KR20100099536A - 신선유지를 위한 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 ｄｓｒ ｃｋ10, ｄｓｒ ｍ2 및 이의 용도 - Google Patents

신선유지를 위한 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 ｄｓｒ ｃｋ10, ｄｓｒ ｍ2 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유해 미생물의 생육을 억제하는 식물성 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유해 미생물의 생육을 저해하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2 유산균 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2 또는 이들의 배양물은 식품에 첨가할 경우 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제하여 식품의 신선도를 유지할 수 있고, 저장기간과 유통기간을 효과적으로 연장시킬 수 있는 효과를 제공하며, 정장용, 생균제, 소시지 발효용, 사료용, 항균용, 약학적 조성물 및 발효식품에 유용하게 이용될 수 있다.
식물성 유산균, 락토바실러스 플란타륨, 내산성, 내염성, 내담즙성, 항균제

Description

신선유지를 위한 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 ＤＳＲ ＣＫ10, ＤＳＲ Ｍ2 및 이의 용도{Planted origine Lactobacillus plantarum DSR CK10, DSR M2 to keep freshness and use thereof}
본 발명은 유해 미생물의 생육을 억제하는 식물성 유산균 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유해 미생물의 생육을 저해하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2 및 이의 용도에 관한 것이다.
식품의 원료, 가공, 저장, 유통 중 발생하는 부패성 및 유해 미생물에 의한 오염과 균의 증식 정도는 국민건강은 물론 식품의 보존기간과 부패 유형의 중요한 인자로 작용하며, 이로 인한 식품의 변질을 막기 위해 다양한 방법(가열처리, 냉장, 냉동, 보존제 첨가, 방사선 조사 등)이 이용되고 있다.
이중 식품보존제는 식품의 보존을 목적으로 첨가되는 것으로, 주로 각종 합성보존제를 이용하여 저장기간의 연장을 시도하고 있으나, 살균제, 방부제나 식품보존제들은 체내에 축적되고 해를 입히는 잔류성 문제로 인해 갈수록 인류의 보건 에 치명적이며 생명을 위협하고 있다. 특히 식품의 국제화시대에 있어서 살균제, 소독제 및 식품보존제의 과량 사용은 수출과 수입시 가장 큰 문제로 대두 되고 있다.
따라서, 식품보존을 위해 유해 살균제와 소독제, 식품보존제를 남용함으로 인해 발생할 수 있는 부작용 및 잔류성 문제를 해결하고, 이와 동시에 유해 미생물의 증식으로 인해 발생할 수 있는 식중독의 발병을 감소시킬 수 있는 천연 유해 미생물 생육 억제제가 절실히 요구되고 있다.
인돌, 스케톨, 페놀, 아민 및 암모니아 등의 유해물질은 생산하지 않으면서 인간에게 유익한 젖산을 생산하는 유산균은 동물의 장내에서 가장 많은 밀도로 존재하며, 특히 소화흡수가 일어나는 소장에서 우점균으로 자리 잡고 있다(Barnes, F. M. et.al., Amer. J. Clin. Nutr., 33, 2426-2433, 1980; Salanitro, J. P. et.al., Appl. Environ. Microbiol., 33, 79-84, 1977).
상기 유산균에는 대표적으로 카르노박테리움속(Carnobacterium), 엔테로코커스속(Enterococcus), 락토바실러스속(Lactobacillus), 락토코커스속(Lactococcus), 류코노스톡속(Leuconostoc), 페디오코커스속(Pediococcus), 스트렙토코커스속(Streptococcus), 테트라제노코커스속(Tetragenococcus), 바고코커스속(Vagococcus), 바이쎌라속(Weissella) 및 비피더스속(Bifidobacterium) 균주 등이 포함된다(Stiles, M. E. et.al., Int. J. Food Microbiol., 36, 1-29, 1997). 특히 락토바실러스속 균주는 안전성이 우수하여 여러 연구에 사용되고 있으며 정상적으로 사람을 포함한 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 면역증진작용, 유 해독소의 중화 및 합성차단, 영양분의 소화흡수의 증대 그리고 여러 유익한 생리활성을 나타내는 것으로 이미 잘 알려져 있어 사람은 물론 동물에게도 많이 투여되고 있다.
한편 유해 미생물에는 대표적으로 식중독을 일으키는 살모넬라 속균(Salmonella spp.), 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 장독성 대장균(enterotoxigenic E. coli), 바실러스 세레우스(B.cereus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)가 있으며 특히 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus)는 식중독뿐만 아니라 피부의 화농중이염방광염 등 화농성 질환을 유발하는 세균으로 널리 알려져 있다.
상기 유해 미생물에 의한 감염증을 예방 또는 치료하기 위해 지금까지는 주로 합성 또는 천연 항생제를 사용하였다. 그러나 합성 항생제의 사용은 내성 및 잔류 등의 문제로 사용량에 대한 규제가 엄격한데다 장내 유익한 균총 또한 파괴하기 때문에 정상 균총에 의한 병원성 세균 감염에 대한 예방 효과를 잃게 한다. 또한 천연 항생제로 알칼로이드(alkaloid), 후라보노이드(flavonoid), 피토알렉신(Phytoalexin), 항균 펩타이드, 유기산 및 지방산이 알려져 있지만 대부분은 색취, 안정성 저하, 좁은 항균 스펙트럼 및 제형상의 문제점으로 인하여 상용화되지 못하고 있는 실정이다.
이러한 문제점으로 인하여 상기 유해 미생물에 대한 천연 항균제로 유산균이 크게 각광받을 수 있으나 실질적인 항균효과를 나타내기 위해서는 다음과 같은 특 징들이 요구되는데, 구체적으로 섭취 후 장내의 소화기관들에서 분비되는 여러 물질들을 견뎌낼 수 있는 내산성 및 내담즙성 등을 나타내어 장내 생존력이 우수해야 하며, 낮은 pH, 영양소 소비, 전위차 감소, 과산화수소 생산 및 항균물질 생산(예, 박테리오신) 등에 의한 유해 미생물 억제능이 우수해야 한다. 특히, 유산균을 이용한 항균제는 병원성 세균들의 생육을 저해함과 동시에 여러 가지 문제를 나타내는 항생제 사용량을 낮추며, 인체에 안전하기 때문에 식품 제조 과정에서 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 상기 유해 미생물에 대한 항균효과가 있으며 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 유산균의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 김치는 우리나라 전통 고유의 발효식품으로서 한국인의 장 건강에 기여하는 대표적인 유산균 공급원이다. 최근 들어 김치는 배추와 무 등 김치 재료와 김치발효에 참여하는 여러 유산균의 기능이 복합적으로 나타나 항 돌연변이와 항암 효과 등 여러 유용한 기능들을 보유하고 있다는 것이 알려지면서 1990년대 이후 본격적으로 상품화되어 국내 수요량과 수출량이 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 이러한 김치의 맛을 내기 위한 발효에 관여하는 미생물로는 락토바실러스 플랜타룸(L.plantarum), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 스트렙토코커스(Streptococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 등이 있으며 발효단계에 따라 전체 균총을 형성하는 균의 종류와 구성비율이 변하게 된다.
따라서 최근에는 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치제조시 스타 터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있는데, 대한민국 등록특허 제1989-4894호에 차아염소산나트륨과 류코노스톡 메센테로이드 균주를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법이 개시된 바 있고, 대한민국 등록특허 제0181009호에 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드 균주를 혼합 첨가함으로써 맛이 좋을 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주의 생육을 억제하여 산패가 지연되도록 한 김치의 제조방법이 개시된 바 있다. 그러나 웰빙에 대한 소비자의 요구가 증폭되는 현대 사회에서는 김치의 품질을 향상시키고 건강을 위한 기능성을 부가할 수 있도록 내산성, 내염성, 내담즙성, 항생제 내성 및 항균효과가 있는 새로운 유산균 스타터에 대한 개발이 절실히 요구 되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 유해 미생물의 생육을 억제할 수 있는 신규한 유산균을 한국인의 대표적인 발효식품인 김치에서 찾고자 연구를 거듭하던 중, 유해 미생물의 생육을 억제하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 신규 김치 유산균을 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 유해 미생물의 생육을 억제하고 pH 2.5~5에서 내산성, NaCl 2~15%에서 내염성, 옥스갈(Oxgall) 0.3~3%에서 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하여 유해 미생물의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 유해 미생물의 감염증 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 발효식품을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 스타터(starter)로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물의 생육을 억제하고 pH 2.5~5에서 내산성, NaCl 2~15%에서 내염성, 옥스갈(Oxgall) 0.3~3%에서 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타 륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하여 유해 미생물의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 유해 미생물의 감염증 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 발효식품을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 스타터(starter)로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 유해 미생물의 생육을 억제하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성을 가지는 특징이 있다. 특히, 김치에서 분리한 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2는 유해 미생물인 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E.coli), 바실러스 세레우스(B.cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균의 생육을 억제하는 활성이 있으며, pH 2.5 ~ 5에서 내산성, NaCl 2 ~ 15%에서 내염성 및 옥스갈(oxgall) 0.3 ~ 3%에서 내담즙성을 가지는 특징이 있다(실시예 1-2 내지 1-7 참조).
특히 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 pH 2.5에서 85%이상 생존하여 강한 내산성을 가지고 NaCl 15%에서 90% 이상 생존하여 강한 내염성을 가지며 옥스갈(oxgall) 3%에서 100% 생존율을 보여 강한 내담즙성을 가진다.
본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 내산성, 내염성 및 내담즙성이 우수하기 때문에, 상기 균주를 경구 섭취하면 생체 내의 가혹한 환경, 즉 pH가 3 이하로 내려가는 산성 환경과 위장 및 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙 산에 의해서도 생육이 우수해 장으로 도달할 수 있는 확률이 증가 될 수 있다.
또한 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 항생제 내성이 우수하기 때문에 항생제의 존재하에서도 생육이 가능해 생체 내에서 유익한 기능을 할 수 있다. 즉 장내 유해 미생물의 생육 억제를 위하여 항생제와 병행 사용이 가능하다. 특히 본 발명의 식물성 유산균은 테트라사이클린, 에리트로마이신, 앰피실린, 페니실린, 세파로신로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항생제에 내성이 있는 것으로 나타났다(실시예 1-7 참조).
상기와 같은 유해 미생물의 생육을 억제하고 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 특징을 모두 가지고 있는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 균주는 본 발명에서 처음으로 제공되는 것이다.
따라서 본 발명의 유산균 또는 이의 배양물은 인간 및 동물의 건강증진을 위한 용도, 즉 생균제, 항균용, 사료용, 식품 첨가용 또는 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 락토바실러스 플란타륨의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균 또는 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 유산균의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부 착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 조성물 내 락토바실러스 플란타륨의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.
상기 생균제 조성물이란 동물이나 인간이 섭취시 생체 내에서 생존하는 미생물을 그 구성성분으로 하여 각종 위, 장관련 질환의 예방 및 증상의 개선, 치료를 목적으로 하는 조성물을 말한다.
상기 항균용 조성물이란 미생물의 증식을 저지, 억제 하거나 미생물을 직접 죽이는 활성을 가진 조성물을 말하며 상기 약학적 조성물은 유해 미생물의 감염증의 치료 또는 예방할 수 있는 조성물을 말한다. 상기 유해 미생물은 이에 한정되지는 않지만 구체적으로 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E.coli), 바실러스 세레우스(B.cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균일 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨이 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E.coli), 바실러스 세레우스(B.cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 생육을 억제하는 활성이 있음을 성장 억제환 실험을 통하여 확인하였다(표 2 참조). 한편, 상기 감염증은 상기 유해 미생물의 감염으로 인한 모든 질병을 포함하며 이에 한정되지는 않지만 구체적으로 식중독, 피부의 화농, 중이염, 방광염 등 화농성 질환을 말한다.
본 발명에 따른 생균제, 항균용 또는 약학적 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 플란타륨 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 상기 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 또는 이의 배양물은 김치, 소시지, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품첨가용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 유형의 식품첨가용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 락토바실러스 카제이의 배양물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐 화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 어류, 육류 및 그 가공식품, 또는 채소 및 그 가공식품에 신선도 유지를 위한 첨가물로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 또는 이의 배양물이 신선채소에서 대장균의 증식을 억제하여 선도를 유지하는 활성이 있음을 확인하였다(표 9 참조). 또한 본 발명에서는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 또는 이의 배양물이 동치미 제조에 사용되어 동치미 액이 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E.coli), 바실러스 세레우스(B.cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균에 대하여 생육을 억제하는 활성을 보여 동치미의 신선도를 유지하는 활성을 확인하였으며 더불어 기능성 발효 식품으로서 섭취시 유해 미생물 예방 및 억제 활성이 있는 것을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 발효식품의 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효식품은 치즈, 김치, 발효 소시지, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨을 이용한 발효식품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 또는 이를 포함하는 2 ~ 3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 발효 생식제품을 제조할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 김치를 제조하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨의 배양물을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다. 상기 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨의 배양물은 김치 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 5 중량% 로 첨가하는 것이 바람직하며, 1 중량% 로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨은 발효소시지를 제조하는데 사용할 수 있다. 상기 발효소시지는 일반적으로 알려진 발효소시지 제조 방법에 따라 제조 될 수 있으며 바람직하게는 돈육을 세절한 후 원료육에 후추, 마늘, 로즈메리, 향신료, 식염, 포도당 등을 혼합한 후 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨의 배양물을 첨가하여 발효소시지를 제조할 수 있다. 발효소시지 제조에 첨가되는 본 발명의 락토바실러스 플란타륨은 소시지 전체 중량에 대하여 0.1~5중량 % 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 신규한 식물성 유산균인 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2는 유해 미생물의 생육을 억제하는 활성, 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 특징이 있다. 따라서 본 발명의 유산균은 정장용, 생균제, 항균용, 사료용, 식품첨가용, 약학적 조성물 및 발효식품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2를 식품에 첨가할 경우 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제하여 식품의 신선도를 유지할 수 있고, 저장기간과 유통기간을 효과적으로 연장시킬 수 있으며, 김치 또는 동치미 발효를 위한 스타터로 사용하여 제조하는 경우, 좋은 김치 또는 동치미 맛을 오래 유지할 수 있고 김치 또는 동치미에 기능성을 부가할 수 있을 뿐만 아니라, 소시지 발효에 스타터로 사용하여 원료에서 오는 유해미생물을 억제하여 소시지의 부패를 방지하며 신맛과 독특한 풍미를 부여하고, 병원성 세균으로 인한 감염증의 치료 및 예방에 효과적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 균주의 분리
<1-1> 김치로부터 유산균의 분리
통상적인 김치 제조방법으로 제조된 김치 40 종을 선택하고, 상기 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 0.85 % 식염수로 10 배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기 추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈80 1 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ)플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 25 ℃의 항온 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25 ℃에서 2일 동안 배양하여 총 400 개의 유산균 콜로니를 분리하였다.
<1-2> 유해 미생물의 생육을 억제하는 유산균의 분리
상기 실시예 <1-1>에서 분리된 400개의 유산균들 중에서 유해 미생물의 생육을 저해하는 유산균을 선발하기 위하여, 먼저 유해 미생물 4종 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus KCCM 12214), 대장균 KCCM 11234(E.coli KCCM 11234), 바실러스 세레우스 KCCM 11774(B.cereus KCCM 11774) 및 살모넬라 타이피뮤림 KCCM 40253(Salmonella typimurium KCCM 40253)을 뉴트리언트 배지(박토 펩톤 5.0 g, 소고기추출물 1.0 g, 효모추출물 2.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 아가 15 g/증류수 1ℓ)에 접종하여 37 ℃, 24 시간 배양하였다. 상기 배양된 균체들을 배지로부터 긁어모아 인산완충액(PBS, pH 7.4)으로 2회 세척하고 20 % 글리세롤(glycerol)에 현탁시켜 -20 ℃에 보관하였고, 상기 실시예 <1-1>에서 분리한 400개의 유산균 콜로니들은 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24 시간 배양한 후, 원심 분리하여 균체에 10% skim milk에 현탁하여 -20 ℃에 보관하였다.
이후, 뉴트리언트 한천배지(Nutrient agar)에 유해 미생물을 1 % 접종하여 20 분간 건조한 후, 여기에 디스크 페이퍼를 올려놓고 상기 400개의 각 유산균 배양 상등액 50 ㎕를 적하시키고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 억제 환을 형성하는 유산균 중 가장 우수한 균주를 1차 선발하였다. 이후, 상기 1차 선발된 균주들을 상기와 같은 방법으로 다시 2차 선발하여 최종적으로 유해 미생물의 생육을 가장 우수하게 억제하는 DSR CK10과 DSR M2를 선발하였다(표 1).
주요 선발 균주들의 미생물 생육억제환 비교결과 (단위 :mm)
균주 CK10 M2 CH8 CY7 CY5 CD8 CD9 CJ3 CJ5 CM6
스타필로코코스 에우리우스 17.1 18.1 12.7 11.7 10.2 13.2 15.6 17.2 12.3 10.2
대장균 18.9 13.9 15.5 13.1 10.1 14.5 17.7 16.4 11.4 10.1
바실러스 세레우스 19.8 20.3 12 14.4 11.3 11.7 15 11.5 10.7 14.5
살모넬라 타이피뮤림 16.7 14.2 11.4 12 11.1 15.2 15.4 14.3 13.1 13.8
<1-3> 항균력 테스트
상기 실시예 <1-2>에서 분리된 DSR CK10과 DSR M2 유산균을 항균력 테스트를 위해 MRS 브로스에 3 차 계대 배양하고, 뉴트리언트 한천배지(Nutrient agar)에 병원성세균 대장균(E.coli KCCM 11234), 바실러스 세레우스(B.cereus KCCM 11774) 및 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium KCCM 40253), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis KCCM40763), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM11204), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica KCCM 41657), 스타필로코코스 에우리우스(Staplyococcus aureus KCCM 11335), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes KCCM4307)의 1 %를 접종하여 20 분간 건조한 후, 여기에 디스크 페이퍼를 올려놓고 상기 DSR CK10, DSR M2 유산균의 배양 상등액 50 ㎕를 적하시켜 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 억제 환의 크기를 측정하여 하기 표 2에 기재하였다.
본 발명에 따른 유산균의 항균력 테스트 결과
유해 미생물 DSR CK10 유산균(mm) DSR M2 유산균(mm) KCTC 3108
L. plantarum
(mm)		 KCCM 12116
L. plantarum
(mm)
살모넬라 콜레라수이스 16.7 14.4 14.3 13.9
바실러스 세레우스 KCCM 11774 20.1 20.3 16.8 18.5
여시니아 엔테로콜리티카 18.6 19.5 17.2 13.8
리스테리아 모노사이토게네스 17.4 15.0 15.2 15.1
스타필로코코스 에우리우스 KCCM 11335 17.5 18.1 16.2 15.9
대장균 20.7 13.9 14.8 15.1
살모넬라 타이피뮤림 16.9 14.2 13.2 14.3
바실러스 세레우스 KCCM11204 18.7 19.0 16.1 17.6
상기 표 2에 기재된 것과 같이 본 발명의 DSR CK10, DSR M2 유산균은 상기 식품유해 미생물의 생육억제에 우수한 효과를 보여 식품의 안전성 확보와 유통기한의 연장 등의 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다.
<1-4> 내산성 테스트
상기 실시예 <1-2>에서 분리된 유해 미생물의 생육을 가장 우수하게 억제하는 DSR CK10, DSR M2 유산균을 염산을 이용하여 pH 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5로 조정한 MRS 브로스(MRS 브로스, Difco.; 박토 펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 801 g, 구연산 2 g, 제2인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g/증류수 1ℓ) 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하면서 생균수를 조사하였다.
본 발명에 따른 유산균의 내산성 테스트 결과
pH 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
DSR CK10 유산균의 생존율 (%) 85 93 97 100 100 100
DSR M2 유산균의 생존율 (%) 91 95 99 100 100 100
KCTC 3108
L. plantarum 생존율 (%)		 55 79 90 98 100 100
KCCM 12116
L. plantarum 생존율 (%)		 21 52 88 92 100 100
그 결과, 상기 표3에 나타낸 바와 같이, DSR CK10, DSR M2 유산균은 pH 2.5 ~ 5에서 생육이 활발하고, 특히 pH 2.5에서도 85 % 이상 생존하며, pH 3에서 약 90 % 이상의 생존율을 나타내어 내산성이 강한 것으로 나타났다.
<1-5> 내염성 테스트
상기 실시예 <1-2>에서 분리된 DSR CK10, DSR M2 유산균을 염화나트륨(NaCl)로 2%, 5%, 8%, 10% 및 15%로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37 ℃에서 2시간 배양하면서 상기 염농도에서 균주의 생육을 관찰하였다.
본 발명에 따른 유산균의 내염성 테스트 결과
NaCl 농도 (%) 2% 5% 8% 10% 15%
DSR CK10 유산균의 생존율 (%) 100 100 100 100 90
DSR M2 유산균의
생존율 (%)		 100 100 100 97 91
KCTC 3108
L. plantarum 생존율 (%)		 100 100 95 81 65
KCCM 12116
L. plantarum 생존율 (%)		 100 100 97 86 72
그 결과, 상기 표4에 나타낸 바와 같이, DSR CK10, DSR M2 유산균은 염화나트륨 2~15%에서 생육이 활발하며, 특히 염화나트륨 15%에서도 90% 이상의 생존율을 나타내었다.
<1-6> 내담즙성 테스트
상기 실시예 <1-2>에서 분리된 DSR CK10, DSR M2 유산균을 옥스갈(oxgall)로 0.3%, 0.5%, 1% 및 3%로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37 ℃에서 2 시간 배양하면서 상기 인공 담즙 농도에서의 균주의 생육을 관찰하였다.
본 발명에 따른 유산균의 내담즙성 테스트 결과
Oxgall 농도(%) 0.3% 0.5% 1% 3%
DSR CK10 유산균의 생존율 (%) 100 100 100 100
DSR M2 유산균의
생존율 (%)		 100 100 100 99
KCTC 3108
L. plantarum 생존율 (%)		 99 92 69 45
KCCM 12116
L. plantarum 생존율 (%)		 97 85 52 41
그 결과, 상기 표5에 나타낸 봐와 같이, DSR CK10, DSR M2 유산균은 옥스갈(oxgall) 0.3 ~ 3.0%에서 생육이 활발하며, 특히 옥스갈(oxgall) 3%에서도 99% 이상의 생존율을 나타내었다.
<1-7> 항생제 내성 테스트
상기 실시예 1-2에서 분리된 DSR CK10, DSR M2 유산균을 MRS 고체배지에 접종하고, 항생제가 포함된 필터(직경 6mm)를 올려놓고 24시간 배양하여 항생제에 의한 형성된 억제 환의 크기를 측정하였다. 하기 표 6은 DSR CK10, DSR M2 유산균에 대한 항생제 내성정도를 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 유산균의 항생제 내성 측정 결과
항생제 DSR CK10(mm) DSR M2(mm) L. plantarum
KCTC 3108(mm)		 L. plantarum
KCCM 12116(mm)
테트라사이클린(30㎕) 22 21 16 18
에리트로마이신(15㎕) 15 13 11 13
앰피실린(10㎕) 23 25 20 19
페니실린(10IU/IE/UI) 24 25 19 22
세파로신(30㎕) 18 19 15 18
상기 표 6에 기재된 것과 같이 본 발명의 DSR CK10, DSR M2 유산균은 우수한 항생제 내성을 보여 항생제와 함께 정장용, 생균제, 사료용, 식품첨가용, 항균용, 약학적 조성물 및 발효식품에 사용하더라도 그 활성이 유지되어 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
<1-8> 선별된 유산균의 동정
a. 버지스의 분류 세균학 매뉴얼에 따른 분석
상기 실시예 1-2에서 선별된 유산균을 단일 콜로니로 분리한 후, 버지스의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리된 균주는 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다(표 7 참조).
본 발명에 따른 유산균의 형태학적 및 생화학적 특성
특성 DSR CK10 DSR M2
그람(Gram) + +
콜로니 형태(Colony form) 막대형(rod) 막대형(rod)
콜로니 색깔(Colony color) 노란색(yellow) 노란색(yellow)
운동성(Motility) - -
카탈라제(Catalase) - -
발효형태 호모(Homo) 호모(Homo)
포자(Spore) - -
15 ℃에서 생육 + +
NaCl 4 %에서 생육 + +
b. API 시스템을 이용한 분석
이후, 상기 균주는 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 각각 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다.
그 결과, 상기 실시예 <1-2>에서 선별된 DSR CK10, DSR M2 유산균은 모두 하기 표 8의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는 락토바실러스 속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
본 발명에 따른 DSR CK10, DSR M2 유산균의 탄수화물 발효패턴 분석 결과
대조군 - D-만노즈 + 살리신 + 겐티오비오즈 +
글리세롤 - L-솔보즈 - 셀로비즈 + D-튜라노즈 _
에리쓰리톨 - 람노즈 + 말토즈 + D-리조즈 -
D-아라비노즈 - 둘시톨 - 락토즈 + D-타가토즈 -
L-아라비노즈 + 이노시톨 - 멜리비오즈 + D-퓨코즈 -
리보오즈 + 만니톨 + 사카로즈 + L-퓨코즈 -
D-자일로즈 - 솔비톨 + 트레할로즈 + D-아라비톨 -
L-자일로즈 - D-만노시드 - 이눌린 + L-아라비톨 -
아도니톨 - D-글루코시드 - 멜레지토즈 + 글루코네이트 +
자일로시드 - 글루코사민 + D-라피노즈 + 2-세토-글루코네이트 -
갈락토즈 + 아미그달린 + 아미돈 - 5-세토-글루코네이트 -
D-글루코즈 + 알부틴 + 글리코겐 -
D-프록토즈 + 에스큘린 + 자일리톨 +
c. 16S rDNA 염기서열 분석
당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균들의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명자들은 DSR CK10 유산균을 "락토바실러스 플란타륨 DSR CK10"으로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2008년 12월 12일자로 기탁하였다(기탁번호: KFCC-11433P).
또한 DSR M2 유산균의 16S rDNA 염기서열을 분석하여, 본 발명자들은 DSR M2 유산균을 "락토바실러스 플란타륨 DSR M2"로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2008년 12월 12일자로 기탁하였다(기탁번호: KFCC-11432P).
<실시예 2>
본 발명의 유산균을 이용한 신선 채소 선도 유지
본 발명의 유산균을 이용하여 얼갈이 배추, 적로즈, 백로즈, 통키콘, 양파, 당근 등의 신선편이 채소류의 선도 유지효과를 하기와 같이 실험하였다.
<실험예 1>
미생물의 처리와 분석
미생물의 총균의 분석은 전체 생균계수(total counts) 및 대장균군(coliform)을 조사하였다. 각각의 시료 20g과 살균한 0.85% 생리식염수 180ml을 스토마커 백(stomacher bag)에 넣고 스토마커(stomacher)를 사용하여 2분 동안 균질화한 후 생리식염수에 단계 희석하여 일반 세균은 PCA(plate count agar) 플레이트, 대장균군은 3M petrifilm에 각각 분주한 후 도말하였다. PCA 플레이트와 3M petrifilm은 35℃에서 24시간 배양하여 콜로니 계수를 측정하였다.
<실험예 2>
유산균처리에 따른 선도 유지효과
상기 신선편이 채소류 중 얼갈이배추를 깨끗이 정선한 후 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 5% 수용액에 10분간 침지한 실험구와 무처리한 대조구를 이용하였다. 상기 실험구 및 대조구의 얼갈이 배추를 각각 일반 비닐팩 야채봉투에 넣어 10℃에 저장 후, 0, 5, 10일 후 꺼내 총균수, 대장균군 수를 실험예1에 따라 검사하였다(표9).
본 발명에 따른 DSR CK10, DSR M2 유산균 처리에 따른 총균수, 대장균수 측정결과
구분 일자 총균수(log cfu/g) 대장균군(log cfu/g)
무처리군 0 3.54 1.91
5 5.68 2.95
10 8.23 4.43
5% DSR CK10 처리군 0 3.49 1.76
5 5.71 1.79
10 7.99 1.95
5% DSR M2 처리군 0 3.56 1.88
5 5.79 1.85
10 8.11 1.89
상기 표 9에 기재된 것과 같이 저장기간이 10일 경과 후 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 또는 락토바실러스 플란타륨 DSR M2와 무처리군의 총균수의 변화는 초기에 비해 모두 증가하였지만, 대장균군의 증식의 경우는 무처리군은 4.43 log cfu/g으로 증가한 반면, DSR CK10유산균 처리군은 1.95 log cfu/g, DSR M2유산균 처리군은 1.89 log cfu/g으로 증식이 미비하였다. 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2 처리시 총균수의 증가는 유산균의 증식에 의한 결과로 대장균군에서는 증식이 진행되지 않는 효과를 나타냄으로 신선편이 채소류의 선도를 연장할 수 있는 유용성을 확인하였다.
<실시예 3>
본 발명의 유산균을 이용한 김치 제조
배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3 %가 되도록 하였다. 절인 배추(82.5 중량%)에 고춧가루(2.5 중량%), 마늘(2 중량%), 생강(0.5 중량%), 대파(2 중량%), 무채(9 중량%), 설탕(0.5 중량%)의 김치 양념을 혼합하였다. 이후, 스타터로 본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2를 김치 전체 중량에 대하여 1 중량%(약 1×105 균주)로 각각 첨가하였다. 이때, 음성 대조군에는 스타터 유산균을 첨가하지 않았다. 이후, 제조된 각 김치를 10 ℃에서 6일간 숙성시켰다.
<실험예 3>
제조된 김치의 산도 및 유산균 수 측정
<3-1> 산도 측정
상기 실시예 3에서 제조된 각 김치를 대상으로 산도를 측정하였다. 10 ℃에서 10일 동안 숙성시킨 각 김치 100 g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 이후, 김치의 숙성된 상태를 비교하기 위하여 각 김치의 산도를 측정하였다. 산도는 NaCl 적정법을 이용하여 측정하였다. 각 김치로부터 김치즙액을 제조한 후, 김치즙액 5 ㎖의 pH를 측정하였다. 이후, 0.1N NaOH를 적정하여 pH 8.2 가 되는 시점의 0.1N NaOH의 첨가량을 계산하여 하기의 수학식 1로 산도(%)를 구하여, 그 결과를 하기 표 10에 기재하였다.
산도(%) = {0.00908×1N NaOH 인자 * ×1N NaOH 첨가량} / 시료 무게
* 1N NaOH 인자 = 1
본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 산도 측정 결과
스타터로 첨가된 유산균 산도(%)
락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 0.65
락토바실러스 플란타륨 DSR M2 0.65
스타터 무첨가(음성 대조군) 0.76
그 결과, 상기 표 10에서 보는 바와 같이, 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 유산균을 이용하여 제조된 김치는 스타터를 사용하지 않고 제조된 김치에 비해 산도가 비교적 낮아 상기 유산균은 김치의 발효 후반부에 산도를 서서히 증가시켜 적숙기를 연장함으로서 김치 품질을 향상 시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<3-2> 김치의 유산균 수 측정
상기 실시예 3에서 제조된 각 김치의 유산균 수를 측정하였다. 10 ℃에서 6일 동안 숙성시킨 각 김치를 0.85 % 식염수로 10배 희석하고 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토 펩톤 10 g, 소고기 추출물 10 g, 효모 추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 80 1 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ) 플레이트에 상기 김치 희석액 0.1 ㎖을 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 상기 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 27 ℃의 항온배양기에서 12 일 동안 배양한 후 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하여 그 결과를 표 11에 기재하였다.
본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 유산균 수 측정 결과
스타터로 첨가된 유산균 총유산균 수(log cfu/g)
락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 9.25
락토바실러스 플란타륨 DSR M2 9.14
스타터 무첨가(음성 대조군) 8.99
그 결과, 상기 표 11에서 보는 바와 같이 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치에서 스타터를 첨가하지 않고 제조된 김치에 비해 총 유산균 수가 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4>
제조된 김치의 관능 검사
상기 실시예 3에서 제조된 각 김치의 관능검사를 수행하였다. 10 ℃에서 6일 동안 숙성시킨 후, 4 ℃에서 보관한 지 2일째 되는 각 김치에 대하여 훈련된 검사요원 10명이 관능검사를 수행하였다. 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였으며, 유의성 검증은 t-테스트에 의해 실시하였다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 관능 검사 결과
스타터로 첨가된 유산균 종합적인 맛 이미 외관 신맛 질감
락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 3.8 1.0 3.6 3.7 3.8
락토바실러스 플란타륨 DSR M2 3.9 1.0 3.5 3.7 3.8
스타터 무첨가(음성 대조군) 3.2 1.0 3.2 3.3 3.4
그 결과, 상기 표 12에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치가 스타터를 첨가하지 않고 제조된 김치에 비해 전반적으로 관능 특성이 우수한 것으로 평가되었다.
<실시예 4>
본 발명의 유산균을 이용한 동치미의 제조
무 및 배추를 소금으로 절여 배추의 염도가 4.0 %가 되도록 하였다. 상기 절인 배추(6 %)와 무(38 %)에 마늘(3 중량%), 생강(0.2 중량%), 포도당(5 중량%)등으로 구성된 동치미 양념을 혼합하였다. 이후, 스타터로 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 유산균을 동치미 전체 중량에 대하여 1 중량%(약 1×105 균주)로 각각 첨가한 후 25℃에서 5일간 발효시켜 동치미를 제조하였다. 이때 스타터 유산균을 첨가하지 않은 경우를 음성대조군으로 하였다.
<실험예 5>
제조된 동치미의 산도 및 유산균 수 측정
<5-1> 산도 측정
상기 실시예 4에서 제조된 동치미 국물을 거즈로 여과하여 동치미액을 제조한 후, 동치미액 5 ㎖의 pH를 측정하고 실험예 3-1과 동일한 방법으로 산도를 계산하여 그 결과를 하기 표 13에 기재하였다.
본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 동치미의 산도 측정 결과
스타터로 첨가된 유산균 산도(%)
락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 0.76
락토바실러스 플란타륨 DSR M2 0.73
스타터 무첨가(음성 대조군) 0.55
그 결과, 상기 표 13에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 동치미의 산도는 스타터를 이용하지 않고 제조된 동치미에 비해 산도가 빠르게 증가 하였다. 따라서 본 발명의 유산균은 동치미의 발효를 빠르게 유도하여 적정 산도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
<5-2> 동치미의 유산균 수 측정
상기 실시예 4에서 제조된 각 동치미를 0.85 % 식염수로 10배 희석하여 실험예 3-2와 동일한 방법으로 총 유산균수를 측정하고 그 결과를 표 14에 기재하였다.
본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 동치미의 유산균 수 측정 결과
스타터로 첨가된 유산균 총유산균 수(log cfu/g)
락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 9.11
락토바실러스 플란타륨 DSR M2 9.05
스타터 무첨가(음성 대조군) 7.81
그 결과, 상기 표 14에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 동치미에서 스타터를 첨가하지 않고 제조된 동치미에 비해 총 유산균 수가 증가된 것을 확인할 수 있었다.
<5-3> 제조된 동치미의 항균력 측정
병원성 세균인 살모넬라 콜레라(Salmonella choleraesuis KCCM40763), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica KCCM 41657), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes KCCM4307), 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus KCCM 12214), 대장균(E.coli KCCM 11234), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium KCCM 40253), 바실러스 세레우스(B.cereus KCCM 11774)를 뉴트리언트 배지(박토 펩톤 5.0 g, 소고기추출물 1.0 g, 효모추출물 2.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ)에 접종하여 37 ℃, 24시간 배양한 후, 뉴트리언트 한천배지(Nutrient agar)에 접종하여 20 분간 건조한 후, 여기에 디스크 페이퍼를 올려놓고 상기 실시예 4에서 제조된 동치미액을 50 ㎕를 적하시키고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 억제 환을 측정하여 그 결과를 표 15에 기재하였다
본 발명에 따른 동치미의 항균력 테스트 결과
유해 미생물 락토바실러스 플란타럼 DSR CK10을 이용하여 제조된 동치미액에 의한 억제환크기(mm) 락토바실러스 플란타럼 DSR M2를 이용하여 제조된 동치미액에 의한 억제환크기(mm)
살모넬라 콜레라수이스 17.1 16.5
바실러스 세레우스 KCCM 11774 19.8 23.3
여시니아 엔테로콜리티카 18.7 28.1
스타필로코코스 에우리우스 KCCM 12214 17.9 15.6
리스테리아 모노사이토게네스 17.5 26.4
대장균 21.4 15.9
살모넬라 타이피뮤림 17.9 14.7
바실러스 세레우스 KCCM11204 18.5 20.5
상기 표 15에 기재된 것과 같이 본 발명의 DSR CK10 혹은 DSR M2 유산균을 이용하여 제조된 동치미는 상기 유해 미생물에 대하여 우수한 항균력을 가지고 있음을 알 수 있었다. 특히 DSR CK10은 대장균에 대하여, DSR M2는 여시니아 엔테로콜리티카, 리스테리아 모노사이토게네스, 바실러스 세레우스 KCCM 11774 및 바실러스 세레우스 KCCM112204등의 유해 미생물에 대하여서는 억제환의 크기가 20mm를 넘어 우수한 항균력을 가지고 있음을 알 수 있었다.
<제조예 1>
본 발명의 식물성 유산균을 이용한 발효소시지 제조
본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 유산균을 원료육 90 %, 후추 0.25%, 마늘 0.05%, 로즈메리 0.05%, 식염 2.8%, 식염 2.8%, 포도당 1% 및 정제수 잔량을 포함하는 소시지원료에 접종한 후 15~30℃에서 1~6개월간 발효하여 발효소시지를 제조하였다. 이때, 발명의 유산균이 1×106 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
<제조예 2>
본 발명의 식물성 유산균을 이용한 생균제 조성물의 제조
본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 유산균을 2.0 % 글루코스, 1.0 % 펩톤, 1.0 % 효모추출물, 0.2 % 제이인산, 0.05 % 황산마그네슘 및 0.05 % 시스테인이 함유된 배지에 접종하여 37 ℃에서 2 일 동안 호기적으로 배양하였다. 탈지강, 대두박, 옥분 및 당밀이 각각 3:1:1:1의 중량비로 혼합되어 들어 있는 고체 배양기에 상기 각 균주의 배양액을 10 중량%로 접종한 후, 여기에 물을 45 내지 60 중량%로 첨가하였다. 이를 40 ℃에서 3일 동안 교반시키면서 혐기적으로 고체발효를 수행하여 생균제 조성물을 제조하였으며, 이때 제조된 생균제 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
<제조예 3>
본 발명의 식물성 유산균을 이용한 식품첨가용 조성물의 제조
본 발명의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10 혹은 락토바실러스 플란타륨 DSR M2 유산균을 무 20중량%, 배추 10중량%, 포도당 3중량%, 대두단백 2중량% 및 정제수 잔량을 포함하는 식물성 유산균 배지에 접종하여 37 ℃에서 2 일간 호기적으로 배양한 다음 -70℃ 이하에서 급속 냉동시킨 후, -60 ℃에서 36 시간 동안 동결 건조시켜 식품첨가용 조성물을 제조하였다. 이때, 동결건조시 수분 증발 효율을 높이기 위한 열판의 온도는 30 ℃로 하였으며, 이때 제조된 식품첨가용 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
<제조예 4>
본 발명의 식물성 유산균을 이용한 약학적 조성물의 제조
상기 제조예 1, 2 및 3에서 얻어진 생균 조성물 분말을 각각 통상적인 방법에 따라 정제, 환제 및 캡슐제로 성형하여 약학조성물로 제조하였으며, 이때 제조된 조성물은 본 발명의 유산균이 1×109 cfu/g 이상으로 포함되도록 하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 식물성 유산균인 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2는 유해 미생물의 생육을 억제하는 활성, 내산성, 내염성, 내담즙성 및 항생제 내성이 우수한 특징이 있다. 따라서 본 발명의 유산균은 정장용, 생균제, 항균용, 사료용, 식품첨가용, 약학적 조성물 및 발효식품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10, DSR M2를 식품에 첨가할 경우 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제 하여 식품의 신선도를 유지할 수 있고, 저장기간과 유통기간을 효과적으로 연장시킬 수 있으며, 김치 또는 동치미 발효를 위한 스타터로 사용하여 제조하는 경우, 좋은 김치 또는 동치미 맛을 오래 유지할 수 있고 김치 또는 동치미에 기능성을 부가할 수 있을 뿐만 아니라, 소시지 발효에 스타터로 사용하여 원료에서 오는 유해미생물을 억제하여 소시지의 부패를 방지하며 신맛과 독특한 풍미를 부여하고, 병원성 세균으로 인한 감염증의 치료 및 예방에 효과적이어서 본 발명은 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.

Claims (7)

  1. 유해 미생물의 생육을 억제하고 pH 2.5~5에서 내산성, NaCl 2~15%에서 내염성, 옥스갈(Oxgall) 0.3~3%에서 내담즙성 및 항생제 내성을 갖는 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10(KFCC-11433P) 또는 락토바실러스 플란타륨 DSR M2(KFCC-11432P)인 것을 특징으로 하는 균주.
  2. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하여 유해 미생물의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  3. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 유해 미생물의 감염증 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  4. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 발효식품.
  5. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 스타터(starter)로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법.
  6. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 생균제 조성물.
  7. 제1항의 식물성 유산균 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) 또는 이의 배양물을 함유하는 식품첨가용 조성물.
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