KR101573897B1 - 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드 dsr1310 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 내산성 및 내염성이 우수하고, 저 산생성능을 갖으며, 우수한 항균력을 가진다. 이에, 본 발명은 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 정장제, 생균제, 식품 첨가제 및 발효식품(바람직하게는, 김치)의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주는 발효식품(바람직하게는, 김치) 제조를 위한 발효 스타터(starter) 균주로 사용할 수 있다.

Description

내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주 및 이의 용도{Leuconostoc mesenteroides DSR1310 Strain Having Excellent Acid and Salt Resistance and Use thereof}

본 발명은 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 및 이의 용도에 관한 것이다.

김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등을 혼합한 후, 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 발효시킨 식품으로서, 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다. 1990년대까지만 해도 김치는 주로 가정에서 자체적으로 생산이 되어온 식품이었으나, 급속한 경제성장과 국민소득의 증가, 산업구조 및 생활환경의 변화에 의하여 1990년대 이후 본격적으로 상품화되기 시작하였다. 상품화되고 있는 김치의 경우, 김치의 발효를 주도하고 김치 특유의 맛을 내는 자연발생적 균주들이 원재료의 산지, 계절, 발효 조건에 따라 달라져 상품김치의 품질이나 맛을 원하는 상태로 일정하게 유지하기가 대단히 어려웠다. 따라서 품질과 맛이 일정하면서도 우수한 상품김치에 대한 개발이 요구되었다.

김치의 시원하고 깔끔한 맛을 내는 주된 요인은 김치 유산균 중 이상젖산발효균(heterofermentative lactic acid bacteria)인 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)가 김치의 숙성시 증가하기 때문이다(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci . Technol., 27(4):495-505, 1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci . Technol., 27(4):506-515, 1995). 이 류코노스톡 메센테로이드는 김치 제조시 초기부터 생육을 시작하여 이산화탄소, 젖산, 초산, 에탄올 및 만니톨 등의 대사산물을 생산함으로써 김치를 복합적이고 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한 생산된 이산화탄소로 하여금 김치 내부를 혐기적 조건으로 유지시켜 호기성 세균의 번식을 강력히 억제시킴으로써 정상적인 김치 발효가 되게 한다. 그러나 김치의 발효 중기에 이르면 류코노스톡 메센테로이드의 수가 급격히 감소되며 정상젖산발효균(homofermentative lactic acid bacteria)인 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarium)이 왕성히 증식하게 된다. 락토바실러스 플란타리움은 김치의 신맛을 내는 주된 균이며 산패에 관여한다고도 알려져 있다. 이 락토바실러스 플란타리움은 젖산을 다량으로 생성하고 pH 3.0의 산성 환경에서도 생육이 가능하다. 따라서 김치의 발효 말기부터는 상대적으로 산에 약한 유산균인 류코노스톡 메센테로이드의 생육은 감소되면서 신맛의 원인균인 락토바실러스 플란타리움의 생육이 증가되고 이에 따라 김치의 시원하고 깊은 맛이 사라지게 된다. 따라서 김치 내 류코노스톡 메센테로이드의 생육을 저장 기간 동안 유지시켜 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 재현하는 것이 품질과 맛이 좋은 김치를 생산할 수 있는 주요 관건이라 할 수 있다.

따라서, 최근에는 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 특히, 류코노스톡 메센테로이드를 이용하여 김치의 품질을 향상시키려는 연구가 계속 진행되고 있다. 대한민국 공개특허 제1989-0006153호에 차아염소산나트륨과 류코노스톡 메센테로이드를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법이 개시되었다. 또한 대한민국 등록특허 제0181009호에 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드를 혼합 첨가함으로써 맛이 좋을 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주의 생육을 억제하여 산패가 지연되도록 한 김치의 제조방법이 개시되었다. 그러나, 류코노스톡 메센테로이드는 내산성이 약하기 때문에 김치의 발효가 점차 진행되면서 그 수가 감소 되어 김치의 신선한 맛을 지속적으로 유지시킬 수 없다는 문제점이 있다.

이러한 문제점들을 극복하기 위하여 대한민국 공개특허 제1994-0007175호에서는 류코노스톡 속 균주의 내산성을 향상시키기 위하여 류코노스톡 속 균주를 자외선 처리하여 내산성 변이균주를 제조하였고, 이를 김치 제조시 스타터로 첨가한 결과 김치의 관능성을 향상시키고 김치의 산패를 지연시켰다. 그러나 이러한 내산성 변이균주를 첨가하여 제조한 김치는 맛이 좋고 산패가 지연되기는 하였으나 김치의 신맛을 내는 주원인균이면서 강력한 내산성 균주인 락토바실러스 플란타리움의 생육이 억제됨을 보이지는 못했다.

이에 따라 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 오랫동안 유지하게 할 수 있는 유산균 스타터에 대한 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조 되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 김치의 품질을 향상시키고 김치의 발효 상태를 조절할 수 있는 신규한 유산균 스타터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 김치로부터 내산성, 내염성, 저 산생성 및 항균력이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주를 새로이 분리 및 동정하는데 성공하였으며, 이 균주의 발효제품에 대한 응용가능성을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균력이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 정장용 조성물, 생균제 조성물, 식품 첨가용 조성물 또는 발효식품을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 본 발명의 발효식품의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 저 산생성능을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항균력이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P)를 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주는 유산균으로서 김치에서 분리하였으며, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 본 발명의 미생물의 동정은 미생물의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.

미생물의 분리 및 동정

본 발명의 신규 유산균은 관능 평가를 통해 가장 풍미가 우수한 시점의 김치 시료를 PES 아가 배지 플레이트에 접종한 후 배양하고, 생성된 각각의 콜로니를 PES 아가 플레이트에 획선 접종한 다음 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다. 그 다음, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 MRS 브로스에 접종한 후 배양하여 산 생성이 가장 적은 유산균을 선별하였다. 또한, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.0으로 각각 조정한 MRS 브로스에 각각 접종한 후 배양하면서 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 또한, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 NaCl로 2, 2.5, 3, 3.5, 4%로 조정한 MRS 브로스에 각각 접종한 후 배양하면서 생균수를 관찰하여 상기 염농도에서도 생육이 활발한 내염성 균주를 선별하였다.

한편, 유해 미생물을 뉴트리언트 아가배지에 1% 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조한 후 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 상기 분리한 각각의 유산균 배양 상등액을 적하시킨 다음, 배양 후 억제 환을 형성하는 유산균 중 가장 우수한 균주를 선발하였다.

이렇게 선별된 유산균을 동정한 결과, 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다(표 1). 이후, 상기 균주를 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효 패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정한 결과, 상기 선별된 유산균은 하기 표 2의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주인 것으로 판명되었고, 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)을 이용하여 얻어진 결과(도 1)와 일치하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 유산균을 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310으로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2013년 12월 19일자로 기탁하였다(KCCM11503P).

본 발명의 유산균의 내산성

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 종래 류코노스톡 속 균주에 비하여 내산성이 현저히 강하고, pH 3.0-4.0에서 생육이 활발하게 유지된다(표 3).

본 발명의 유산균의 내염성

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 내염성이 현저히 강하고, NaCl 2-4%에서 내염성을 갖는다(표 4).

본 발명의 유산균의 저 산생성능

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 산도값(0.6-0.7%)이 낮고 pH 4.9-5.2로 높으며 CaCO₃ 배지에서 환의 직경이 가장 작은 저산생성 유산균이다(표 5).

본 발명의 유산균의 항균력

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus; 황색포도상구균) 및 대장균(E. coli)에 대한 항균력이 우수하였다(표 6).

한편, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 위해성을 분석 결과, 모든 검사에서 음성으로 나타나 인체에 안정한 균주로 확인되었다(표 7).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장용 조성물 또는 생균제 조성물을 제공한다.

상기 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 mg/kg이다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 등으로사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가용 조성물 또는 발효식품을 제공한다.

본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품 첨가용 조성물(식품첨가제)로 사용될 수 있다.

상기 식품 첨가용 조성물은 본 발명에 따른 균주 또는 이의 배양물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.

상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 발효식품의 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효식품은 치즈, 발효생식제품, 발효주 및 김치 등을 포함한다.

상기 발효식품은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 발효생식식품은 현미 및 율무 등의 곡류 분말에 본 발명의 균주를 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조할 수 있다.

발효주를 제조하는 경우에는, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 전분질 원료를 액화 및 당화하여 당화액을 얻고, 상기 당화액에 효모 및 본 발명의 균주의 배양물을 첨가하여 알코올을 발효시킨 후 수득한 발효액을 여과하여 제조할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 발효식품은 김치이다.

김치를 제조하는 경우에는, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예컨대, 소금으로 절인 배추에 고춧 가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 배양물을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다.

상기 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주는 상기 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균 또는 건조균을 포함하고, 상기 배양물은 상기 균주를 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 또한, 상기 배양물은 이를 건조(예: 동결 건조)한 후 분말화한 것도 포함한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가 속도가 완만할 뿐 아니라(도 2), 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주는 김치에 첨가될 경우 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도한다. 또한, 관능평가에서 있어, 대조군에 비교하여 탄산미는 개선되고 이미 및 이취는 감소하여 종합적인 맛에 있어 개선된 효과를 나타내었다(표 9). 따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가속도가 완만하여 김치의 적정 숙성도(산도 0.4-0.8%)를 오랫동안 유지할 수 있다. 또한 탄산미는 개선되고 이미 및 이취는 감소하여 종합적인 맛에 있어 개선되어 그 맛을 오래 보존할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 및 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는 발효식품의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 발효식품을 제조하는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 발효식품이 김치인 경우에, 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주 자체를 직접 김치에 첨가할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 균의 배양물을 첨가할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 김치 제조시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주의 배양물은 (a) 상기 균주를 영양배지(펩톤, 효모 추출물, 글루코스/증류수)에 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 1차 전배양하는 단계; (b) 상기 1차 전배양물을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 2차 전배양하는 단계; 및 (c) 상기 2차 전배양물을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 본 배양하는 단계:를 포함하는 방법으로 제조된다. 또한 상기 배추즙은 다음과 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하다: (ⅰ) 절임배추를 분쇄 및 착즙하고 염농도를 2.0-3.0％(보다 바람직하게는 2.8％)로 조정하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 결과물에 포도당을 1.0-3.0％(w/v)(바람직하게는 1.0％(w/v)) 첨가하고 멸균하는 단계.

상기 김치에서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 배양물은 김치 총 중량에 대하여 0.1-5 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5-3 중량%로 포함되며, 보다 더 바람직하게는 0.7-1.5 중량%로 포함된다.

상기 균주의 배양물이 김치 총 중량에 대하여 0.1 중량% 미만인 경우에는 균주에 의한 효과가 미미하고, 5중량％를 초과하는 경우에는 김치의 풍미가 저하되고 김치가 과숙성되는 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주를 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄을 포함하는 배지에서 20-40℃에서 10-40 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 배양 방법에 이용되는 배양 배지는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄를 포함하며, 바람직하게는 영양배지, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 배지 또는 김치 배지를 사용할 수 있다. 상기 김치 배지는 숙성된 김치, 바람직하게는 김치 제조 후 24시간 동안 4℃에서 숙성된 김치를 분쇄하고 착즙한 후, 멸균하여 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 류코노스톡 속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20 내지 40℃에서 10시간 내지 40시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 37℃에서 18시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 내산성 및 내염성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 및 이의 용도를 제공한다.

(b) 본 발명의 균주는 내산성 및 내염성이 우수하고, 저 산생성능을 갖으며, 우수한 항균력을 가진다.

(c) 이에, 본 발명은 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 정장제, 생균제, 식품 첨가제 및 발효식품(바람직하게는, 김치)의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

(d) 따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주는 발효식품(바람직하게는, 김치) 제조를 위한 발효 스타터(starter) 균주로 사용할 수 있다.

도 1은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 형태학적 특징으로 보여주는 사진이다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 계통도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 김치를 대상으로 산도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

실시예 1: 스타터 균주 분리

1-1) 김치 시료로부터 유산균 분리

통상적인 김치 제조방법으로 제조된 여러 종류의 김치들을 저온에서 숙성시키면서 관능평가를 실시하여 가장 풍미가 우수한 시점의 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다.

상기 김치시료를 0.85％ 식염수로 10배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 PES 아가 배지(페닐에틸 알콜 수크로즈 아가; 트립톤 5 g, 효모추출물 0.5 g, 수크로즈 20 g, 황산 암모늄 2 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘 0.244 g, 페닐에틸 알콜 2.5 ml, 아가 15 g/증류수 1 L) 플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 25℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 PES 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25℃에서 2일 동안 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다.

1-2) 저산생성 유산균 분리

상기 실시예 1-1에서 분리된 유산균 콜로니들을 MRS 브로스(MRS 브로스, 디프코(Difco.); 박토펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈80 1 g, 구연산 암모늄 2 g, 제2인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g/증류수 1 L) 10 ㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 동안 배양 후 산생성 정도 측정을 위해서 산도, pH를 측정하였다. 분리된 유산균 중에서 산 생성이 가장 적은 유산균을 선별하였다.

1-3) 내산성 테스트

상기 실시예 1-1에서 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.0으로 각각 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 동안 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 선별된 내산성 유산균은 pH 3.5-5.0에서 생육이 활발하여 내산성이 강한 것으로 나타났다.

1-4) 내염성 테스트

또한, 상기 실시예 1-1에서 분리된 유산균 콜로니들을 NaCl로 2, 2.5, 3, 3.5, 4%로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 37℃에서 2시간 배양하면서 생균수를 관찰하여 상기 염농도에서도 생육이 활발한 내염성 균주를 선별하였다. 그 결과 NaCl 2-4%에서 생육이 활발하며, 특히 NaCl 4%에서도 90% 이상의 생존율을 나타내었다.

1-5) 항균력 테스트

뉴트리언트 액체배지에 3차 계대 배양 한 유해 미생물을 뉴트리언트 아가배 지에 1% 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 상기 분리한 각각의 유산균 배양 상등액 100 ㎕를 적하시켰다. 37℃에서 24 시간 동안 배양 후 생성된 억제 환의 직경을 측정하였다. 억제 환을 형성하는 유산균 중 가장 우수한 균주를 선발하였다.

1-6) 선별된 유산균의 동정

a. 버지스의 분류 세균학 매뉴얼에 따른 분석

상기 실시예에서 선별된 유산균을 단일 콜로니로 분리한 후, 버지스의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy'smanual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리된 균주는 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다(표 1 및 도 1).

본 발명에 따른 유산균의 형태학적 및 생화학적 특성

특성	결과
그람(Gram)	+
콜로니 형태(colony form)	막대형(rod)
콜로니 색(Colony color)	노란색(yellow)
운동성(Motility)	-
카탈라제(Catalase)	-
발효형태	헤테로(hetero)
포자(Spore)	-
15℃에서 생육	+
NaCl 4%에서 생육	+

b. API 시스템을 이용한 분석

이후, 상기 균주를 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5 ㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200 ㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효 패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다. 그 결과, 상기 실시예 1-2 내지 1-5를 통하여 선별된 유산균은 하기 표 2의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.

본 발명에 따른 유산균의 탄수화물 발효패턴 분석 결과

대조군	-	D-만노즈	-	살리신	+	겐티오비오즈	+
글리세롤	-	L-솔보즈	-	셀로비즈	+	D-튜라노즈	+
에리쓰리톨	-	람노즈	-	말토즈	+	D-리조즈	-
D-아라비노즈	+	둘시톨	-	락토즈	-	D-타가토즈	-
L-아라비노즈	+	이노시톨	-	멜리비오즈	+	D-퓨코즈	-
리보오즈	+	만니톨	-	사카로즈	+	L-퓨코즈	-
D-자일로즈	-	솔비톨	-	트레할로즈	+	D-아라비톨	-
L-자일로즈	-	D-만노시드	+	이눌린	-	L-아라비톨	-
아도니톨	-	D-글루코시드	+	멜레지토즈	-	글루코네이트	+
자일로시드	-	글루코사민	+	D-라피노즈	-	2-세토-글루코네이트	-
갈락토즈	+	아미그달린	+	아미돈	-	5-세토-글루코네이트	-
D-글루코즈	+	알부틴	-	글리코겐	-	-	-

따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310으로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2013년 12월 19일자로 기탁하였다(KCCM11503P).

본 균주와 유전학적으로 비슷한 균들 간의 계통발생학적 위치를 Phydit 프로그램을 이용해 도 2와 같이 나타내었다. 같은 속의 균주와는 물론이고, 같은 종의 표준 균주와도 계통발생학적으로 다름을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 본 발명의 유산균의 내산성 정도 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310의 내산성 정도를 확인하기 위하여 대조군으로 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324와 KCCM35471을 사용하였다. 각 유산균을 산으로 pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0으로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 37℃에서 2시간 배양하면서 생육 유무를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

내산성 비교 결과(+: 생육함, -: 생육하지 않음)

균주 pH	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드DSR1310	류코노스톡 메센테로이드KCCM11324	류코노스톡 메센테로이드KCCM35471
4.0	+	+	+
3.5	+	-	+
3.0	+	-	-

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310는 종래 류코노스톡 속 균주에 비하여 내산성이 현저히 강하고, pH 3.0-4.0에서 생육이 활발하게 유지됨이 확인되었다.

실시예 3. 본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 내염성 정도 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310의 내염성 정도를 확인하기 위하여 대조군으로 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324와 KCCM35471을 사용하였다. 각 균주를 NaCl로 2, 2.5, 3, 3.5, 4%로 조정한 MRS 브로쓰 10 ㎖에 각각 접종하였다. 이후, 25℃에서 72시간 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 생존율(%)을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4에 기재하였다.

내염성 비교 결과(생존율, %)

NaCl(%)	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드DSR1310	류코노스톡 메센테로이드KCCM11324	류코노스톡 메센테로이드KCCM35471
2.0	99	98.5	96.5
2.5	98.5	97.1	95.2
3.0	98.1	95.4	93.3
3.5	96.3	93.6	90.6
4.0	94.3	90.8	88.7

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310은 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 내염성이 현저히 강한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 본 발명의 유산균의 저산생성 정도 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310의 내산성 정도를 확인하기 위하여 대조군으로 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324와 KCCM35471을 사용하였다. MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하고 25℃에서 72시간 동안 배양 후 산생성 정도 측정을 위해서 산도, pH를 측정하였다.

또한 멸균된 이쑤시개를 이용해 CaCO₃ 0.8%가 첨가된 MRS 아가에 접종하여 25℃ 항온배양기에서 72시간 동안 배양하였고, 생성된 투명한 환의 직경을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

산생성 정도 비교 결과

-	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드DSR1310	류코노스톡 메센테로이드KCCM11324	류코노스톡 메센테로이드KCCM35471
산도	0.61	1.12	0.88
pH	5.07	4.43	4.83
환 직경 (mm)	2.67	4.42	3.1

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310은 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 산도값이 낮고 CaCO₃ 배지에서 환의 직경이 가장 작아 저산생성 유산균임을 확일할 수 있었다.

실시예 5. 본 발명의 유산균의 항균력 정도 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310의 김치의 숙성 시 우점되는 유산균 및 병원성 미생물에 대한 항균력 정도를 확인하기 위하여 대조군으로 류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324와 KCCM35471을 사용하였다. 뉴트리언트 액체배지에 3차 계대 배양 한 유해 미생물을 뉴트리언트 아가배지에 1% 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 상기 분리한 각각의 유산균 배양 상등액 100 ㎕를 적하시켰다. 37℃에서 24 시간 동안 배양 후 생성된 억제 환의 직경을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

항균력 비교 결과(단위: mm)

Indicator	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드DSR1310	류코노스톡 메센테로이드 KCCM11324	류코노스톡 메센테로이드KCCM35471
Lactobacillus plantarum KCTC 3108	13	-	10
Lactobacillus plantarum KCCM12116	15	9	-
Listeria monocytogenes KCCM40307	14	-	-
Staphylococcus aureus subsp. aureusKCCM12214	12	-	12
E. coli KCCM11234	16	10	10

실시예 6. 스타터 미생물 균주의 위해성 분석

상기 선정된 스타터 미생물 균주를 사용하여 김치를 제조할 때 나타날 수 있는 위해성을 분석한 결과, 스타터 균주는 모든 검사에서 음성으로 나타나 인체에 안정한 균주로 확인되었다(표 7).

미생물 안전성 검사 결과

Test	류코노스톡 메센테로이드DSR1310
Hemmolysis	γ
Ammonia production	-
Indole production	-
Phenylalanine deaminase	-
β-glucosidase	-
β-glucuronidase	-
Gelatin liquefaction	-
Nitroreductase	-
7 α-dehydroxylase	-

실시예 7. 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 을 이용한 김치의 제조 및 제조된 김치의 특성 분석

1) 배양액 제조

절임배추를 브랜더로 분쇄, 착즙 후 재제염을 사용하여 염도가 2.8%가 되도록 조정하였다. 여기에 포도당을 1.0%(w/v) 첨가한 후, 멸균하여 배추즙을 제조하였다. 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310을 영양배지(펩톤 5 g, 효모 추출물 2.5 g, 글루코즈 5 g/증류수 1L) 5 ml에 접종하여 25℃에서 24시간 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 24시간 동안 2차 전배양을 하였다. 상기 2차 전배양액을 다시 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 18시간 동안 본 배양 하였다.

2) 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주를 첨가한 김치의 제조

배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 한 후 절여진 배추(82.5 중량%)에 고춧가루(2.5 중량%), 마늘(2 중량%), 생강(0.5 중량%), 대파(2 중량%), 무채(9 중량%)의 일반적인 김치 양념을 혼합한 후 류코노스톡 메센테로이드 DSR1310 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

비교예 1: 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 균주를 첨가한 김치의 제조

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합 후, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

비교예 2: 균주 미첨가 김치의 제조

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합하여 김치를 제조하였다.

상기 실시예 7, 비교예 1 및 비교예 2의 김치를 10℃에서 20일간 저장하면서, 일정 간격으로 김치를 샘플링한 후, 각 김치의 산도, 총유산균 수를 측정하여 관능평가를 실시하였다.

실험예 1: 산도 측정

상기 실시예 7, 비교예 1 및 비교예 2의 김치를 대상으로 산도를 측정하였다. 각 김치 100 g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 김치액 20 ㎖를 0.1N NaOH을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화적정한 후 소비된 NaOH의 양을 하기의 식에 따라 젖산 함량(％)으로 환산하여 산도를 구하였다:

[수학식 1]

산도(%) = {0.00908 x 1N NaOH 인자^* x 1N NaOH 첨가량} / 시료 무게

^*1N NaOH 인자 = 1

도 1에 나타난 바와 같이, 숙성 초기에는 각 김치의 산도 차이가 별로 크지 않았으나, 숙성기간이 길어질수록 산도의 차이가 벌어졌다. 본 발명에 따른 유산균을 이용하여 제조된 김치의 경우 산도 증가 속도가 다른 김치에 비해 완만함을 보였다. 반면, 다른 유산균이 첨가된 김치와 무첨가군은 모두 숙성 12일째에 산도 0.8%를 초과하였으며 20일째에는 산도가 더욱 증가하는 것으로 나타났다.

실험예 2: 김치의 유산균수 측정

상기 실시예 7, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조된 각 김치의 유산균 수를 측정하였다. 10℃에서 12일 동안 숙성시킨 각 김치를 0.85% 식염수로 10배 희석하여 김치 희석액을 제조하였다. 총 유산균 수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 MRS 아가 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 또한, 류코노스톡 균수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 PES 아가 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다. 또한 우점율(%)은 총 유산균 균수 중 유산균 스타터(PES 아가 플레이트에 나타나는 류코노스톡 속 균주 중 유산균 스타터와 형태학적 타입이 일치하는 균)의 균수의 비율로 계산하였다(수학식 2). 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

[수학식 2]

우점율(%) = {(스타터를 첨가한 김치의 류코노스톡 속 균주의 수 / 스타터를 첨가하지 않은 김치의 류코노스톡 속 균주의수)} x 100

제조된 김치의 유산균 수 측정 결과

스타터 첨가 유산균	총 유산균수	류코노스톡 균주	우점율(%)
류코노스톡 메센테로이드 DSR1310	9.E+08	6.E+08	70.33
류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471	9.E+08	3.E+08	34.44
스타터 무첨가	9.E+08	2.E+08	21.95

그 결과, 상기 표 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치에서 류코노스톡 속 균주가 종래 유산균을 첨가하여 제조된 김치에 비해 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치의 경우, 류코노스톡 속 균주의 우점율도 70.33%로 높게 나타났다.

상기 결과들은 본 발명의 유산균을 이용하여 김치를 제조하는 경우, 김치의 발효를 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

실험예 3: 관능 평가

상기 실시예 6, 비교예 1 및 비교예 2의 김치 산도 0.6-0.7%에 대하여 훈련된 검사요원 50명에 의하여 관능검사를 수행하였다. 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였으며, 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

제조된 김치의 관능검사 결과

스타터 첨가 유산균	종합적인 맛	탄산미	이미	이취	외관
류코노스톡 메센테로이드 DSR1310	4.5	4.3	1.0	1.0	3.5
류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471	4.0	3.8	1.5	1.3	2.5
스타터 무첨가	3.5	3.3	2.0	1.5	2.0

그 결과, 상기 표 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 관능 특성이 종래 유산균을 이용하여 제조된 김치에 비해 전반적으로 우수한 것으로 평가되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11503P 20131219

Claims (7)

1. 저 산생성능을 가지며 내산성, 내염성 및 항균력이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P).
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 pH 3.5-5.0에서 내산성을 갖고, NaCl 2-4%에서 내염성을 갖는 것을 특징으로 하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P).
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가용 조성물.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 또는 이의 배양물을 포함하는 발효식품.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 발효식품은 김치인 것을 특징으로 하는 발효식품.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주(KCCM11503P) 및 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는 발효식품의 제조 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 발효식품은 김치인 것을 특징으로 하는 방법.

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