상 발효를 방지하므로 정장제(整腸劑)로도 이용되는 중요한 세균이다.
락토바실러스 플란타룸은 유산균에 속하는 균주로 주로 김치의 발효가 많이 진행되어 신맛이 날 때 생장한다고 알려져 있다. 생성하는 락트산의 광학이성체는 D형과 L형이다. 락토바실러스 플란타룸은 발효가 필요한 각종 식품에 널리 이용될 수 있으므로, 내산성능, 내담즙산능 및 항균력이 우수한 락토바실러스 플란타룸이 개발된다면, 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261(기탁번호: KCCM11179P) 균주를 제공한다. 본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331263(기탁번호: KCCM11180P) 균주를 제공한다. 본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266(기탁번호: KCCM11181P) 균주를 제공한다. 본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331269(기탁번호: KCCM11182P) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269 중 하나 이상은 차나무(Camellia sinensis) 잎에서 분리한 균주로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 차나무 잎을 차나무 잎 중량 대비 5 내지 15 중량%의 식염으로 절이는 단계; 절인 차나무 잎을 0.1% 내지 3 %의 프락토 올리고당을 예로 들 수 있는 당 용액과 혼합하여 25 내지 35℃에서 1 내지 5일간 배양하는 단계; 및 pH 5 미만으로 된 배양액을 취하여 25 내지 35℃ 혐기 조건에서 1 내지 5일간 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 분리할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269 중 하나 이상은 우수한 내산성능을 가진다. 락토바실러스 플란타룸을 예로 들 수 있는 유산균을 생균제로 섭취하는 경우, 유산균 특유의 효과를 발휘하기 위해서는 장(腸)내 도달률이 높은 것이 바람직하다. 장내 도달률이 높기 위해서는 먼저 위산 분비로 인해 pH가 낮은 위(胃)에서의 생존률이 높아야 한다. 위의 공복시 pH는 1.2~2 정도이나, 음식물을 섭취한 경우 pH는 약 2~3 정도인 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 pH 2 초과 내지 4, 구체적으로 pH 2 초과 내지 3.5 또는 pH 2.5 내지 4, 더 구체적으로 pH 2.5 내지 3.5, 보다 더 구체적으로 pH 2.5 내지 3에서 우수한 내산성능을 가진다. 한편, 음식물을 섭취하는 경우 음식물의 평균 위 체류 시간은 1 내지 3시간 정도로 알려져 있다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 0.5시간 내지 5시간, 구체적으로 1시간 내지 4시간 동안 pH 2 초과 내지 4, 구체적으로 pH 2 초과 내지 3.5 또는 pH 2.5 내지 4, 더 구체적으로 pH 2.5 내지 3.5, 보다 더 구체적으로 pH 2.5 내지 3에서 우수한 내산성능을 가진다. 따라서 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 위 체류 기간 동안 위의 낮은 pH에서도 생존 가능하므로 식품으로 섭취시 장내 도달률이 높다.
본 발명의 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 우수한 내담즙산능을 가진다. 위를 통과한 음식물은 소장으로 전달되고, 이때 담즙산이 분비되어 음식물의 소화를 돕는다. 담즙산에 대한 내성이 높은 균주는 장내 정착력도 좋은 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 내담즙산능이 우수하므로 장내 정착력이 뛰어나다.
본 발명의 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 락트산 생성능을 가진다. 일반적으로 유산균이 생성하는 락트산에는 L-형과 D-형이 있다. 이 중 D-락트산은 체내 대사 속도가 L-락트산에 비해 느리므로 혈중 D-락트산의 농도가 높아지면 락트산 중독증을 유발할 수 있다. 따라서, 락트산에 취약한 성인이나, 영유아는 가급적 D-락트산을 다량 생성하는 유산균을 섭취하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 생성한 락트산 중 D-형이 75% 이하, 구체적으로 70% 이하, 더 구체적으로 65% 이하인 락트산을 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 17.5 g/L 이하, 구체적으로 17 g/L 이하, 더 구체적으로 16.5 g/L 이하, 보다 더 구체적으로 15 g/L 이하, 보다 더 구체적으로 14.5 g/L 이하, 보다 더 구체적으로 14 g/L 이하, 보다 더 구체적으로 13.5 g/L 이하의 락트산을 생성할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주는 기존의 락토바실러스 플란타룸보다 D형의 비율이 낮은 락트산을 생성하므로 락트산에 취약한 성인이나 영유아도 자유롭게 섭취 가능하다. 또한 락트산 생성량도 기존의 락토바실러스 플란타룸보다 낮으므로 이를 이용하여 식품을 발효시키는 경우 식품이 좀 더 부드러운 맛을 가질 수 있다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상의 추출물 또는 배양액을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상, 그 추출물 또는 그 배양액을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상, 그 추출물 또는 그 배양액을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강 식품 조성물일 수 있으며, 다(茶)류, 유제품류, 김치류, 양조 식품류를 예로 들 수 있는 발효가 필요한 발효 식품 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 환제, 연질 및 경질 캅셀제, 과립제, 드링크제, 캐러멜, 다이어트바, 티백 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 락토바실러스 플란타룸 105 내지 1013 CFU/일, 보다 구체적으로는 106 내지 1010 CFU/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상, 그 추출물 또는 그 배양액을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~5 중량%, 구체적으로 0.01~3 중량%일 수 있다.
본 발명의 일측면은 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261 균주, APsulloc 331263 균주, APsulloc 331266 균주 및 APsulloc 331269 균주 중 하나 이상, 그 추출물 또는 그 배양액을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 과민성 장 증후군, 변비, 설사 등을 예로 들 수 있는 장 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 2011년 3월 28일자로 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩에 위치한 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 각각 미생물 기탁번호 KCCM11179P, KCCM11180P, KCCM11181P 및 KCCM11182P로 기탁되었다.
(1) 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331261
기탁기관명: 한국미생물보존센터(국내)
수탁번호: KCCM11179P
수탁일자: 2011.03.28
(2) 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331263
기탁기관명: 한국미생물보존센터(국내)
수탁번호: KCCM11180P
수탁일자: 2011.03.28
(3) 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331266
기탁기관명: 한국미생물보존센터(국내)
수탁번호: KCCM11181P
수탁일자: 2011.03.28
(4) 락토바실러스 플란타룸 APsulloc 331269
기탁기관명: 한국미생물보존센터(국내)
수탁번호: KCCM11182P
수탁일자: 2011.03.28
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명에 따른 신규 락토바실러스 플란타룸 균주들의 분리 방법, 동정 방법 및 특성을 상세하게 설명한다. 하지만 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 분리
차나무 잎 200g을 1차 증류수에 2회 세척하여 이물질을 제거한다. 세척한 차나무 잎의 물기를 털어내고 차나무 잎 중량의 8%에 해당하는 식염과 혼합한 후 3시간 동안 실온에 방치한다. 식염에 절여진 차나무 잎을 1% 프락토 올리고당 용액 1000 mL에 혼합한 후 3일간 32℃ 인큐베이터에서 배양한다. 3일 후 배양액의 pH가 5 미만으로 떨어졌는지 확인하고 pH 5 미만인 경우 이를 취해 디프코 락토바실리 MRS 아가®(Difco Lactobacilli MRS Agar®) 배지에 배양한다. 이때 배양은 32℃, 혐기 조건의 챔버에서 2일간 배양한 후 백색 집락을 보이는 콜로니를 취한다.
위와 같은 방법으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269 각각을 차나무 잎에서 분리하였다.
[실시예 2] 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주들의 동정
(1) 균주의 배양
실시예 1에서 분리한 APsulloc 331263을 MRS 아가 플레이트에 도말(streaking)하고 37℃에서 2일간 배양한다. 얻은 단일 콜로니(single colony)를 MRS 브로쓰(broth) 10mL에 접종하고 다시 37℃에서 밤새 배양하여 락토바실러스 플란타룸 균주 배양액을 제조한다. APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 락토바실러스 플란타룸 균주 배양액을 제조한다.
(2) 락토바실러스 플란타룸 균주의 당 발효 패턴 분석
상기 (1)과 같이 제조한 APsulloc 331261 균주 배양액을 MRS 브로쓰 10mL에 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm에서 5분간 원심 분리하고 상등액을 제거하여 균체만 모은 후, 0.85% 완충 식염수(saline buffer)를 2mL 첨가하여 현탁하였다. 이후 API 50CHL 키트(Biomerieux)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 구체적인 내용은 아래와 같다.
먼저 API 현탁 미디움(medium) 5mL에 균주의 현탁액을 조금씩 넣으면서 맥파랜드 기준 2(McFarland Standard 2)(Biomerieux) 정도의 탁도가 되는데 필요한 현탁액 량을 측정하였다. 측정된 현탁액 량의 2배를 API 50CHL 미디움 10mL에 넣은 후 흔들어 섞어주었다. 각기 다른 기질이 들어있는 쿠풀(cupule)에 상기 혼합물을 넣은 후, 미네랄 오일을 한방울씩 떨어뜨리고 37℃에서 2일간 배양한 다음, 당 발효 패턴을 분석하였다. APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 당 발효 패턴을 분석하였다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 당 발효 패턴 결과 및 그 결과를 이용한 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 동정 결과는 아래 표와 같다. 표 1: APsulloc 331261 표 2: APsulloc 331263, 표 3: APsulloc 331266 및 표 4: APsulloc 331269.
표 1
기질 KCTC3108 APsulloc 331261 기질 KCTC3108 APsulloc 331261
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
대조군 - - - - 에세쿨린 + + + +
글리세롤 - - - - 살리신 + + + +
에리스리톨 - - - - 셀로비오스 ? + + +
D-아라비노스 - - - - 말토스 + + + +
L-아라비노스 + + + + 락토스 + + + +
리보스 + + + + 멜리비오스 + + + +
D-자일로스 - - - - D-사카로스(수크로스) + + + +
L-자일로스 - - - - 트레할로스 + + + +
아도니톨 - - - - 이눌린 - - - -
β-메틸-D-자일로스 - - - - 멜레치토스 + + + +
갈락토스 + + + + 라피노스 - - + +
글루코스 + + + + 아미돈(전분) - - - -
프럭토스 + + + + 글리코겐 - - - -
만노스 + + + + 자일리톨 - - - -
소르보스 - - - - 겐티오비오스 - - + +
람노스 - - - - D-튜라노스 + + + +
덜시톨 - - - - D-릭소스 - - - -
이노시톨 - - - - D-타가토스 - - - -
만니톨 + + + + D-퓨코스 - - - -
소르비톨 + + + + L-퓨코스 - - - -
α-메틸-D-만노사이드 ? + - - D-아라비톨 ? - ? -
α-메틸-D-글루코사이드 - - - - L-아라비톨 - - - -
N-아세틸-글루코사민 + + + + 글루콘산 ? + ? +
아미그달린 + + + + 2-케토글루코네이트 - - - -
알부틴 + + + + 5-케토글루코네이트 - - - -
표 2
기질 KCTC3108 APsulloc 331263 기질 KCTC3108 APsulloc 331263
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
대조군 - - - - 에세쿨린 + + + +
글리세롤 - - - - 살리신 + + + +
에리스리톨 - - - - 셀로비오스 ? + + +
D-아라비노스 - - - - 말토스 + + + +
L-아라비노스 + + + + 락토스 + + + +
리보스 + + + + 멜리비오스 + + + +
D-자일로스 - - - - D-사카로스 (수크로스) + + + +
L-자일로스 - - - - 트레할로스 + + + +
아도니톨 - - - - 이눌린 - - - -
β-메틸-D-자일로스 - - - - 멜레치토스 + + + +
갈락토스 + + + + 라피노스 - - ? +
글루코스 + + + + 아미돈(전분) - - - -
프럭토스 + + + + 글리코겐 - - - -
만노스 + + + + 자일리톨 - - - -
소르보스 - - - - 겐티오비오스 - - + +
람노스 - - - - D-튜라노스 + + - -
덜시톨 - - - - D-릭소스 - - - -
이노시톨 - - - - D-타가토스 - - - -
만니톨 + + + + D-퓨코스 - - - -
소르비톨 + + + + L-퓨코스 - - - -
α-메틸-D-만노사이드 ? + - - D-아라비톨 ? - - -
α-메틸-D-글루코사이드 - - - - L-아라비톨 - - - -
N-아세틸-글루코사민 + + + + 글루콘산 ? + + +
아미그달린 + + + + 2-케토글루코네이트 - - - -
알부틴 + + + + 5-케토글루코네이트 - - - -
표 3
기질 KCTC3108 APsulloc 331266 기질 KCTC3108 APsulloc 331266
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
대조군 - - - - 에세쿨린 + + + +
글리세롤 - - - - 살리신 + + + +
에리스리톨 - - - - 셀로비오스 ? + + +
D-아라비노스 - - - - 말토스 + + + +
L-아라비노스 + + + + 락토스 + + + +
리보스 + + + + 멜리비오스 + + + +
D-자일로스 - - - - D-사카로스 (수크로스) + + + +
L-자일로스 - - - - 트레할로스 + + + +
아도니톨 - - - - 이눌린 - - - -
β-메틸-D-자일로스 - - - - 멜레치토스 + + + +
갈락토스 + + + + 라피노스 - - + +
글루코스 + + + + 아미돈(전분) - - - -
프럭토스 + + + + 글리코겐 - - - -
만노스 + + + + 자일리톨 - - - -
소르보스 - - - - 겐티오비오스 - - + +
람노스 - - - - D-튜라노스 + + + +
덜시톨 - - - - D-릭소스 - - - -
이노시톨 - - - - D-타가토스 - - - -
만니톨 + + + + D-퓨코스 - - - -
소르비톨 + + + + L-퓨코스 - - - -
α-메틸-D-만노사이드 ? + - - D-아라비톨 ? - - -
α-메틸-D-글루코사이드 - - - - L-아라비톨 - - - -
N-아세틸-글루코사민 + + + + 글루콘산 ? + + +
아미그달린 + + + + 2-케토글루코네이트 - - - -
알부틴 + + + + 5-케토글루코네이트 - - - -
표 4
기질 KCTC3108 APsulloc 331269 기질 KCTC3108 APsulloc 331269
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
대조군 - - - - 에세쿨린 + + + +
글리세롤 - - - - 살리신 + + + +
에리스리톨 - - - - 셀로비오스 ? + + +
D-아라비노스 - - - - 말토스 + + + +
L-아라비노스 + + - - 락토스 + + + +
리보스 + + + + 멜리비오스 + + + +
D-자일로스 - - + + D-사카로스 (수크로스) + + + +
L-자일로스 - - - - 트레할로스 + + + +
아도니톨 - - - - 이눌린 - - - -
β-메틸-D-자일로스 - - - - 멜레치토스 + + + +
갈락토스 + + + + 라피노스 - - + +
글루코스 + + + + 아미돈(전분) - - - -
프럭토스 + + + + 글리코겐 - - - -
만노스 + + + + 자일리톨 - - - -
소르보스 - - - - 겐티오비오스 - - + +
람노스 - - - - D-튜라노스 + + + +
덜시톨 - - - - D-릭소스 - - - -
이노시톨 - - - - D-타가토스 - - - -
만니톨 + + + + D-퓨코스 - - - -
소르비톨 + + + + L-퓨코스 - - - -
α-메틸-D-만노사이드 ? + ? + D-아라비톨 ? - - -
α-메틸-D-글루코사이드 - - - - L-아라비톨 - - - -
N-아세틸-글루코사민 + + + + 글루콘산 ? + ? +
아미그달린 + + + + 2-케토글루코네이트 - - - -
알부틴 + + + + 5-케토글루코네이트 - - - -
+: 기질 분해, -: 해당 기질을 분해하지 못 함, ?: 판정 불가
표 5
균주 종속명 % 인덱스 T 인덱스
KCTC 락토바실러스 플란타룸 99.9 0.8
3108 락토바실러스 펜토수스 0.1 0.29
APsulloc 331261 락토바실러스 플란타룸 99.4 0.99
락토바실러스 펜토수스 0.4 0.71
APsulloc 331263 락토바실러스 플란타룸 98.9 0.97
락토바실러스 펜토수스 0.7 0.71
APsulloc 331266 락토바실러스 플란타룸 99.4 0.99
락토바실러스 펜토수스 0.4 0.71
APsulloc 331269 락토바실러스 플란타룸 99.4 0.79
락토바실러스 펜토수스 0.5 0.51
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 대한 일치도(% index)가 99% 이상으로 나타나 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속하는 것을 알 수 있다.
또한 표준 균주(KCTC3108)와, APsulloc 331261은 α-메틸-만노사이드(mannoside) 및 라피노스(raffinose) 이용 성질이 다르고, APsulloc 331263은 α-메틸-만노사이드(mannoside), 라피노스(raffinose) 및 D-튜라노스(D-turanose) 이용 성질이 다르며, APsulloc 331266은 α-메틸-만노사이드(mannoside) 및 라피노스(raffinose) 이용 성질이 다르고, APsulloc 331269는 L-아라비노스(L-arabinose) 및 라피노스(raffinose) 이용 성질이 달라 이들은 모두 표준 균주와 다른 균주임을 확인할 수 있다.
(3)락토바실러스 플란타룸 균주의 효소 활성 패턴 분석
상기 (1)과 같이 제조한 APsulloc 331261 균주 배양액을 MRS 브로쓰 10mL에 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm에서 5분간 원심 분리하고 상등액을 제거하여 균체만 모은 후, 0.85% 완충 식염수(saline buffer)를 2mL 첨가하여 현탁하였다. 이후 API ZYM 키트(Biomerieux)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 구체적인 내용은 아래와 같다.
먼저 API 현탁 미디움(medium) 5mL에 균주의 현탁액을 조금씩 넣으면서 맥파랜드 기준 2(McFarland Standard 2)(Biomerieux) 정도의 탁도가 되는데 필요한 현탁액 량을 측정하였다. 측정된 현탁액 량의 2배를 API 50CHL 미디움 10mL에 넣은 후 흔들어 섞어 주었다. 각 쿠풀(cupule)에 상기 혼합물 65㎕씩 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. ZYM A 시약과 ZYM B 시약을 각각의 쿠풀에 1방울씩 떨어뜨리고 5분 후 색의 강도에 따라 0~5까지 점수를 매긴 다음 3 이상이면 양성으로 판정하였다.
APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 효소 활성 패턴을 분석하였다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 효소 활성 패턴 결과는 아래 표와 같다. 표 6: APsulloc 331261, 표 7: APsulloc 331263, 표 8: APsulloc 331266 및 표 9: APsulloc 331269.
표 6
효소 KCTC3108 APsulloc 331261
스코어 결과 스코어 결과
대조군 0 - 0 -
알칼라인 포스파타아제 0 - 1 -
에스터라아제 1 - 2 -
에스터라아제 리파아제 1 - 2 -
리파아제 0 - 2 -
류신 아릴아미다아제 5 + 4 +
발린 아릴아미다아제 4 + 4 +
크리스틴 아릴아미다아제 1 - 2 -
트립신 0 - 0 -
α- 키모트립신 0 - 1 -
산 포스파티아제 1 - 3 +
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제 1 - 3 +
α- 갈락토시다아제 1 - 3 +
β- 갈락토시다아제 5 + 5 +
β- 글루쿠로니다아제 1 - 2 -
β- 글루코시다아제 3 + 5 +
N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0 - 4 +
α- 만노시다아제 0 - 1 -
α- 푸코시다아제 0 - 1 -
표 7
효소 KCTC3108 APsulloc 331263
스코어 결과 스코어 결과
대조군 0 - 0 -
알칼라인 포스파타아제 0 - 1 -
에스터라아제 1 - 2 -
에스터라아제 리파아제 1 - 2 -
리파아제 0 - 1 -
류신 아릴아미다아제 5 + 4 +
발린 아릴아미다아제 4 + 4 +
크리스틴 아릴아미다아제 1 - 2 -
트립신 0 - 0 -
α- 키모트립신 0 - 1 -
산 포스파티아제 1 - 3 +
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제 1 - 3 +
α- 갈락토시다아제 1 - 3 +
β- 갈락토시다아제 5 + 5 +
β- 글루쿠로니다아제 1 - 2 -
α-글루코시다아제 3 + 2 -
β- 글루코시다아제 3 + 5 +
N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0 - 4 +
α- 만노시다아제 0 - 1 -
α- 푸코시다아제 0 - 1 -
표 8
효소 KCTC3108 APsulloc 331266
스코어 결과 스코어 결과
대조군 0 - 0 -
알칼라인 포스파타아제 0 - 1 -
에스터라아제 1 - 1 -
에스터라아제 리파아제 1 - 1 -
리파아제 0 - 1 -
류신 아릴아미다아제 5 + 4 +
발린 아릴아미다아제 4 + 3 +
크리스틴 아릴아미다아제 1 - 2 -
트립신 0 - 1 -
α- 키모트립신 0 - 1 -
산 포스파티아제 1 - 3 +
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제 1 - 3 +
α- 갈락토시다아제 1 - 3 +
β- 갈락토시다아제 5 + 5 +
β- 글루쿠로니다아제 1 - 2 -
β- 글루코시다아제 3 + 5 +
N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0 - 4 +
α- 만노시다아제 0 - 1 +
α- 푸코시다아제 0 - 0 -
표 9
효소 KCTC3108 APsulloc 331269
스코어 결과 스코어 결과
대조군 0 - 0 -
알칼라인 포스파타아제 0 - 1 -
에스터라아제 1 - 1 -
에스터라아제 리파아제 1 - 1 -
리파아제 0 - 1 -
류신 아릴아미다아제 5 + 4 +
발린 아릴아미다아제 4 + 3 +
크리스틴 아릴아미다아제 1 - 2 -
트립신 0 - 1 -
α- 키모트립신 0 - 1 -
산 포스파티아제 1 - 3 +
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제 1 - 3 +
α- 갈락토시다아제 1 - 3 +
β- 갈락토시다아제 5 + 5 +
β- 글루쿠로니다아제 1 - 2 -
β- 글루코시다아제 3 + 5 +
N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0 - 4 +
α- 만노시다아제 0 - 1 -
α- 푸코시다아제 0 - 0 -
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 표준 균주(KCTC3108)와 산 포스파티아제(Acid phosphatease), 나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N- acetyl-β-glucosaminidase)의 효소 활성 강도에 있어서 차이가 있었다. 따라서 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 표준 균주와 다른 균주임을 알 수 있다.
또한 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 장내에서 발암 전구 물질에 작용하여 발암 물질로 변화시킴으로써 암을 유도할 수 있는 대표적인 발암 효소 중 하나라고 알려져 있는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 활성에 대해 음성으로 판정되었다. 더불어 APsulloc 331263은 α-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 억제한다. 따라서 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 식품 조성물에 활용하여도 무방함을 알 수 있다.
(4) 락토바실러스 플란타룸 균주의 항생제 내성 평가
페트리 디쉬(직경 100mm)에 멸균한 MRS 아가를 20mL씩 넣고 클린벤치에서 식혀 배지를 제조하였다. MRS 브로쓰 10mL에 (1)에서 제조한 APsulloc 331261 균주 배양액을 0.5%로 접종하여 37℃에서 6시간 배양하였다. 625nm에서 흡광도가 0.08~0.13 정도 되도록 희석하였다. 희석액을 멸균한 면봉에 충분히 적신 후 미리 만들어둔 MRS 아가 플레이트에 전체적으로 고르게 도말하였다. 항생제 감수성 평가 디스크를 플레이트 위에 적당한 간격을 두고 떨어뜨렸다. 37℃에서 24시간 배양 후 클린 존(clear zone)의 지름을 측정하였다.
APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 항생제 내성을 평가하였다.
항생제 감수성 평가 디스크 농도 및 평가 기준은 아래 표와 같다.
표 10
항생제 존(zone) 직경 해석
성분명 농도 내성 있음(R) 중간(I) 예민함(S)
암피실린 10㎍ ≤13 14-16 ≥17
세프타지딤 30㎍ ≤14 15-17 ≥18
클로르암페니콜 30㎍ ≤12 13-17 ≥18
시플로플록사신 5㎍ ≤15 16-20 ≥21
클린다마이신 2㎍ ≤14 15-20 ≥21
에리스로마이신 15ug ≤13 14-22 ≥23
겐타마이신 120㎍ ≤6 7-9 ≥10
이미페넴 10㎍ ≤13 14-15 ≥16
스트렙토마이신 10㎍ ≤11 12-14 ≥15
네오마이신 30㎍ ≤12 13-16 ≥17
니트로푸란토인 300㎍ ≤14 15-16 ≥17
페니실린 10U ≤14 - ≥15
폴리믹신 B 300U ≤8 9-11 ≥12
테트라사이클린 30㎍ ≤14 15-18 ≥19
트리메토프림 5㎍ ≤10 11-15 ≥16
반코마이신 30㎍ ≤14 15-16 ≥17
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 항생제 내성 평가 결과는 아래와 같다. 표 11: APsulloc 331261과 APsulloc 331263, 표 12: APsulloc 331266과 APsulloc 331269.
표 11
항생제 KCTC3108 APsulloc 331261 APsulloc 331263
존(mm) 결과 존(mm) 결과 존(mm) 결과
암피실린 29 S 27 S 31 S
세프타지딤 23 S 16 I 15 I
클로르암페닐콜 24 S 24 S 25 S
시플로플록사신 - R - R - R
클린다마이신 12 R 29 S 8 R
에리스로마이신 26 S 25 S 27 S
겐타마이신 20 S 19 S 19 S
이미페넴 39 S 39 S 42 S
스트렙토마이신 - R - R - R
네오마이신 11 R 9 R 9 R
니트로푸란토인 - R 27 S 29 S
페니실린 24 S 18 S 19 S
폴리믹신 B - R - R - R
테트라사이클린 17 I 17 I 17 I
트리메토프림 - R - R - R
반코마이신 - R - R - R
표 12
항생제 KCTC3108 APsulloc 331266 APsulloc 331269
존(mm) 결과 존(mm) 결과 존(mm) 결과
암피실린 29 S 21 S 21 S
세프타지딤 23 S 10 R 10 I
클로르암페닐콜 24 S 22 S 22 S
시플로플록사신 - R - R - R
클린다마이신 12 R 9 R 9 S
에리스로마이신 26 S 28 S 28 S
겐타마이신 20 S 18 S 18 S
이미페넴 39 S 39 S 39 S
스트렙토마이신 - R - R - R
네오마이신 11 R 9 R 9 R
니트로푸란토인 - R 27 S 27 S
페니실린 24 S 12 R 12 R
폴리믹신 B - R - R - R
테트라사이클린 17 I 17 I 17 I
트리메토프림 - R -　 R -　 R
반코마이신 - R -　 R -　 R
R: 내성 있음(resistant), I: 중간(intermediate), S: 예민함 (susceptible)
상기에서 볼 수 있듯이, 표준 균주(KCTC3108)와 APsulloc 331261은 세프타지딤(ceftazidime), 클린다마이신(clindamycin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin)의 항생제 내성 패턴에 있어 차이를 나타냈고, APsulloc 331263은 세프타지딤(ceftazidime), 니트로푸란토인(nitrofurantoin)의 항생제 내성 패턴에 있어 차이를 나타냈다. 표준 균주(KCTC3108)와 APsulloc 331266은 세프타지딤(ceftazidime), 니트로푸란토인(nitrofurantoin) 및 페니실린(peniciilin)의 항생제 내성 패턴에 있어 차이를 나타냈으며, APsulloc 331269는 세프타지딤(ceftazidime), 클린다마이신(clindamycin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin) 및 페니실린(peniciilin)의 항생제 내성 패턴에 있어 차이를 나타냈다. 따라서 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 표준 균주와 다른 균주임을 알 수 있다.
당 발효 패턴, 효소 활성 패턴, 항생제 내성 패턴을 종합적으로 분석할 때 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 락토바실러스 플란타룸에 속하고 락토바실러스 플란타룸 표준 균주(KCTC3108)와 다른 새로운 균주임을 알 수 있다.
[실험예 1] 내산성능 평가
(1) pH 별 내산성능 평가
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331261의 균주 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. HCl로 pH를 각각 2.0, 2.5, 3.0, 3.5로 조정하여 멸균한 MRS 브로쓰 5mL에 상기 배양액 50㎕를 접종한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 펩톤 식염 완충액으로 희석하여 mL당 균수를 측정하였다. 상기 배양액의 균수를 측정한 후 0.01을 곱해준 것을 대조군(Control)으로 하고, 대조군 균수를 100%로 하여 생존율을 계산하였다.
APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 pH 별 내산성능 평가하였다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 내산성능을 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다. 표 13: APsulloc 331261과 APsulloc 331263, 표 14: APsulloc 331266과 APsulloc 331269.
표 13
pH KCTC3108 APsulloc 331261 APsulloc 331263
cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
대조군 2.9x107 100 3.8x107 100 1.9x107 100
2.0 3.0x101 0 1.0x101 0 <101 0
2.5 2.5x107 87.4 3.3x107 87.7 1.4x107 76.6
3.0 3.2x107 110.3 3.7x107 110.3 1.8x107 94.7
3.5 2.8x107 97.7 4.0x107 105.3 1.8x107 93.4
표 14
pH KCTC3108 APsulloc 331266 APsulloc 331269
cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
대조군 2.9x107 100 5.0x107 100 5.0x107 100
2.0 3.0x101 0 <101 0 3.6x102 0
2.5 2.5x107 87.4 6.0x107 118.2 5.6x107 130.7
3.0 3.2x107 110.3 - - 6.5x107 112.7
3.5 2.8x107 97.7 5.8x107 114.2 6.2x107 124.0
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 pH 2.5 내지 3.5에서 표준 균주보다 높은 생존율을 나타내었다. 즉, 상기 락토바실러스 플란타룸들은 우수한 내산성능을 가짐을 확인할 수 있다. 음식물 섭취시 위의 pH가 2 내지 3인 것을 고려할 때, 상기 락토바실러스 플란타룸들이 식품 조성물에 포함되면 위에서의 생존율이 높을 것임을 알 수 있다.
(2) 시간별 내산성능 평가
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331261 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 멸균한 MRS 브로쓰 5mL에 HCl로 pH를 2.5로 조정한 배양액 50㎕를 접종한 후 37℃에서 3시간 배양하였다. 1시간 및 3시간 후 펩톤 식염 완충액으로 희석한 다음 mL당 균수를 측정하였다. 상기 배양액의 균수를 측정한 후 0.01을 곱해준 것을 대조군(control)으로 하고, 대조군 균수를 100%로 하여 생존율을 계산하였다.
APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 시간별 내산성능을 평가하였다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 내산성능을 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다. 표 15: APsulloc 331261과 APsulloc 331263, 표 16: APsulloc 331266과 APsulloc 331269.
표 15
시간 KCTC3108 APsulloc 331261 APsulloc 331263
(시) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
0 3.3x107 100 6.8x107 100 3.4x107 100
1 2.9x107 86.9 6.6x107 98 2.9x107 87.2
3 2.2x107 67.3 6.4x107 94.6 2.7x107 79.9
표 16
시간 KCTC3108 APsulloc 331266 APsulloc 331269
(시) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
0 3.3x107 100 6.2x107 100 7.1x107 100
1 2.9x107 86.9 5.7x107 91.4 7.6x107 107.1
3 2.2x107 67.3 5.8x107 92.5 5.6x107 78.8
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 pH 2.5에서 1시간 및 3시간 후에도 표준 균주보다 높은 생존률을 가짐을 확인할 수 있다. 즉, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주들은 모두 오랜 시간 우수한 내산성능을 가짐을 확인할 수 있다. 음식물 섭취시 평균 위 체류 시간이 1~3시간임을 고려할 때, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주들이 식품 조성물에 포함되면 위 체류 중에도 생존율이 높을 것임을 알 수 있다.
따라서 APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 위 체류 기간 동안 위의 낮은 pH에서도 생존 가능하므로 식품으로 섭취시 위에서 생존 가능하며, 나아가 장내 도달률이 높다.
[실험예 2] 내담즙산능 평가
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331261 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 황소의 담즙(ox gall)을 각각 0.3%, 0.5%씩 첨가하여 MRS 아가 플레이트를 제조하였다. 대조군(control)으로는 황소의 담즙을 첨가하지 않은 MRS 아가를 사용하였다. 상기의 균주 배양액을 희석하여 MRS 아가 배지에 도말 후 37℃에서 2일간 배양하였다. 각 콜로니를 계수한 후 대조군 균수를 100%로 하여 APsulloc 331261의 생존율(%)을 계산한 결과를 아래 표에 나타내었다. APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 내담즙산능을 평가하고, 그 결과를 아래 표에 나타내었다. 표 17: APsulloc 331261과 APsulloc 331266, 표 18: APsulloc 331263과 APsulloc 331269.
표 17
황소 담즙 농도(%) APsulloc 331261 APsulloc 331266
cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
0 3.3x109 100 3.3x109 100
0.3 3.2x109 96.5 3.2x109 96.8
0.5 3.0x109 89 3.0x109 85
표 18
황소 담즙 농도(%) KCTC3108 APsulloc 331263 APsulloc 331269
cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%) cfu/ml 생존율(%)
0 3.3x109 100 3.3x109 100 3.3x109 100
0.3 3.2x109 97 3.2x109 111.9 3.2x109 98.1
0.5 3.0x109 91.9 3.0x109 106.9 3.0x109 95.3
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 우수한 내담즙산성을 나타내었다. 내담즙산능이 뛰어난 균주는 장내 정착력도 우수한 것으로 알려져 있으므로, APsulloc 331261, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 우수한 장내 정착력 및 장내 도달률을 가짐을 알 수 있다.
[실험예 3] 락트산 생성능 평가
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331261 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액만 회수하였다. 회수한 상층액을 80℃에서 15분간 처리하여 효소 반응을 중지시켰다. 증류수로 열처리한 상층액을 100배 희석하였다. D-락트산/L-락트산 UV법 키트(UV method kit)(R-biopharm)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 구체적인 내용은 아래와 같다.
큐벳(cuvette)에 키트 용액 1(kit solution 1)(글라이실글리신 버퍼/L-글루타메이트) 1mL, 용액 2(NAD 용액) 0.2mL, GPT 현탁 용액 3 0.02mL씩을 차례로 첨가하였다. 상기에서 준비한 상층액 0.1mL씩을 큐벳에 첨가하였다. 대조군에는 3차 증류수 1mL를, 시료에는 3차 증류수 0.9mL를 첨가하였다. 잘 섞어준 다음 5분 후에 340nm에서 흡광도(A1)를 측정하였다. D-LDH 용액 4를 0.02mL씩 첨가한 후 잘 섞어주고 30분간 반응시킨 후 340nm에서 흡광도(A2)를 측정하였다. L-LDH 용액 5를 0.02mL씩 첨가한 후 잘 섞어주고 30분간 반응시킨 다음 340nm에서 흡광도(A3)를 측정하였다. 계산법에 따라 시료 내 D-락트산 농도와 L-락트산 농도를 계산하였다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다.
APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269의 균주 배양액에 대해서도 각각 실질적으로 동일한 방법으로 락트산 생성능을 평가하고, 그 결과를 아래 표에 나타내었다. 표 19: APsulloc 331261과 APsulloc 331263, 표 20: APsulloc 331266과 APsulloc 331269.
표 19
락트산 KCTC3108 APsulloc 331261 APsulloc 331263
농도(g/L) 비율(%) 농도(g/L) 비율(%) 농도(g/L) 비율(%)
D 형 11.3 72 8.9 62 9.2 69
L 형 4.3 28 5.5 38 4.2 31
합계 15.6 100 14.4 100 13.4 100
표 20
락트산 KCTC3108 APsulloc 331266 APsulloc 331269
비율(%) 농도(g/L) 비율(%) 농도(g/L) 비율(%)
D 형 72 10.2 62 11.7 69
L 형 28 6.3 38 5.2 31
합계 100 16.5 100 16.9 100
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331263, APsulloc 331266 및 APsulloc 331269는 모두 D-락트산 및 L-락트산을 모두 생성하였다. 또한 표준 균주에 비해 총 락트산 생성량이 적었으며, 생성된 락트산 중 D-락트산의 비율이 적었다. 따라서 상기 락토바실러스 플란타룸 균주들을 포함한 식품은 락트산에 취약한 성인이나 영유아도 자유롭게 섭취할 수 있으며, 락토바실러스 플란타룸 균주들을 이용하여 식품을 발효시키는 경우 식품이 좀 더 부드러운 맛을 가질 수 있다.
[실험예 4] 항균력 평가
(1) APsulloc 331261
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331261 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 멸균한 MRS 아가를 15mL씩 페트리 디쉬에 분주하여 배지 제조 후 상기 APsulloc 331261 배양액을 1㎕씩 점적하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
한편, 시겔라 프렉스네리(Shigella flexneri)를 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후 BHI 브로쓰에 콜로니를 접종하여 밤새 배양하였다. BHI 소프트 아가(아가 1%)를 멸균하여 45~50℃로 식힌 후 시겔라 프렉스네리(Shigella flexneri) 배양액 1%를 접종하였다.
시겔라 프렉스네리(Shigella flexneri) 배양액을 10mL씩 APsulloc331261 배양액 위에 중층하여 굳혔다. 37℃에서 24시간 배양한 후 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하였다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다.
표 21
시험 균주 클리어 존의 직경 (mm)
KCTC no. 균주 KCTC3108 APsulloc 331261
2008 시겔라 프렉스네리 26 27
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331261은 표준 균주보다 시겔라 프렉스네리(Shigella flexneri) 에 대한 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
(2) APsulloc 331266
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331266 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
한편, 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 각각 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후 BHI 브로쓰에 콜로니를 접종하여 밤새 배양하였다.
BHI 소프트 아가(아가 1%)를 멸균하여 45~50℃로 식힌 후 리스테리아 모노사이토젠스 및 바실러스 세레우스 배양액 1%를 각각 접종하였다. 페트리 디시에 15mL씩 분주하고 1시간 정도 식혀 배지를 제조하였다. 멸균한 MRS 소프트 아가(아가 1%)를 5mL씩 상기 제조한 배지 위에 중층하여 굳혔다. 중층하여 굳힌 배지에 APsulloc 331266 배양액을 5㎕씩 점적한 후 건조시켰다. 37℃에서 24시간 배양한 후 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하였다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다.
표 22
시험 균주 클리어 존의 직경 (mm)
KCTC no. 균주 KCTC3108 APsulloc 331266
3710 리스테리아 모노사이토젠스 16.8 19.3
3624 바실러스 세레우스 10.3 12.3
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331266은 표준 균주보다 리스테리아 모노사이토젠스 및 바실러스 세레우스에 대한 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
(3) APsulloc 331269
MRS 브로쓰 10mL에 APsulloc 331269 배양액을 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 상등액만 회수하였다. 상등액 10mL를 0.22㎕ 시린지 필터로 제균하여 준비하였다.
한편, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 스태피로코커스 아레우스(Staphylococcus aureus)를 각각 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후 BHI 브로쓰에 콜로니를 접종하여 밤새 배양하였다.
BHI 아가를 멸균하여 페트리 디시에 20mL씩 넣고 식혀 배지를 제조하였다. 살모넬라 티피무리움 및 스태피로코커스 아레우스 배양액을 멸균 생리 식염수로 50배 희석한 후 멸균한 면봉으로 상기 제조한 배지 위에 고르게 도말하였다. 멸균한 페이퍼 디스크를 올리고 상기 준비한 APsulloc 331269 배양액 상등액을 100㎕씩 페이퍼 디스크 위에 떨어뜨렸다. 실온에서 약 3시간 방치하여 흡수되도록 한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 클리어 존(clear zone)의 크기를 측정하고, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주(KCTC3108)를 표준 균주로 하여 비교한 결과를 아래 표에 나타내었다.
표 23
시험 균주 클리어 존의 직경 (mm)
KCTC no. 균주 KCTC3108 APsulloc 331269
2514 살모넬라 티피무리움 8.8 9.3
1621 스태피로코커스 아레우스 10 10.8
상기에서 볼 수 있듯이, APsulloc 331269는 표준 균주보다 살모넬라 티피무리움 및 스태피로코커스 아레우스에 대한 항균 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[미생물 기탁증]
Figure PCTKR2012004569-appb-I000001
Figure PCTKR2012004569-appb-I000002
Figure PCTKR2012004569-appb-I000003
Figure PCTKR2012004569-appb-I000004
Figure PCTKR2012004569-appb-I000005
Figure PCTKR2012004569-appb-I000006
Figure PCTKR2012004569-appb-I000007
Figure PCTKR2012004569-appb-I000008

Claims (12)

  1. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331261 (기탁번호: KCCM11179P) 균주.
  2. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331263 (기탁번호: KCCM11180P) 균주.
  3. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331266 (기탁번호: KCCM11181P) 균주.
  4. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) APsulloc 331269 (기탁번호: KCCM11182P) 균주.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 차나무(Camellia sinensis) 잎에서 분리된 것임을 특징으로 하는 균주.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 내산성능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 균주는 pH 2 내지 pH 4에서 0.5시간 내지 5시간 동안 내산성능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 내담즙산능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 균주는 락트산(lactic acid) 생성능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 균주는 생성한 락트산 중 D-형이 70% 이하인 락트산 생성능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    조성물은 발효 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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