WO2020075949A1 - 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2020075949A1
WO2020075949A1 PCT/KR2019/006936 KR2019006936W WO2020075949A1 WO 2020075949 A1 WO2020075949 A1 WO 2020075949A1 KR 2019006936 W KR2019006936 W KR 2019006936W WO 2020075949 A1 WO2020075949 A1 WO 2020075949A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
atg
strain
lactobacillus plantarum
vaginitis
lactic acid
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/006936
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
백보람
강지희
박건석
임성훈
정도윤
이용현
Original Assignee
(주) 에이투젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주) 에이투젠 filed Critical (주) 에이투젠
Priority to CN201980036590.4A priority Critical patent/CN112313325B/zh
Priority to US17/051,007 priority patent/US11447741B2/en
Publication of WO2020075949A1 publication Critical patent/WO2020075949A1/ko
Priority to US17/527,002 priority patent/US20220064589A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a novel Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8, a composition for preventing or treating vaginitis comprising the same.
  • Vaginitis is an inflammatory disease that occurs in the female urinary system (urogenital system). Vaginitis can be largely divided into infectious and non-infectious diseases. It is not easy to self-diagnose the cause of the disease before accurate medical analysis. Symptoms of typical vaginitis include odor, excessive secretion, increased pH, edema caused by inflammation, erythema, and cracking of the skin (Morris et al., 2001; Egan and Lipsky, 2002). The specific proportion of infectious vaginitis is expected to be bacterial vaginosis 40-50% candidiasis 25-25% trichomonal vaginitis 15-20% (Sobel, 1997; Egan and Lipsky, 2002).
  • antibiotics, antifungal agents, or combinations are attempted to be administered by oral or oral direct administration.
  • infectious vaginitis the main causative agent of bacterial vaginosis is Gardnerella vaginalis
  • Candida albicans is a representative causative agent in candidal vaginitis.
  • lactobacilli that can produce hydrogen peroxide are reduced in the vagina by various causes, including excessive antibiotics, stress, and primary vaginosis caused by internal factors, resulting in direct sterilization and lactobacilli by hydrogen peroxide.
  • the lactic acid produced is markedly reduced and the pH is increased, creating an environment where various bacteria can easily grow (Sobel, 1997). Therefore, adding lactic acid bacteria capable of lowering the pH again, and supplementing lactic acid bacteria having the ability to generate hydrogen peroxide, among other things, is one important way to improve female genital health.
  • the present inventors have been studying various methods for improving vaginitis using lactic acid bacteria, and the novel Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8 has antibacterial effects against various vaginitis-causing bacteria and are immune
  • the present invention was completed by confirming that the enhancement efficacy is excellent.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Registered Patent No. 10-1750468 (Name of the invention: composition comprising Lactobacillus permentum MG901 or Lactobacillus plantarum MG989, Applicant: Mediogen Co., Ltd. and one other, registration date: June 2017 19th)
  • Patent Document 2 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1098241 (Name of invention: Lactobacillus sp. Having activity to inhibit urinary tract infection and candidal vaginitis. H. 7801 and products containing it as an active ingredient, Applicant: Korea Yakult, Registration Date: December 19, 2011)
  • Patent Document 3 Korean Registered Patent No. 10-1860513 (Invention name: Composition for preventing or treating Candida vaginitis, including Lactobacillus salivarius MG242 separated from the vagina, Applicant: Mediogen Co., Ltd. : May 16, 2018)
  • Patent Document 4 Korean Registered Patent No. 10-1784847 (Name of invention: Composition containing lactic acid bacteria for prevention and treatment of vaginitis and its use, Applicant: Ha Dong-cheon Co., Ltd., Registration date: September 28, 2017)
  • Non-Patent Document 1 Aslim B, Onal D, Beyatli Y. 2007. Factors influencing autoaggregation and aggregation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus isolated from handmade yogurt. J Food Protec 70: 223-227.
  • Non-Patent Document 2 Begley M, Hill C, Gahan CGM. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl Environ Microbiol 72: 1729-1738.
  • Non-Patent Document 3 Bover-Cid S, Holzapfel WH. 1999. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 53: 33-41.
  • Non-patent document 4 Dashkevicz MP, Feighner SD. 1989. Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Appl Envrion Microbiol 55: 11-16.
  • Non-Patent Document 5 de Vries MC, Vaughan EE, Kleerebezem M, de Vos WM. 2006. Lactobacillus plantarum-survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract. Int Dairy J 16: 1018-1028.
  • Non-Patent Document 6 EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). 2012. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal 10 (6): 2740.
  • Non-patent document 7 Egan M, Lipsky MS. 2002. Vaginitis: case reports and brief review. AIDS Patient Care STDS 16: 367-373.
  • Non-Patent Document 8 Fielding CA, MacLoughlin RM, McLeod L, Colmont CS, Najdovska M, Grail D, et al. 2008. IL-6 regulates neutrophil trafficking during acute inflammation via STAT3. J Immunol 181: 2189-2195.
  • Non-patent document 9 Fiorentino DF, Zlotnik A, Mosmann TR, Howard M, O'Garra. 1991. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol 147: 3815-3822.
  • Non-Patent Document 10 Handley PS, Harty DWS, Wyatt JW, Brown CR, Doran JP, Gibbs AC. 1987. A comparison of the adhesion, coaggregation and cell-surface hydrophobicity properties of fibrillary and fimbriate strains of Streptococcus salivarius. J Gen Microbiol 133: 3207-3217.
  • Non-Patent Document 11 McGroarty JA, Tomeczek L, Pond DG, Reid G, Bruce AW. 1992. Hydrogen peroxide production by Lactobacillus species: correlation with susceptibility to the spermicidal compound nonoxynol-9. J Infect Diseases 165: 1142-1144.
  • Non-Patent Document 12 Morris M, Nicoll A, Simms I, Wilson J, Catchpole M. 2001. Bacterial vaginosis: a public health review. Br J Obstet Gynaecol 108: 439-450.
  • Non-Patent Document 13 Scheller J, Chalaris A, Schmidt-Arras D, Rose-John S. 2001. The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6. Biochim Biophys Acta 1813 (5): 878-888.
  • Non-Patent Document 14 Sobel JD. 1997. Vaginitis. N Engl J Med 337: 1896-1903.
  • Non-Patent Document 15 Vujanovic NL. 2011. Role of TNF superfamily ligands in innate immunity. Immunol Res 50: 159-174.
  • An object of the present invention is to provide a novel lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8, a composition for preventing or treating vaginitis comprising the same.
  • the present invention is Lactobacillus plantarum ATG-K2 ( Lactobacillus plantarum ATG-K2) having antimicrobial efficacy against the causative agent of vaginitis selected from one or more of Candida albicans and Gardnerella vaginalis , Accession number KCTC 13577BP), Lactobacillus plantarum ATG-K6 ( Lactobacillus plantarum ATG-K6, accession number KCTC 13570BP) or Lactobacillus plantarum ATG-K8 ( Lactobacillus plantarum ATG-K8, accession number KCTC 13571BP) will be.
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8 are Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes , Strepto Streptococcus mutans , Streptococcus salivarius , Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa and Chronobacter sakazakii , and more than one group of Cronobacter sakazakii It has antibacterial efficacy against selected bacteria.
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8 has no hemolysis, histamine, tyramine, putrecine and It is characterized in that it does not produce a biogenic amine selected from one or more of the group consisting of cadaverine.
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 Lactobacillus plantarum ATG-K6, or Lactobacillus plantarum ATG-K8 has an active function of bile salt hydrolase, and is capable of generating hydrogen peroxide or It is characterized by having antioxidant capacity.
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8 are ampicillin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, strepto It is characterized in that it has no resistance to antibiotics selected from one or more of the group consisting of mycin (streptomycin), clindamycin, erythromycin, tetracycline and chloramphenicol.
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8 is one of IL-6 (interleukin-6) and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ) It has an innate immune activity function that increases the cytokines selected above, and an anti-inflammatory activity that increases IL-10 (interleukin-10).
  • IL-6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or improving vaginitis comprising Lactobacillus plantarum ATG-K2, Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving vaginitis comprising Lactobacillus plantarum ATG-K2, Lactobacillus plantarum ATG-K6 or Lactobacillus plantarum ATG-K8.
  • the strain of the present invention can be cultured in a liquid or solid medium (broth or agar) of MRS, Lactobacillus plantarum K2 in MRS broth is about 5 ⁇ 10 8 CFU / mL, Lactobacillus plantarum K6 is about 3 ⁇ . 10 9 CFU / mL, Lactobacillus plantarum K8 can be cultured to a concentration of about 3 ⁇ 10 9 CFU / mL.
  • the optimum cultureable temperature is 37 ° C
  • the minimum temperature is 15 ° C
  • the maximum temperature is 38 ° C
  • the optimum pH is 6.5
  • the minimum cultureable pH is 4.0.
  • the maximum pH is 7.8.
  • the optimum incubation time is 16 hours and the minimum incubation time is 10 hours and the maximum incubation time is 120 hours.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vaginitis containing the novel Lactobacillus plantarum strains ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8.
  • the novel Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8 may be added as 0.001 to 30% by weight to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, etc. according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in the strain of the present invention, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, It is prepared by mixing gelatin. Also, lubricants such as magnesium stearate and talc are used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories and vaginal suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspension propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, gender, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of those skilled in the art, and dosages generally range from 0.01 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. A more preferred dosage is 1 mg / kg / day to 500 mg / kg / day.
  • the administration may be administered once a day, or may be divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to various mammals, such as rats, livestock, and humans. Since the strain of the present invention has little toxicity and side effects, it is a drug that can be safely used even for a long period of time for prevention purposes.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving vaginitis containing the novel Lactobacillus plantarum strains ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8.
  • the Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8 may be added as 0.001 to 50% by weight to the health functional food of the present invention.
  • the health functional food of the present invention includes tablets, capsules, pills or liquids, and foods to which the strain of the present invention can be added, for example, various drink agents, meat, sausage, bread, candy, There are snacks, noodles, ice cream, dairy products, soups, ionic beverages, drinks, alcoholic beverages, gum, tea and vitamin complexes.
  • the present invention relates to a novel Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8, a composition for preventing or treating vaginitis comprising the same
  • the Lactobacillus plantarum strains ATG-K2, ATG- K6 or ATG-K8 is an antibacterial effect against various pathogenic strains, as well as Candida albicans and Gardnerella vaginalis , which are the causative agents of vaginitis, and is a therapeutic composition for bacterial vaginosis or Candida vaginitis. Or it can be easily used as a health functional food for the prevention and improvement of these diseases.
  • Figure 1 is a diagram showing the comparison of the 16S rRNA base sequence of each strain of Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention.
  • Figure 2 shows the results confirming the heat resistance of each of the strains Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of confirming the hemolytic properties of each strain of Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention (Figure 3A) and bioamine production results (Figure 3B).
  • Figure 4 shows the results of confirming the bile salt hydrolase activity of each strain of Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention (FIG. 4A), the result of confirming the hydrogen peroxide generation capacity (FIG. 4B) and the antioxidant capacity (FIG. 4C).
  • Figure 5 is the growth inhibition rate for Candida albicans KCTC7678 (CA) of each strain of Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention (Figure 5A), growth inhibition rate for Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV) ( Figure 5B), Candida albicans
  • the coagulation rate for KCTC7678 (CA) (FIG. 5C) and the coagulation rate for Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV) (FIG. 5D) are shown.
  • FIG. 6 shows co-culture results with Candida albicans KCTC7678 (CA) (FIGS. 6A and 6B) and co-culture results with Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV) for each strain of Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 of the present invention (FIG. 6C and FIG. 6D).
  • CA Candida albicans KCTC7678
  • GV Gardnerella vaginalis KCTC5096
  • Lactobacillus plantarum ATG-K2 (hereinafter K2), Lactobacillus plantarum ATG-K6 (hereafter K6), Lactobacillus plantarum ATG-K8 (hereafter K8), isolated from kimchi samples in Chungcheong, South Korea, were used as lactic acid bacteria in January 2016. .
  • the bacteria used in the antibacterial experiment are Staphylococcus aureus KCTC1621 (hereinafter SA), Escherichia coli KCTC1682 (hereinafter EC), Pseudomonas aeruginosa KCTC2004 (hereinafter PA), Listeria monocytogenes KCTC3569 (hereafter LM), Cronobacter sakazakii KCTC2949 (hereafter CS), Streptoc SM), Streptococcus salivarius ATG-P1 (hereinafter SS) of seven infectious or opportunistic bacteria were used.
  • SA Staphylococcus aureus KCTC1621
  • EC Escherichia coli KCTC1682
  • PA Pseudomonas aeruginosa KCTC2004
  • LM Listeria monocytogenes KCTC3569
  • CS Cronobacter sakazakii KCTC2949
  • Streptoc SM Strept
  • Candida albicans KCTC7678 (CA) was used as a fungal model, and Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV) was used as a bacterial model.
  • Lactic acid bacteria were cultured in MRS (Difco Laboratories, USA) agar or broth medium, and bacteria except GV were cultured in BHI (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories, USA) agar or broth medium.
  • BHI Brain Heart Infusion, Difco Laboratories, USA
  • GV was inoculated in BHI agar or broth medium containing 20% of heat treated horse serum (Gibco, USA) and then anaerobic cultured using an Oxoid TM AnaeroGen TM system (Oxoid, UK).
  • CA was cultured in YM (Difco Laboratories, USA) agar or broth medium. All microorganisms were incubated for about 20 hours at 37 ° C.
  • Example 2-1 Confirmation of nucleotide sequence of 16S rRNA of lactic acid bacteria
  • each strain has the following nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3, and as shown in FIG. 1, three strains were consistent with Lactobacillus plantarum , and each strain of K2, K6, and K8 As a result of comparing the base sequences of, it was shown that 1 base differs from each other (FIG. 1).
  • SEQ ID NO: 3 Lactobacillus_plantarum_ATG-K8_16S_rRNA_sequence_partial
  • API50 CH test (BioMerieux, France) was performed to identify the characteristics and characteristics through the sugar fermentation pattern.
  • API 50CHL medium BioMerieux, France
  • lactic acid bacteria purely cultured in 10 mL API 50CHL medium (BioMerieux, France) were suspended to have an absorbance of OD 600 of about 0.5, and then the suspension culture was inoculated into each cuple of the API 50CH test strip and cultured at 37 ° C.
  • Sugar fermentation results were confirmed at 24, 48, and 72 hours after inoculation, and the results are shown in Table 1.
  • sugar fermentation patterns as APIWEB database reference provided by the BioMerieux K2 is 52%, K6 is 99.4% in the Lactobacillus plantarum 1 group in Lactobacillus plantarum 1 group, K8 is a 99.5% similarity to Lactobacillus plantarum 1 group Shown. K2 and K8 strains do not decompose L-arabinose as a distinct sugar fermentation feature, whereas K6 has a dark green low potency (w, weak). K2 did not ferment melizetose and raffinose, K6 fermented both, and K8 fermented melizetose only. Turanose fermentation capacity was found in K6 and K8. Through these results, differences between each of the three strains can be confirmed for the sugar fermentation pattern.
  • each viable cell count is expressed as a Log 10 CFU / mL value, and the number in parentheses means the survival rate (%) compared to the initial.
  • Each result is the average value of 3 independent experiments.
  • K8 having a survival rate of 74.32% was found to have the best heat resistance.
  • K6 was identified in the order of 68.88% and K2 in 70.95%.
  • K2 is approximately 5 ⁇ 10 8 CFU / mL
  • K6 is about 3 ⁇ 10 9 CFU / mL
  • K8 is about 3 ⁇ 10 9 CFU / mL Concentration.
  • Example 2-4 Confirm the hemolytic action of lactic acid bacteria
  • Example 2-5 Check if lactic acid bacteria produce bioamines
  • bioamines biogenic amines
  • tyramine histamine, tyramine, putrecine, and cadaverine, which may be harmful to the human body
  • Bover-Cid and Holzapfel after preparing the medium according to the composition of the test medium presented in 1999, inoculated with each lactic acid strain and cultured for about 72 hours at 37 °C to observe the color change of the medium.
  • the bioamine is positive
  • the pH value of the surrounding bacteria is inoculated by the action of decarboxylase, and the bromocresol purple reagent contained in the medium changes from yellow to purple.
  • Antibiotic tests were conducted using 9 antibiotic E-test strips (BioMerieux, France) of ampicillin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, streptomycin, clindamycin, erythromycin, tetracycline, and chloramphenicol to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) value.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • lactic acid bacteria to be tested were each suspended at about OD 600 absorbance of 0.8 and plated on MRS solid medium using sterilized cotton swabs. After the solid medium coated with lactic acid bacteria was dried for about 3 minutes, the E-test strip was raised and incubated at 37 ° C for 48 hours.
  • each value in Table 3 is ⁇ g / ml, and each abbreviation is as follows: AMP, ampicillin; VAN, vancomycin; GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; STR, Streptomycin; CD, clindamycin; ERY, erythromycin; TET, tetracycline; CM, Chloramphenicol; NR, not required.
  • Example 2-7 Confirm antibacterial effect of lactic acid bacteria
  • 8 mm paper disc (Advantec, Japan) was attached to the dried test agar medium and inoculated into paper discs of 35 ⁇ L of K2, K6 and K8 bacteria cultured in MRS broth for about 18 to 20 hours, and dried for about 3 minutes. , Cultured at 37 ° C and observed progress. The size of the inhibitory ring produced after cultivation was measured, and the final value was calculated by subtracting 8 mm, the diameter of the paper disc.
  • the diameter of the inhibitory ring which is the numerical value of Table 4, is mm, and the abbreviations are as follows: Staphylococcus aureus KCTC1621 (SA), Listeria monocytogenes KCTC3569 (LM), Streptococcus mutans KCTC3065 (SM), Streptococcus salivarius ATG-P1 (SS ), Escherichia coli KCTC1682 (EC), Pseudomonas aeruginosa KCTC2004 (PA), Cronobacter sakazakii KCTC2949 (CS).
  • SA Staphylococcus aureus KCTC1621
  • LM Listeria monocytogenes KCTC3569
  • SM Streptococcus mutans KCTC3065
  • SS Streptococcus salivarius ATG-P1
  • SS Escherichia coli KCTC1682
  • PA Pseudomonas aeruginosa KCTC
  • bile salt hydrolase BSH
  • agar medium was prepared by adding 0.5% (w / v) sodium taurocholic acid (TDCA, Sigma-aldrich, Germany) to MRS.
  • TDCA 0.5% sodium taurocholic acid
  • K2, K6 and K8 lactic acid bacteria were inoculated into the agar medium, placed in an anaerobic jar, and cultured at 37 ° C for 72 hours to confirm the results.
  • K2, K6 and K8 lactic acid bacteria all have BSH activity, which is a characteristic phenomenon of Lactobacillus plantarum with BSH activity. Confirmed.
  • Example 2-9 Hydrogen peroxide generation capacity check
  • each lactic acid bacteria hydrogen peroxide generation capacity was made by adding 0.25 mg / mL tetramethylbenzidine (Sigma-aldrich, Germany) and 0.01 mg / mL to MRS to make agar medium (McGroarty et al., 1992). However, additives were added when MRS agar was about 50 ° C after autoclaving.
  • MRS agar was about 50 ° C after autoclaving.
  • Each lactic acid bacterium was inoculated into a completely hardened test agar medium, placed in an anaerobic jar, and cultured at 37 ° C for 48-72 hours. After incubation, the lactic acid bacteria were taken out of the anaerobic jar and exposed to air to observe colony and color change around.
  • the ability to generate hydrogen peroxide was changed to colony of each lactic acid bacteria and the adjacent surface was dark blue, which means that K2, K6 and K8 lactic acid bacteria produced hydrogen peroxide.
  • a radical scavenge experiment was performed using 2, 2'-Azino-Bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma-aldrich, Germany) to evaluate the antioxidant function of each lactic acid bacteria.
  • ABTS 2, 2'-Azino-Bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • ABTS 2, 2'-Azino-Bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • BSH is involved in secondary bile salt metabolism, so when the strains of the present invention are developed as a product that ingests lactic acid bacteria having the activity of BSH, it is bile-resistant of lactic acid bacteria, and the cholesterol metabolism of the host It can be confirmed that the host has a cholesterol-lowering function by participating in an intermediate process (Begley et al., 2006).
  • the ability of the lactic acid bacteria of the present invention to produce hydrogen peroxide can inhibit the proliferation of vaginitis-causing bacteria and opportunistic bacteria by helping with antibacterial activity.
  • Example 3-1 Check the growth of lactic acid bacteria culture
  • a cell free culture supernatant (CFCS) 10 times concentrated was prepared to measure growth inhibition of lactic acid bacteria cultures against vaginal pathogens.
  • the culture medium of K2, K6 and K8 lactic acid bacteria was centrifuged at 4,000 rpm for 25 minutes to separate the cells and culture supernatant of lactic acid bacteria, and the culture supernatant was filtered using a 0.2 ⁇ m pore syringe filter (Satorious, Germany).
  • the filtered culture supernatant was lyophilized and suspended in 1X PBS to prepare a 10-fold concentrate compared to the initial culture volume.
  • CA was inoculated at a concentration of 1 ⁇ 10 5 CFU / mL
  • GV was inoculated according to each culture condition at a concentration of 1 ⁇ 10 6 CFU / mL.
  • the CFCS of lactic acid bacteria was added to the vaginal pathogen inoculation solution to be 1X so that it was 0.1 times the final volume, and the test group without CFCS was used as a control.
  • the composition after mixing was cultured for 24 hours for CA and 48 hours for GV according to the culture conditions of each vaginal pathogen, and absorbance was measured at a wavelength of OD 600 . Based on the measured absorbance, the growth inhibition rate was calculated by the following formula for calculating cytotoxicity.
  • OD control refers to the absorbance of the control group
  • OD cfcs refers to the CFCS-added group.
  • each lactic acid bacteria and vaginitis-causing bacteria were centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitated cells were washed with 1X PBS. After repeating the washing twice, the cells were suspended using 1X PBS to have an absorbance of 1.0 at OD 600 wavelength.
  • the suspension of the lactic acid bacteria and the vaginitis-causing bacteria were mixed at the same volume ratio, homogenized through vortexing, and left as it was, and the supernatant portion of the mixed solution was carefully obtained at 1, 4, and 8 hours to measure absorbance.
  • the suspension without mixing each bacteria was used as a control. Based on the measured absorbance, the coagulation rate was calculated by the following formula.
  • OD patho means vaginal pathogen
  • OD LAB means lactic acid bacteria
  • OD mix means absorbance of the mixed solution of each bacteria.
  • Coaggregation (%) ⁇ (OD patho + OD LAB ) / 2-OD mix ⁇ / (OD patho + OD LAB ) / 2
  • K2 is 70.73%
  • K6 is 58.57%
  • K8 is 57.88% for CA at the last 8 hours as shown in FIGS. 5C and 5D.
  • K2 was 32.72%
  • K6 was 30.39%
  • K8 was 20.45%.
  • the strain of the invention has a very good balance of vaginal flora and the efficacy of preventing infection.
  • CA and GV growth inhibition of the K6 and K8 culture medium has an antibacterial effect on substances discharged out of cells of the lactic acid bacteria, and through this coagulation ability, the strain of the present invention is in close contact with the diseased germs, thereby preventing sterilization and growth inhibition. It can be confirmed that it can be maximized.
  • the anti-inflammatory effect of the lactic acid bacteria of the present invention was tested for sterilizing ability against the yeast infection causative bacteria through coculture.
  • the CA was adjusted to a concentration ratio of about 2.5 ⁇ 10 6 CFU / mL, and each lactic acid bacteria was about 2.5 ⁇ 10 6 CFU / mL, and co-culture was performed in a culture mixture of YM and MRS 1: 1.
  • GV was inoculated into 10% horse serum BHI broth at a 1: 1 ratio concentration of about 1.0 ⁇ 10 8 CFU / mL, and each lactic acid bacteria was about 1.0 ⁇ 10 8 CFU / mL.
  • Each co-culture experiment was performed for 48 hours.
  • samples were obtained in the initial and every 24 hours, and the number of viable cells was measured through a serial dilution method and a plate culture smear.
  • YM plate medium with ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml was used to measure CA only
  • colony using 5% rabbit blood BHI plate medium was used to distinguish colony between GV and lactic acid bacteria.
  • CFU was measured by morphology.
  • Example 4-1 Enhancement effect of lactic acid bacteria on innate immunity
  • a cytokine quantitative experiment using cells was performed.
  • Cells were used as rat macrophage cell line RAW264.7, and the medium conditions used in each cell experiment were Gibco with 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) and 1% penicillin / streptomycin cocktail (Sigma-aldrich, Germany). ® dulbecco modified eagle medium (DMEM, Gibco, USA) was used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • RAW264.7 cells cultured with about 80-90% confluency were collected and seeded to be 1 ⁇ 10 6 cells per well of a 24 well plate. After seeding, the cells were cultured in an environment of 37 ° C.
  • Each lactic acid bacteria lysate is treated at a concentration of 100 ⁇ g / ml and 500 ⁇ g / ml for each well, and 1 ⁇ g / ml of Lipopolysaccharide (LPS, Sigma-aldrich, Germany) is used as a positive control and no substance is treated as a negative control.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • An experimental group was used. After 24 hours of material treatment, the cells were cultured in an environment of 37 ° C., 5% CO 2 , and the cell culture solution was recovered to perform enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for IL-6 and TNF- ⁇ .
  • IL-6 was measured using a Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit (R & D systems, USA), and TNF- ⁇ was measured using a Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit (R & D systems, USA).
  • the inflammation inhibitory effect experiment was conducted in the same manner as in the experimental method for confirming the increase in innate immunity of Example 4-1, but an experimental group in which LPS was treated with lactic acid bacteria lysate was added. This is an experiment that measures the ability to suppress inflammation induced by LPS.
  • each experimental group was cultured in an environment of 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours after material treatment, and the cell culture solution was recovered to obtain ELISA for IL-10 and mouse IL-10 Quantikine ELISA Kit (R & D systems, USA). It was measured using.
  • IL-6 is a very important cytokine in immunoregulation, such as proinflammatory and anti-inflammatory actions, such as macrophage activation, neutrophil induction and aggregation, and inflammatory response to invading pathogens (Scheller et al., 2001; Fielding et. al., 2008).
  • K2, K6 and K8 lactic acid bacteria are safe, have antibacterial activity against vaginal pathogens, have anti-oxidant effects, and are capable of ultimately enhancing the genitourinary system health of the user through the effect of increasing innate immunity and suppressing inflammation. Is confirmed.
  • genomic DNA was extracted for full-length genomic analysis of K2, K6, and K8 lactic acid bacteria, and the sequencing was performed using Pacific Bioscience's Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing technique.
  • the produced sequence data was assembled using the Hierarchical Genome Assembly Process (HAGP) 2 protocol of SMRT analysis software v2.3.0, Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST) server for annotation (http://rast.nmpdr.org /) Was used.
  • RAST Subsystem Technology
  • ANI average nucleotide identity
  • Lactobacillus plantarum K2, K6 and K8 strains of the full-length genome analysis results Attribute ATG-K2 ATG-K6 ATG-K8 Total genome size (bp) 3,175,098 3,262,505 3,275,764 Chromosome size 3,034,884 3,205,672 3,221,272 Plasmid number 3 One One DNA G + C (%) 45.19 44.54 44.54 Total genes 3,114 3,178 3,186 Protein coding genes 2,857 2,999 2,999 rRNA genes 16 16 16 tRNA genes 65 67 67 ncRNA genes 4 4 4 Pseudo genes 172 92 100 GenBank accession GCA_003597635.1 GCA_003597595.1 GCA_003597615.1
  • K2 lactobacillus has 49 genes related to cell wall and capsule
  • K6 and K8 lactobacilli have 71 genes
  • carbohydrate-related genes have 215 K2 lactobacilli, 235 K6 lactobacilli, and K8 lactobacilli Appeared to have 245.
  • Their differences are the results supporting the different growth rates and functionalities of the three lactic acid bacteria, even though they belong to the same species.
  • Lactobacillus plantarum K2, K6 or K8 lactic acid bacteria of the present invention was added to the cooking seasoning at 1% by weight to prepare a cooking seasoning for promoting health.
  • Lactobacillus plantarum K2, K6 or K8 lactic acid bacteria of the present invention was added to milk at 0.1% by weight, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared using the milk.
  • Lactobacillus plantarum K2, K6 or K8 lactic acid bacteria of the present invention was added to 1,000 ml of tomato juice or carrot juice to prepare a vegetable juice for health promotion.
  • Lactobacillus plantarum K2, K6 or K8 of the present invention 0.1 g of one of the lactic acid bacteria was added to 1,000 ml of apple juice or grape juice to prepare a fruit juice for health promotion.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8은 질염의 원인균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 뿐만 아니라 각종 병원성 균주에 대한 항균효과가 뛰어나 세균성 질염이나 칸디다성 질염 등의 치료용 조성물 또는 이들 질환의 예방과 개선을 위한 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
질염은 여성 비뇨 생식기계 (urogenital system)에 발생하는 염증성 질환으로 질염은 크게 감염성과 비감염성의 질환으로 나눌 수 있으며, 정확한 의학적 분석 이전에는 발병 원인에 대한 자가진단이 쉽지 않다. 대표적인 질염의 증상은 악취, 분비물의 과다 발생, pH의 증가, 염증으로 인한 부종, 홍반, 피부의 갈라짐등이 있다 (Morris et al., 2001; Egan and Lipsky, 2002). 그 중 감염성 질염의 세부적인 비율은 세균성 질염 (bacterial vaginosis) 40-50% 칸디다성 질염 (vaginal candidiasis) 25-25% 트리코모나스성 질염 (trichomonal vaginitis) 15-20%로 예상되고 있다 (Sobel, 1997; Egan and Lipsky, 2002). 일반적으로 감염 원인에 따라 주로 항생제, 항진균제 또는 복합적으로 경구 또는 환부 직접 투여로 치료를 시도한다. 감염성 질염에서 세균성 질염의 주요 원인균은 Gardnerella vaginalis가 대표적이며, 칸디다성 질염에서는 Candida albicans가 대표적인 원인균이다. 이러한 감염성 질환의 발병 기전의 핵심은 과도한 항생제, 스트레스, 내부적 요인으로 인한 1차 질염 발생 등 다양한 원인에 의해 과산화수소를 생성할 수 있는 lactobacilli들이 질 내에서 줄어들고, 결과적으로 과산화수소에 의한 직접 살균과 lactobacilli가 생성하는 lactic acid가 현저하게 줄어들어 pH가 증가하여 다양한 세균들이 쉽게 자랄 수 있는 환경이 조성된다 (Sobel, 1997). 따라서, pH를 다시 낮춰줄 수 있는 유산균을 투입하고, 그 중에서도 과산화수소 생성능이 있는 유산균을 보충해 주는 것이 여성의 생식기 건강을 향상할 수 있는 하나의 중요한 방법이다.
이에 본 발명자들은 유산균을 활용한 질염의 개선방법에 대해 다양한 연구를 하던 중, 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8가 각종 질염 원인균에 대한 항균 효과가 있고 면역증진 효능이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제10-1750468호 (발명의 명칭 : 락토바실러스 퍼멘툼 MG901 또는 락토바실러스 플란타룸 MG989를 포함하는 조성물, 출원인 : 주식회사 메디오젠 외 1인, 등록일 : 2017년06월19일)
(특허문헌 2) 대한민국 등록특허 제10-1098241호 (발명의 명칭 : 요로감염과 칸디다성 질염을 억제하는 활성을 갖는 락토바실러스 에스피. 에이취와이 7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품, 출원인 : 주식회사한국야쿠르트, 등록일 : 2011년12월19일)
(특허문헌 3) 대한민국 등록특허 제10-1860513호 (발명의 명칭 : 질에서 분리한 락토바실러스 살리바리우스 MG242를 포함하는 칸디다성 질염의 예방 또는 치료용 조성물, 출원인 : 주식회사 메디오젠 외 1인, 등록일 : 2018년05월16일)
(특허문헌 4) 대한민국 등록특허 제10-1784847호 (발명의 명칭 : 질염 예방 및 치료용 유산균 함유 조성물 및 이의 용도, 출원인 : 주식회사 하우동천, 등록일 : 2017년09월28일)
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Aslim B, Onal D, Beyatli Y. 2007. Factors influencing autoaggregation and aggregation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus isolated from handmade yogurt. J Food Protec 70:223-227.
(비특허문헌 2) Begley M, Hill C, Gahan CGM. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl Environ Microbiol 72:1729-1738.
(비특허문헌 3) Bover-Cid S, Holzapfel WH. 1999. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 53:33-41.
(비특허문헌 4) Dashkevicz MP, Feighner SD. 1989. Development of a differential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillus spp. Appl Envrion Microbiol 55:11-16.
(비특허문헌 5) de Vries MC, Vaughan EE, Kleerebezem M, de Vos WM. 2006. Lactobacillus plantarum-survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract. Int Dairy J 16:1018-1028.
(비특허문헌 6) EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). 2012. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal 10(6):2740.
(비특허문헌 7) Egan M, Lipsky MS. 2002. Vaginitis: case reports and brief review. AIDS Patient Care STDS 16:367-373.
(비특허문헌 8) Fielding CA, MacLoughlin RM, McLeod L, Colmont CS, Najdovska M, Grail D, et al. 2008. IL-6 regulates neutrophil trafficking during acute inflammation via STAT3. J Immunol 181:2189-2195.
(비특허문헌 9) Fiorentino DF, Zlotnik A, Mosmann TR, Howard M, O’Garra. 1991. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol 147:3815-3822.
(비특허문헌 10) Handley PS, Harty DWS, Wyatt JW, Brown CR, Doran JP, Gibbs AC. 1987. A comparison of the adhesion, coaggregation and cell-surface hydrophobicity properties of fibrillary and fimbriate strains of Streptococcus salivarius. J Gen Microbiol 133:3207-3217.
(비특허문헌 11) McGroarty JA, Tomeczek L, Pond DG, Reid G, Bruce AW. 1992. Hydrogen peroxide production by Lactobacillus species: correlation with susceptibility to the spermicidal compound nonoxynol-9. J Infect Diseases 165:1142-1144.
(비특허문헌 12) Morris M, Nicoll A, Simms I, Wilson J, Catchpole M. 2001. Bacterial vaginosis: a public health review. Br J Obstet Gynaecol 108:439-450.
(비특허문헌 13) Scheller J, Chalaris A, Schmidt-Arras D, Rose-John S. 2001. The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6. Biochim Biophys Acta 1813(5):878-888.
(비특허문헌 14) Sobel JD. 1997. Vaginitis. N Engl J Med 337:1896-1903.
(비특허문헌 15) Vujanovic NL. 2011. Role of TNF superfamily ligands in innate immunity. Immunol Res 50:159-174.
본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 중 1종 이상 선택되는 질염의 원인균에 대한 항균 효능이 있는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2(Lactobacillus plantarum ATG-K2, 기탁번호 KCTC 13577BP), 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6(Lactobacillus plantarum ATG-K6, 기탁번호 KCTC 13570BP) 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8(Lactobacillus plantarum ATG-K8, 기탁번호 KCTC 13571BP)에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8은 스태피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 세균에 대한 항균 효능이 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8은 용혈작용이 없고, 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 푸트렉신(putrecine) 및 카다베르린(cadaverine)으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 생체아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 것이 특징이다.
상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8은 담즙염 분해효소(bile salt hydrolase)의 활성 기능이 있으며, 과산화수소(hydrogen peroxide) 생성능 또는 항산화능이 있는 것을 특징으로 한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8은 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로라암페니콜(chloramphenicol)으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 항생제에 대한 내성이 없는 것을 특징으로 한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8은 IL-6(interleukin-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 중 1종 이상 선택되는 사이토카인을 증가시키는 선천면역 활성 기능이 있으며, IL-10(interleukin-10)을 증가시키는 항염 활성이 있다.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8를 포함하는 질염의 치료 또는 개선용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2, 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6 또는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8를 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 균주는 MRS의 액체 또는 고체 배지(broth 또는 agar)에서 배양 가능하며, MRS broth에서 락토바실러스 플란타룸 K2가 약 5 × 108 CFU/mL, 락토바실러스 플란타룸 K6이 약 3 × 109 CFU/mL, 락토바실러스 플란타룸 K8이 약 3 × 109 CFU/mL의 농도까지 배양가능하다.
이 균주들은 30~37℃에서 16~48시간 배양하는 것이 바람직하며, 배양가능한 최적 온도는 37℃, 최소 온도는 15℃, 최대온도는 38℃이고, 최적 pH는 6.5, 배양가능한 최소 pH는 4.0 최대 pH는 7.8 이다. 최적 배양시간은 16시간이며 최소 배양시간은 10시간 최대 배양시간 120시간이다.
또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8을 함유하는 질염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~30 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 균주에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 질좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 균주는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8을 함유하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~50 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 균주를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주 ATG-K2, ATG-K6 또는 ATG-K8은 질염의 원인균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 뿐만 아니라 각종 병원성 균주에 대한 항균효과가 뛰어나 세균성 질염이나 칸디다성 질염 등의 치료용 조성물 또는 이들 질환의 예방과 개선을 위한 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 16S rRNA 염기서열을 비교하여 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 내열성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3)은 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 용혈성(도 3A)을 확인한 결과 및 생체아민생성 결과(도 3B)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 bile salt hydrolase activity(도 4A) 확인 결과, Hydrogen peroxide 생성능 확인 결과(도 4B) 및 항산화능을 확인한 결과(도 4C)를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주가 갖는 Candida albicans KCTC7678(CA)에 대한 성장저해율(도 5A), Gardnerella vaginalis KCTC5096(GV)에 대한 성장저해율(도 5B), Candida albicans KCTC7678(CA)에 대한 공응집률(도 5C), Gardnerella vaginalis KCTC5096(GV)에 대한 공응집률(도 5D) 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주 각각에 대해, Candida albicans KCTC7678(CA)와의 공배양 결과(도 6A 및 도 6B) 및 Gardnerella vaginalis KCTC5096(GV)와의 공배양 결과(도 6C 및 도 6D)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주가 갖는 선천면역 증강 효과(IL-6와 TNF-α의 증가)를 나타내는 결과이다.
도 8은 본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주가 갖는 염증 억제 효과(IL-10 증가)를 나타내는 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 유산균 및 감염균의 준비>
유산균은 2016년 1월에 대한민국 충청지역 김치 시료로부터 분리한 신규미생물인 Lactobacillus plantarum ATG-K2 (이하 K2), Lactobacillus plantarum ATG-K6 (이하 K6), Lactobacillus plantarum ATG-K8 (이하 K8)를 이용하였다. 항균실험에 사용한 세균은 Staphylococcus aureus KCTC1621 (이하 SA), Escherichia coli KCTC1682 (이하 EC), Pseudomonas aeruginosa KCTC2004 (이하 PA), Listeria monocytogenes KCTC3569 (이하 LM), Cronobacter sakazakii KCTC2949 (이하 CS), Streptococcus mutans KCTC3065 (이하 SM), Streptococcus salivarius ATG-P1 (이하 SS) 의 7종의 감염성 또는 기회감염성 세균을 사용하였다. 질염의 원인으로는 진균성 모델로 Candida albicans KCTC7678 (이하 CA), 세균성 모델로 Gardnerella vaginalis KCTC5096 (이하 GV)를 사용하였다. 유산균은 MRS (Difco Laboratories, USA) agar 또는 broth 배지에서 배양하였고, GV를 제외한 세균은 BHI (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories, USA) agar 또는 broth 배지에서 배양하였다. GV는 열처리 된 horse serum (Gibco, USA) 20%가 함유된 BHI agar 또는 broth 배지에 접종 후 OxoidTM AnaeroGenTM system (Oxoid, UK)를 이용하여 혐기배양하였다. CA는 YM (Difco Laboratories, USA) agar 또는 broth 배지에서 배양하였다. 모든 미생물들은 37℃에서 약 20시간 동안 정치배양하였다.
<실시예 2. 유산균의 생리학적 특성 확인>
실시예 2-1. 유산균의 16S rRNA 염기서열 확인
분자생물학적 동정을 하기 위해 김치로 분리된 유산균 K2, K6 및 K8균주의 16S rRNA 염기서열은 ㈜ 솔젠트 (Solgent, Dajeon)에 의뢰하였다. 염기서열 분석을 위한 primer는 27F (5′ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3′), 518F (5′ - CCA GCA GCC GCG GTA ATA C - 3′), 907R (5′ - CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT - 3′), 1492R (5′ - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3′)을 이용하여 총 4번의 염기서열 reading을 하였고, 각 reading의 염기서열 alignment를 통해 도출된 contig 염기서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST online tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 분석하였다. EMBL-EBI의 Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)를 이용하여 K2, K6 및 K8 균주간의 16S rRNA 염기서열의 상이함을 분석하였다.
이에 대한 16S rRNA sequencing 분석 결과, 각각의 균주가 하기의 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 갖는 것으로 확인되며, 도 1과 같이 3종의 균주가 Lactobacillus plantarum과 일치하였고, K2, K6 및 K8 각 균주의 염기서열을 대조한 결과 상호간 염기서열에 대해 1개 염기의 상이함을 나타내었다 (도 1).
서열번호 1 : Lactobacillus_plantarum_ATG-K2_16S_rRNA_sequence_partial
Figure PCTKR2019006936-appb-I000001
서열번호 2 :Lactobacillus_plantarum_ATG-K2_16S_rRNA_sequence_partial
Figure PCTKR2019006936-appb-I000002
서열번호 3 :Lactobacillus_plantarum_ATG-K8_16S_rRNA_sequence_partial
Figure PCTKR2019006936-appb-I000003
실시예 2-2. 당발효 패턴 특성 확인
당발효 패턴을 통한 동정 및 특성을 파악하기 위해 API50 CH test (BioMerieux, France)를 실시하였다.
간략하게 10 mL API 50CHL medium (BioMerieux, France)에 순수배양된 유산균을 약 0.5의 OD600 흡광도가 되도록 현탁한 후, 현탁배양액을 API 50CH test strip의 각 cuple에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 접종 후 24, 48, 72시간째 시점에서 당발효 결과를 확인하였으며 이에 대한 결과는 표 1에 나타내었다.
Carbohydrates Lb. plantarum ATG-K2 Lb. plantarum ATG-K6 Lb. plantarum ATG-K8
Glycerol - - -
Erythritol - - -
D-Arabinose - - -
L-Arabinose - w -
Ribose + + +
D-Xylose - - -
L-Xylose - - -
Adonitol - - -
Methyl-βD-Xylopyranoside - - -
Galactose + + +
Glucose + + +
Fructose + + +
Mannose + + +
Sorbose - - -
Rhamnose - - -
Dulcitol - - -
Inositol - - -
Mannitol + + +
Sorbitol + + +
Methyl-αD-Mannopyranoside - - -
Methyl-αD-Glucopyranoside - - -
N-Acetylglucosamine + + +
Amygdalin + + +
Arbutin + + +
Esculin + + +
Salicin + + +
Cellobiose + + +
Maltose + + +
Lactose + + +
Melibiose + + +
Sucrose + + +
Trehalose + + +
Inulin - - -
Melezitose - + +
Raffinose - + -
Starch - - -
Glycogen - - -
Xylitol - - -
Gentiobiose w w w
Turanose - + +
Lyxose - - -
Tagatose - - -
D-Fucose - - -
L-Fucose - - -
D-Arabitol - - -
L-Arabitol - - -
Gluconate w w w
2-keto-glugonate - - -
5-keto-gluconate - - -
(+는 양성반응, w는 약한 양성반응 -는 음성반응)
표 1을 참고하면, 당 발효 패턴은 BioMerieux에서 제공하는 APIWEB database 기준으로 K2는 Lactobacillus plantarum 1군에 52%, K6는 Lactobacillus plantarum 1군에 99.4%, K8은 Lactobacillus plantarum 1군에 99.5%의 유사도를 나타내었다. 상호간 구분되는 당 발효 특징으로 K2, K8 균주는 L-arabinose를 분해하지 못하는 반면 K6는 짙은 녹색의 낮은 발효율 (w, weak)을 보인다. K2는 melizetose와 raffinose를 발효하지 못하고, K6는 둘 다 발효하며, K8은 melizetose만 발효하였다. Turanose 발효능은 K6와 K8에서 나타났다. 이와 같은 결과를 통해서 각 3종 균주의 차이점을 당발효 패턴에 대한 확인할 수 있다.
실시예 2-3. 내열성 확인
본 발명의 각 유산균들의 내열성을 조사하기 위해, waterbath에서 70℃로 중탕하면서 20초, 40초, 60초, 80초에 시료를 획득하고 생균수를 측정하여 열에 대한 내성을 측정하였고 이에 대한 결과를 표 2와 도 2에 나타내었다. 표 2와 도 2에서 각 생균수는 Log10 CFU/mL 수치로 표기되고, 괄호 안 숫자는 초기 (initial) 대비 생존율 (%)을 의미한다. 각 결과치는 3번의 독립적 실험의 평균 값이다.
Strains Initial 20 sec 40 sec 60 sec
Lb. plantarum ATG-K2 8.95±0.03(100.00±8.22%) 8.99±0.04(109.65±9.82%) 8.92±0.02(91.33±3.50%) 8.80±0.03(70.95±6.05%)
Lb. plantarum ATG-K6 9.44±0.04(100.00±9.86%) 9.43±0.04(97.27±8.70%) 9.38±0.05(87.46±9.76%) 9.28±0.03(68.88±5.23)
Lb. plantarum ATG-K8 9.55±0.03(100.00±4.23%) 9.49±0.05(89.67±8.71%) 9.41±0.05(75.26±6.99%) 9.41±0.05(74.32±7.74%)
그 결과, 표 2 및 도 2와 같이, 60초간 열처리했을 때 생존율이 74.32%인 K8이 내열성이 가장 뛰어난 것으로 나타났고, 그 다음으로 K6는 68.88%, K2는 70.95%의 순서로 확인된다. 이 때, 각 배양 실험마다 MRS broth에서 자랄 수 있는 최대 균 농도는 K2가 약 5 × 108 CFU/mL, K6이 약 3 × 109 CFU/mL, K8이 약 3 × 109 CFU/mL의 농도를 나타내었다.
실시예 2-4. 유산균의 용혈작용 확인
프로바이오틱스의 안전성과 관련하여 유산균의 용혈작용 여부를 알기 위해 K2, K6 및 K8의 균주를 5% sheep blood를 포함한 Tryptic soybean agar (TSA, Difco Laboratories, USA)에 접종하여 37℃에서 24~48시간 가량 배양하였다.
그 결과, 도 3A를 참고하면, 유산균 K2, K6 및 K8의 성장은 있으나 용혈 작용 및 그로 인한 clear zone은 발견되지 않는 것으로 확인된다.
실시예 2-5. 유산균의 생체아민 생성 여부 확인
또한, 인체에 유해할 수 있는 histamine, tyramine, putrecine, cadaverine을 지칭하는 생체아민 (biogenic amine)의 생성 여부를 Bover-Cid와 Holzapfel이 제시한 방법에 따라 시험하였다 (Bover-Cid and Holzafel, 1999). 간략하게 설명하자면 Bover-Cid and Holzapfel, 1999에서 제시한 시험용 고체배지의 성분에 따라 배지를 조성한 후, 각 유산균주를 접종하여 37℃에서 72시간 가량 배양하여 배지의 색상 변화를 관찰하였다. 생체아민이 양성인 경우에는 decarboxylase의 작용에 의해 균이 접종된 주변의 pH값이 올라가게 되어 배지에 포함된 bromocresol purple 시약이 노란색에서 보라색으로 변하게 된다.
그 결과, 도 3B를 참고하면, 생체아민 합성 여부를 판단하기 위한 고체배지에서도 K2, K6 및 K8의 성장은 있으나 색상 변화는 없으므로 histidine, tyramine, purtrecine, cadaverine 중 어느 하나의 생체아민도 생성하지 않는 것으로 파악된다.
실시예 2-6. 항생제 테스트
항생제 테스트는 ampicillin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, streptomycin, clindamycin, erythromycin, tetracycline, chloramphenicol의 9종의 항생제 E-test strip (BioMerieux, France)를 이용하여 최저저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)값을 확인하였다. 간략히 설명하자면, 시험하고자 하는 유산균을 약 OD600 흡광도 0.8로 각각 현탁하여 멸균된 면봉을 이용하여 MRS 고체배지에 도말하였다. 유산균이 도말된 고체배지는 약 3분간 건조 후 E-test strip을 올려 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 단, 유산균들의 특성상 aminoglycoside계열인 gentamicin, kanamycin, streptomycin에 대하여 자연적 고유내성 (intrinsic resistance)이 발생하는 경우가 있기에, 해당 항생제들에 대한 test medium은 plate count agar (PCA, Difco Laboratories, USA) 또는 Mueller-Hinton agar (MHA, Difco Laboratories, USA)를 사용하였다. 항생제의 종류와 안전하다고 판단될 수 있는 최저저해농도의 기준은 European food safety authority (EFSA)에서 발간한 가이드라인을 참조하였다 (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed, 2012). 이상의 각 실험결과는 하기 표 3에 기재하였다.
Strains AMP VAN GEN KAN STR CD ERY TET CM
Lb. plantarum ATG-K2 0.094 NR 12 12 NR 1 0.25 6 4
Lb. plantarum ATG-K6 0.094 NR 12 16 NR 0.75 0.125 3 2
Lb. plantarum ATG-K8 0.125 NR 16 16 NR 1 0.19 4 0.75
상기 표 3의 각 수치의 단위는 ㎍/㎖이며, 각 약자는 다음과 같다: AMP, ampicillin; VAN, vancomycin; GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; STR, Streptomycin; CD, clindamycin; ERY, erythromycin; TET, tetracycline; CM, Chloramphenicol; NR, not required.
상기 표 3을 참고하면, 본 발명의 모든 Lactobacillus plantarum 3종 균주들이 EFSA에서 제시한 가이드라인의 기준치에 부합하여 안전한 것으로 나타났다. 단, VAN에 대하여 94~128 ㎍/㎖, STR에 대하여 94~194 ㎍/㎖로 최저저해농도가 나타났으나, Lactobacillus plantarum 종에 대하여 EFSA 기준으로 VAN과 STR에 대한 감수성 수치가 요구되지 않기에 NR (not required)로 표기하였다.
실시예 2-7. 유산균의 항균 효과 확인
K2, K6 및 K8의 항균 기능성을 확인하기 위해, 그람양성 (gram-positive) 4종 SA, LM, SM, SS와 그람음성 (gram-negative) 3종 EC, PA, CS의 총 7종의 감염성 또는 기회감염성 세균에 대하여 유산균 K2, K6 및 K8의 항균활성을 disc test를 통해 억제환 (clear zone)을 확인하였다. 하룻밤 BHI 평판배지에서 배양한 7종의 세균을 1X phosphate buffered saline (PBS)에 약 0.8의 OD600으로 각각 현탁하였다. 각 현탁액은 멸균된 면봉으로 흡수하여 BHI와 MRS를 1:1로 혼합한 유산균 항균활성 시험용 agar medium에 전체 도말하고 약 3분간 건조하였다. 건조된 시험용 agar medium에 8 mm paper disc (Advantec, Japan)를 부착하고 MRS broth에서 18~20시간가량 배양한 K2, K6 및 K8 균액을 각각 35 μL씩 paper disc에 접종한 후 약 3분간 건조하였고, 37℃에서 배양하며 경과를 관찰하였다. 배양 후 생성된 억제환의 크기는 지름을 측정하여 paper disc의 지름인 8 mm 제하여 최종 값을 산출하였다.
7종의 감염성 또는 기회감염성 세균에 대한 K2, K6 및 K8의 항균활성을 측정한 결과 모든 유산균이 7종의 대상 세균에 대해서 4회 실험한 항균효과를 평균값으로 나타내어 표 4에 나타내었으며, 그 결과 모든 균주에 대한 항균 효과가 확인된다.
Strains SA LM SM SS EC PA CS
Lb. plantarum ATG-K2 5.00±0.18 5.50±0.18 4.75±0.28 4.13±0.11 3.38±0.21 3.75±0.13 6.50±0.18
Lb. plantarum ATG-K6 4.88±0.21 4.75±0.13 4.13±0.11 3.13±0.11 3.50±0.18 4.00±0.18 6.13±0.11
Lb. plantarum ATG-K8 4.25±0.13 5.18±0.21 3.88±0.11 4.00±0.18 3.50±0.18 3.88±0.11 5.88±0.11
상기 표 4의 각 수치인 억제환의 지름 단위는 mm이며, 각 약자는 다음과 같다: Staphylococcus aureus KCTC1621 (SA), Listeria monocytogenes KCTC3569 (LM), Streptococcus mutans KCTC3065 (SM), Streptococcus salivarius ATG-P1 (SS), Escherichia coli KCTC1682 (EC), Pseudomonas aeruginosa KCTC2004 (PA), Cronobacter sakazakii KCTC2949 (CS).
이와 같은 실험들을 통해 K2, K6 및 K8의 안정성을 용혈성의 부재, 알러지 또는 질병유발성 생체아민 생성의 부재, 항생제 감수성의 안전성을 통해 확인할 수 있고, 통상적인 지식의 선에서 Lactobacillus plantarum 속이 안전함을 감안할 때 (de Varies et al., 2006), 본 발명의 유산균들이 인체적용에 안전함을 알 수 있다.
실시예 2-8. bile salt hydrolase (BSH) activity 확인
각 유산균의 기능성으로써 bile salt hydrolase (BSH) activity 유무를 확인하기 위해 Dashkevicz and Feighner, 1989에서 서술한 방법으로 실험을 수행하였다. 간략히 설명하자면 MRS에 0.5% (w/v) sodium taurocholic acid (TDCA, Sigma-aldrich, Germany)를 첨가하여 agar medium을 만들었다. K2, K6 및 K8 유산균을 해당 agar medium에 접종하고 anaerobic jar에 넣고 37℃에서 72시간 가량 배양하여 결과를 확인하였다.
도 4A를 참고하면, K2, K6 및 K8 유산균 모두 BSH 활성이 있으며, BSH 활성이 있는 Lactobacillus plantarum의 특징적인 현상인 주변으로 침투된 침전물 없이 불투명한 하얀색이고, 단단한 질감의 colony를 형성하는 것이 나타남을 확인하였다.
실시예 2-9. hydrogen peroxide 생성능 확인
또한 각 유산균의 기능성 중 하나로써 hydrogen peroxide 생성능은 MRS에 0.25 mg/mL tetramethylbenzidine (Sigma-aldrich, Germany)과 0.01 mg/mL을 첨가하여 agar medium을 만들었다 (McGroarty et al., 1992). 단, 첨가물들은 MRS agar를 고압멸균 후 약 50℃가 되었을 때 첨가하였다. 완전히 굳은 시험용 agar medium에 각 유산균을 접종하고, anaerobic jar에 넣고 37℃에서 48-72시간 가량 배양하였다. 배양 후에 유산균들을 anaerobic jar에서 꺼내어 공기에 노출시켜 colony와 주변의 색 변화를 관찰하였다.
도 4B를 참고하면, Hydrogen peroxide 생성능은 각 유산균의 colony와 인접면이 짙은 파란색으로 변하였으며, 이는 K2, K6 및 K8 유산균이 hydrogen peroxide를 생성함을 의미한다.
실시예 2-10. 항산화능 확인
다음으로는 각 유산균주들의 항산화능 기능성을 평가하기 위해 2, 2’-Azino-Bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma-aldrich, Germany)를 이용한 radical scavenge 실험을 진행하였다. 간략히 설명하자면, 유산균은 24시간 가량 배양한 균체를 얻어 lysozyme (Sigma-aldrich, Germany)으로 37℃에서 2시간 반응하고, sonication을 통해 분쇄하여 유산균 파쇄물을 획득하였다. 수분함량 분석기를 이용하여 고형분 함량을 측정하고 stock solution을 50 mg/mL의 농도로 맞추었다. ABTS를 준비하기 위해 14mM의 ABTS stock 용액과 4.9mM의 potassium persulfate를 1:1 부피비로 혼합하고, 하룻밤 동안 암반응을 진행하여 청록색이 되도록 하였다. 해당 용액을 OD734장에서 흡광도가 약 0.7이 되도록 희석한 working solution에 각 유산균 파쇄액 시료를 10% 첨가하여 10분간 암실에서 반응 후 A734 nm 파장의 흡광도를 측정하고, 각 측정 수치는 다음의 수식으로 계산하였다.
ABTS radical scavenging activity (%) = {1-(ODsample/ODcontrol)} × 100
이와 같은 방법으로 ABTS를 수행한 결과는 도 4C에 나타내었는데, K2, K6 및 K8 균주 모두 radical scavenging activity를 나타내었다. 한편, 이 균주 중에서, K6이 가장 뛰어난 효과를 10 mg부터 나타내었고, 그 다음으로 K8, K2의 순서로 항산화능 효과를 보이는 것으로 확인된다.
이들 실험결과를 통해서도, BSH는 secondary bile salt 대사에 관여하기에, 본 발명의 균주들이 BSH의 활성이 있는 유산균을 섭취하는 형태의 제품으로 개발될 때 유산균의 담즙 내성이 있고, 숙주의 콜레스테롤 대사의 중간 과정에 관여함으로써 숙주의 콜레스테롤 저하 기능성이 있음을 확인할 수 있다 (Begley et al., 2006).
더불어, 본 발명의 유산균들의 과산화수소 생성능은 항균활성에 도움을 주어 질염 원인균 및 기회감염성 세균들의 증식을 억제할 수 있음을 제시한다. 또한, 이들의 파쇄물에서 나타난 항산화 효과를 통해 환부에서 발생하는 필요 이상의 radical들을 소거하고 환부의 회복에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3. 유산균의 항질염균 효과 확인
실시예 3-1. 유산균 배양액의 성장 정도 확인
질염원인균들에 대한 유산균 배양액의 성장저해 (growth inhibition)를 측정하기 위해 10배 농축된 무세포배양상등액 (CFCS, cell free culture supernatant)를 제작하였다. K2, K6 및 K8유산균의 배양액을 4,000 rpm에서 25분간 원심분리 하여 유산균의 세포와 배양상등액을 분리하였고, 배양상등액은 0.2 μm pore syringe filter (Satorious, Germany)를 이용하여 여과하였다. 여과된 배양상등액은 동결건조하여 1X PBS에 현탁하여 최초 배양액 부피 대비 10배의 농축액으로 제작하였다. CA는 1 × 105 CFU/mL의 농도로 접종하고 GV는 1 × 106 CFU/mL의 농도로 각각의 배양조건에 맞추어 접종하였다. 유산균의 CFCS는 1X가 되도록 질염원인균 접종액에 최종 부피의 0.1배가 되도록 넣었고, CFCS를 첨가하지 않은 시험군은 대조군 (control)로 사용하였다. 혼합이 완료된 조성물은 각 질염원인균의 배양조건에 따라 CA는 24시간, GV는 48시간 배양하고 OD600의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 토대로 생장저해율을 다음의 세포독성 계산 공식으로 계산하였다. 해당 공식에서 ODcontrol은 대조군의 흡광도를, ODcfcs는 CFCS 첨가군을 의미한다.
Growth inhibition (%) = (ODcontrol - ODcfcs)/ODcontrol × 100
이와 같이, 각 유산균의 CFCS를 1X 농도로 각 질염 원인균을 접종한 배양액에 처리한 결과, 도 5A와 도 5B를 참고할 때, CA에 대하여 24시간 배양 후 K2는 87.05%, K6는 82.11%, K8은 81.34%의 성장저해율을 나타내었고, GV에 대하여 48시간 배양 후 K2는 37.49%, K6는 28.25%, K8은 44.60%의 성장저해율을 나타냈다.
** Candida albicans KCTC7678 (CA), Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV).
실시예 3-2. 공응집능 확인
항균활동에 있어서 또 다른 지표로 유산균의 질염원인균에 대한 공응집능 (coaggregation)을 Handley et al, 1987에서 제시된 방법이 따라 측정하였다.
이를 간략하게 설명하자면, 각 유산균들과 질염 원인균들을 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상등액을 버린 후 침전된 균체를 1X PBS를 이용하여 세척하였다. 세척을 2번 반복한 후, 각 균들이 OD600파장에서 1.0의 흡광도가 되도록 1X PBS를 이용하여 현탁하였다. 유산균의 현탁액과 질염원인균들을 동일 부피 비율로 혼합하고 vortexing을 통해 균질화하고 그대로 두어 1, 4, 8시간째에 혼합액의 상등 부분을 조심스럽게 얻어내어 흡광도를 측정하였다. 각 균들을 혼합하지 않은 현탁액은 대조군으로 사용하였다. 측정된 흡광도를 토대로 다음의 공식으로 공응집률을 계산하였다. 여기서 ODpatho는 질염원인균, ODLAB는 유산균, ODmix는 각 균들의 혼합액의 흡광도를 의미한다.
Coaggregation (%) = {(ODpatho + ODLAB)/2 - ODmix}/(ODpatho + ODLAB)/2
이와 같이 각 유산균과 각 질염 원인균의 공응집률을 확인한 결과 도 5C 및 도 5D와 같이 최종 8시간째에서 CA에 대하여 K2는 70.73%, K6는 58.57%, K8은 57.88%의 공응집률을 나타내었고, GV에 대하여 K2는 32.72%, K6는 30.39%, K8은 20.45%의 공응집률을 나타냈다.
** Candida albicans KCTC7678 (CA), Gardnerella vaginalis KCTC5096 (GV).
이들 실험결과를 통해서는, 감염성 질염의 주원인인 CA와 GV에 대한 성장저해, 공응집, 살균의 효과가 나타나고, 더 나아가 7종의 기회감염성 세균들에 대한 정성적인 항균활성이 있음을 통해, 본 발명의 균주가 질내 세균총의 균형, 감염 예방의 효능이 매우 우수함을 알 수 있다. 특히, K6 및 K8 배양액의 CA와 GV 성장저해는 유산균의 세포 밖으로 배출되는 물질에 항균효과가 있고, 이러한 공응집 능력을 통해 본 발명의 균주가 해당 질병균들에 밀착하여 살균 능력과 성장저해효과를 극대화 할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3-3. 공배양에 따른 살균력 확인
본 발명의 유산균들의 항질염 효과로 공배양(coculture)을 통한 질염 원인균에 대한 살균력을 시험하였다. 항CA 실험에서는 CA는 약 2.5 × 106 CFU/mL, 각 유산균은 약 2.5 × 106 CFU/mL의 1:1 비율 농도를 맞추고 YM과 MRS를 1:1로 배합한 배양액에서 공배양을 실시하였다. 항GV 실험에서는 GV는 약 1.0 × 108 CFU/mL, 각 유산균은 약 1.0 × 108 CFU/mL의 1:1 비율 농도를 맞추어 10% horse serum BHI broth에 접종하였다 각 공배양 실험은 48시간 동안 진행하였으며, 초기 그리고 매 24시간마다 시료를 일부 획득하여 연쇄희석법과 평판배지 도말 배양법을 통해 생균수를 측정하였다. 항CA 실험에서는 CA만 측정하기 위해 100 ㎍/㎖ 농도의 ampicillin을 추가한 YM평판배지를 사용하였고, 항GV 실험에서는 GV와 유산균의 colony를 구별하기 위해 5% rabbit blood BHI 평판배지를 사용하여 colony 형태를 통해 구분하여 CFU를 측정하였다.
그 결과 도 6A와 도 6B에 개시된 바와 같이, 48시간 동안의 각 유산균과 질염균의 공배양 실험에서 K2, K6 및 K8을 CA와 공배양 한 실험군에서는 48시간째에 CA가 모두 소멸하였으며, 24시간 기준 살균력은 K2는 99.03%, K6은 99.49%, K8은 99.53%의 살균력을 나타내었다.
GV에 대한 실험에서는, 도 6C와 도 6D를 참고할 때, 24시간째에 K2는 87.37%, K6은 92.50%, K8은 93.71%의 살균력을 나타내는 것이 확인된다. 다만, 초기 24시간째에 GV가 평균적으로 90% 가량 사멸한 뒤, 약간의 성장을 한 것으로 나타낸 것으로 나타났으며, 이는 GV의 특성 중 스스로를 보호하기 위해 생성한 biofilm에 의한 것으로 추정된다. CA와 GV에 대한 공배양 실험에서 24시간째, 48시간째에 나타난 살균 수치는 각 질염 원인균의 초기값 (0H)에 비하여 통계적으로 유의미함을 확인하였다.
실시예 4. 유산균의 질건강 개선 효과
실시예 4-1. 유산균의 선천면역 증강 효과
K2, K6 및 K8 유산균의 면역학적 효과를 측정하기 위해 세포를 이용한 cytokine 정량 실험을 수행하였다. 세포는 쥐의 대식세포주인 RAW264.7을 사용하였고, 각 세포실험에 사용한 배지조건은 10% fetal bovine serum (Gibco, USA), 1% penicillin/streptomycin cocktail (Sigma-aldrich, Germany)를 첨가한 Gibco® dulbecco modified eagle medium (DMEM, Gibco, USA)를 사용하였다. 물질 처리에 앞서 약 80-90% 가량의 confluency로 배양된 RAW264.7 세포를 회수하여 24 well plate의 각 well 당 1 × 106 cell이 되도록 seeding하였다. Seeding 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하여 24 well plate에 부착 및 안정화 되도록 하였다. 각 유산균의 파쇄물을 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 농도로 well마다 처리하고, 양성대조군으로는 Lipopolysaccharide (LPS, Sigma-aldrich, Germany)를 1 ㎍/㎖, 음성대조군으로는 아무 물질도 처리되지 않은 실험군을 사용하였다. 물질 처리 후 24시간을 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하고, 세포배양액을 회수하여 IL-6와 TNF-α에 대한 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. IL-6는 Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D systems, USA), TNF-α는 Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit (R&D systems, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이, RAW264.7 세포에서 각 유산균의 파쇄물을 처리하였을 때, IL-6와 TNF-α의 농도가 control에 비해 증가하였다. K8은 500 ㎍/㎖ 농도의 파쇄물을 처리했을 때 100 ㎍/㎖ 농도 처리군에 비해 IL-6의 생성량이 유의미하게 줄어들었고, K2 파쇄물의 경우 처리 농도의 증가에 따라 TNF-α 생성량도 유의미하게 증가한 것으로 나타났다. 전체적으로는 모든 유산균 파쇄물 처리군에서 IL-6와 TNF-α의 증가가 나타났으며, 증가치는 LPS 처리군에 비해 낮은 수치를 나타냈다.
실시예 4-2. 유산균의 염증 억제 효과
염증억제 효과 실험은 실시예 4-1의 선천면역 증가 확인 실험방법과 동일한 방법으로 실험하였으나, LPS를 유산균 파쇄물과 함께 처리하는 실험군을 추가하였다. 이는 LPS로 유도된 염증을 억제할 수 있는 능력을 측정하는 실험이다. 이를 위해 각 실험군에 물질 처리 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하고, 세포배양액을 회수하여 IL-10 에 대한 ELISA를 mouse IL-10 Quantikine ELISA Kit (R&D systems, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과 도 8과 같이, RAW264.7 세포에 1 ㎍/㎖ 농도의 LPS와 각 유산균의 100 ㎍/㎖ 농도의 파쇄물을 동시에 처리하였을 때 IL-10의 농도가 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.
K2, K6 파쇄물을 함께 처리한 경우, 유사한 IL-10의 증가 수치를 나타냈고 (약 1100-1150 pg/mL), K8 파쇄물 처리군은 K2, K6 파쇄물 처리군에 비해 상대적으로 적은 IL-10의 증가량 (약 400 pg/mL)을 보였다. 그러나 LPS 단독 처리군에 비해서는 각 유산균과 LPS를 동시에 처리한 모든 실험군이 통계적으로 유의미한 증가를 보였다.
이 실험결과들은 면역학적인 시각에서 볼 때, K2, K6 및 K8의 세 종의 유산균의 파쇄물 모두 대식세포주인 RAW264.7에서 IL-6, TNF-α를 유도하였으며, 이는 선천면역의 증가 혹은 면역증강효과라고 할 수 있다. IL-6는 대식세포의 활성화, 호중구 유도 및 결집, 침입한 병원균에 대한 염증반응 활성 등의 proinflammatory 작용과 항염증 작용 등의 면역조절에 있어서 매우 중요한 cytokine이다 (Scheller et al., 2001; Fielding et al., 2008). 또한 대표적인 염증 유발 물질인 LPS에 유도된 IL-6와 TNF-α에 비해 낮은 증가량으로 미뤄 볼 때, 병적인 염증반응이 아닌 면역증강효과로 보는 것이 타당할 것으로 보인다. 그와 더불어 항종양효과, 발열작용, 바이러스 증식 억제, 대식세포 활성화 등의 효과가 있는 cytokine인 TNF-α의 증가도 본 발명의 유산균들이 선천면역증가효과가 있음을 나타낸다 (Vujanovic, 2011). 일반적으로 LPS를 처리하면 염증이 유발되고, 염증 반응을 조절 및 억제하기 위해 IL-10이 생성되는데, LPS로 유도된 IL-10보다 2-5배의 IL-10 증가량을 보았을 때, 각 유산균들이 과도한 염증반응을 억제하는 효과가 있음을 파악할 수 있다.
따라서, K2, K6 및 K8 유산균은 안전하고, 질염원인균들에 대한 항균력이 있으며, 항산화 효과가 있고, 선천면역 증가효과 및 염증억제 효과를 통해 궁극적으로 사용자의 비뇨생식기계 건강을 증진시킬 수 있는 균주임이 확인된다.
실시예 5. 유산균의 전장 유전체 분석
다음으로는 K2, K6 및 K8 유산균의 전장 유전체 분석을 위해 genomic DNA를 추출하여 Pacific Bioscience 사의 Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing 기법을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 생산된 염기서열 데이터는 SMRT analysis software v2.3.0의 Hierarchical Genome Assembly Process (HAGP) 2 protocol을 이용하여 assemble 하였으며, annotation을 위해 Rapid Annotation using Subsystem Technology (RAST) server (http://rast.nmpdr.org/)를 활용하였다. 또한, 3종의 유산균의 독립성 확인을 위해 Average Nucleotide Identity (ANI) analysis를 진행하였으며, PathoFinder 1.1 https://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder/)을 이용하여 유전정보로부터 안전성 여부를 한번 더 검증하였다.
K2, K6 및 K8 유산균의 전장 유전체를 분석한 결과 하기 표 5 및 표 6과 같이, 각기 다른 chromosome DNA size를 가졌으며, plasmid의 개수와 size 또한 다른 것으로 나타났다.
세 유산균의 독립성을 확인하기 위해 진행된 ANI analysis 에서는 K2와 K6의 경우 96.25%, K2와 K8의 경우 96.09%, K6와 K8의 경우 99.92%의 identity를 나타내 Lactobacillus plantarum으로 같은 종에 속하나 0.08 ~ 3.91%의 차이를 보였다.
Strains Lb. plantarum ATG-K2 Lb. plantarum ATG-K6 Lb. plantarum ATG-K8
Chromosome (bp) 3,034,884 3,205,672 3,221,272
Plasmid 1 (bp) 61,159 56,833 54,492
Plasmid 2 (bp) 40,101 - -
Plasmid 3 (bp) 38,954 - -
Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 전장 유전체 분석 결과
Attribute ATG-K2 ATG-K6 ATG-K8
Total genome size (bp) 3,175,098 3,262,505 3,275,764
Chromosome size 3,034,884 3,205,672 3,221,272
Plasmid number 3 1 1
DNA G+C(%) 45.19 44.54 44.54
Total genes 3,114 3,178 3,186
Protein coding genes 2,857 2,999 2,999
rRNA genes 16 16 16
tRNA genes 65 67 67
ncRNA genes 4 4 4
Pseudo genes 172 92 100
GenBank accession GCA_003597635.1 GCA_003597595.1 GCA_003597615.1
이 후, 상기 유전체 정보를 활용하여 RAST server를 통해 annotation을 진행한 결과, 표 7과 같이 각 균주의 유전자의 구성 또한 상이한 것을 확인하였다. K2 유산균의 경우 cell wall과 capsule에 관련된 유전자 49개를 가지는 반면 K6와 K8 유산균의 경우는 71개의 유전자를 가졌으며, carbohydrate와 관련된 유전자의 경우 K2 유산균은 215개, K6 유산균은 235개, K8 유산균은 245개를 가지는 것으로 나타났다. 이들의 상이성은 세 유산균이 같은 종에 속함에도 각기 다른 정도의 생장율이나 기능성을 나타내는 것을 뒷받침하는 결과이다.
Lactobacillus plantarum K2, K6 및 K8 각각의 균주의 유전자의 구성
대상 유전자 ATG-K2 G-K6 G-K8
Cofactors, Vitamins, Prosthetic groups, Pigments 103 117 102
Cell wall and capsule 49 71 71
Virulence, Disease and defense 42 39 39
Potassium metabolism 6 5 5
Photosynthesis 0 0 0
Miscellaneous 18 18 18
Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids 10 11 11
Membrane transport 55 48 48
Iron acquisition and metabolism 5 5 5
RNA metabolism 41 39 39
Nucleosides and nucleotides 88 88 89
Protein metabolism 146 148 148
Cell division and Cell cycle 4 4 4
Motility and chemotaxis 0 0 0
Regulation and cell signaling 34 27 29
Secondary metabolism 4 4 4
DNA metabolism 58 55 55
Fatty acids, lipids, and isoprenoids 36 35 37
Nitrogen metabolism 0 0 0
Dormancy and sporulation 6 6 6
Respiration 17 15 16
Stress response 19 21 21
Metabolism of aromatic compounds 5 8 8
Amino acids and derivatives 196 189 190
Sulfur metabolism 3 3 3
Phosphorus metabolism 35 33 33
Carbohydrates 215 235 246
Total identified genes percent in RAST server subsystem database 29% 28% 28%
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 또는 K8 유산균 중 1종 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 또는 K8 유산균 중 1종을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 또는 K8 유산균 중 1종을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 또는 K8 유산균 중 1종 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 Lactobacillus plantarum K2, K6 또는 K8 유산균 중 1종 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.
[수탁기관]
기탁기관명 : 한국생물자원센터
수탁번호 : KCTC13577BP
수탁일자 : 20180710
기탁기관명 : 한국생물자원센터
수탁번호 : KCTC13570BP
수탁일자 : 20180703
기탁기관명 : 한국생물자원센터
수탁번호 : KCTC13571BP
수탁일자 : 20180703
[규칙 제91조에 의한 정정 28.06.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-207
[규칙 제91조에 의한 정정 28.06.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-208
[규칙 제91조에 의한 정정 28.06.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-209

Claims (10)

  1. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 중 1종 이상 선택되는 질염의 원인균에 대한 항균 효능이 있는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K2(Lactobacillus plantarum ATG-K2, 기탁번호 KCTC 13577BP) 균주.
  2. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 중 1종 이상 선택되는 질염의 원인균에 대한 항균 효능이 있는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K6(Lactobacillus plantarum ATG-K6, 기탁번호 KCTC 13570BP)균주.
  3. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 가드네렐라 버지날리스(Gardnerella vaginalis) 중 1종 이상 선택되는 질염의 원인균에 대한 항균 효능이 있는 락토바실러스 플란타룸 ATG-K8(Lactobacillus plantarum ATG-K8, 기탁번호 KCTC 13571BP) 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 스태피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 세균에 대한 항균 효능이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 용혈작용이 없고, 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 푸트렉신(putrecine) 및 카다베르린(cadaverine)으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 생체아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 것을 특징으로 하는 균주.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 담즙염 분해효소(bile salt hydrolase)의 활성 기능, 과산화수소(hydrogen peroxide) 생성능 또는 항산화능이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 암피실린(ampicillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클린다마이신(clindamycin), 에리트로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로라암페니콜(chloramphenicol)으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 항생제에 대한 내성이 없는 것을 특징으로 하는 균주.
  8. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 IL-6(interleukin-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 중 1종 이상 선택되는 사이토카인을 증가시키는 선천면역 활성 기능이 있거나, IL-10(interleukin-10)을 증가시키는 항염 활성이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
PCT/KR2019/006936 2018-10-12 2019-06-10 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물 WO2020075949A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980036590.4A CN112313325B (zh) 2018-10-12 2019-06-10 新的植物乳杆菌菌株以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物
US17/051,007 US11447741B2 (en) 2018-10-12 2019-06-10 Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8, and composition for preventing or treating vaginitis comprising same
US17/527,002 US20220064589A1 (en) 2018-10-12 2021-11-15 Novel lactobacillus plantarum strain atg-k2, atg-k6 or atg-k8, and composition for preventing or treating vaginitis comprising same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0121634 2018-10-12
KR1020180121634A KR101930438B1 (ko) 2018-10-12 2018-10-12 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/051,007 A-371-Of-International US11447741B2 (en) 2018-10-12 2019-06-10 Lactobacillus plantarum strain ATG-K2, ATG-K6 or ATG-K8, and composition for preventing or treating vaginitis comprising same
US17/527,002 Division US20220064589A1 (en) 2018-10-12 2021-11-15 Novel lactobacillus plantarum strain atg-k2, atg-k6 or atg-k8, and composition for preventing or treating vaginitis comprising same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020075949A1 true WO2020075949A1 (ko) 2020-04-16

Family

ID=64952466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/006936 WO2020075949A1 (ko) 2018-10-12 2019-06-10 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11447741B2 (ko)
KR (1) KR101930438B1 (ko)
CN (1) CN112313325B (ko)
WO (1) WO2020075949A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101930438B1 (ko) * 2018-10-12 2018-12-18 (주) 에이투젠 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물
CN109908185B (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 江南大学 一种抑制变异链球菌和白色念珠菌双菌生物膜的方法
KR102139687B1 (ko) 2019-05-03 2020-07-30 주식회사 메디오젠 가드네렐라 바기날리스 및 칸디다 알비칸스에 항균 효과를 갖는 질염 치료 또는 개선용 유산균 mg4288
KR102063757B1 (ko) 2019-05-03 2020-01-08 주식회사 메디오젠 가드네렐라 바기날리스 및 칸디다 알비칸스에 항균 효과를 갖는 질염 치료 또는 개선용 유산균
CN110499271B (zh) * 2019-09-02 2021-11-23 千禾味业食品股份有限公司 一种植物乳杆菌qr19及其应用
KR102163551B1 (ko) 2020-04-21 2020-10-07 (주) 에이투젠 락토바실러스 플란타룸 atg-k2 또는 atg-k6를 함유하는 지질관련 대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR102549522B1 (ko) * 2021-09-16 2023-07-03 일동바이오사이언스(주) 락토바실러스 플란타럼 idcc 3501을 포함하는 질염에 유용한 조성물
WO2023227648A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Universiteit Antwerpen Bacterial biocontrol agent
CN115137758B (zh) * 2022-06-08 2024-01-19 诺佰克（武汉）生物科技有限公司 一种有利于女性生殖道健康的益生菌的制备及其应用
WO2024032452A1 (zh) * 2022-08-09 2024-02-15 成都倍特生物制药有限公司 一株植物乳杆菌及其应用
CN115851491A (zh) * 2022-08-31 2023-03-28 西北农林科技大学 植物乳植杆菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180094926A (ko) * 2015-12-22 2018-08-24 로엘미 에이치피씨 에스.알.엘. 프로바이오틱 조성물 및 이의 용도
KR101930438B1 (ko) * 2018-10-12 2018-12-18 (주) 에이투젠 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1485463T3 (da) * 2002-03-21 2008-11-10 Bifodan As Lactobacillus stamme
CN1888051B (zh) * 2005-06-28 2010-05-05 北京天佑达生物工程科技有限公司 一株植物乳杆菌及其应用
KR101098241B1 (ko) 2009-11-09 2011-12-23 주식회사한국야쿠르트 요로감염과 칸디다성 질염을 억제하는 활성을 갖는 락토바실러스 에스피. 에이취와이 7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
ES2764210T3 (es) * 2014-11-25 2020-06-02 Dsm Ip Assets Bv Lactobacillus para usar como probiótico
EP3064072A1 (en) * 2015-02-11 2016-09-07 AB-Biotics S.A. Probiotic lactobacillus strains for use in treating urinary tract infections
WO2016167489A1 (ko) * 2015-04-16 2016-10-20 주식회사 고바이오랩 질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주
KR101750468B1 (ko) 2016-03-04 2017-06-27 주식회사 메디오젠 락토바실러스 퍼멘툼 mg901 또는 락토바실러스 플란타룸 mg989를 포함하는 조성물
BE1023643B1 (nl) * 2016-03-21 2017-06-01 Yun NV Vaginale preparaten voor het onderhouden en / of herstellen van een gezonde vrouwelijke microbiota
KR101784847B1 (ko) 2016-05-10 2017-10-13 주식회사 하우동천 질염 예방 및 치료용 유산균 함유 조성물 및 이의 용도
KR101720145B1 (ko) * 2016-07-08 2017-04-07 (주)정가진면역연구소 여성 질염 예방 및 개선 기능성 조성물
KR101860513B1 (ko) * 2017-03-30 2018-05-24 주식회사 메디오젠 질에서 분리한 락토바실러스 살리바리우스 mg242를 포함하는 칸디다성 질염의 예방 또는 치료용 조성물
CN107299065B (zh) * 2017-06-20 2020-02-14 广东强基药业有限公司 一种植物乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180094926A (ko) * 2015-12-22 2018-08-24 로엘미 에이치피씨 에스.알.엘. 프로바이오틱 조성물 및 이의 용도
KR101930438B1 (ko) * 2018-10-12 2018-12-18 (주) 에이투젠 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECK, BO RAM ET AL.: "Whole Genome Analysis of Lactobacillus plantarum strains Isolated from Kimchi and Determination of Probiotic Properties to Treat Mucosal Infections by Candida albicans and Gardnerella vaginalis", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 10, 6 March 2019 (2019-03-06), pages 1 - 13, XP055703910 *
DATABASE Nucleotide 26 September 2018 (2018-09-26), "Lactobacillus plantarum strain ATG-K2 chromosome, complete genome", Database accession no. CP032460.1 *
DATABASE Nucleotide 26 September 2018 (2018-09-26), "Lactobacillus plantarum strain ATG-K6 chromosome, complete genome", Database accession no. CP032464.1 *
DATABASE Nucleotide 26 September 2018 (2018-09-26), "Lactobacillus plantarum strain ATG-K8 chromosome, complete genome", Database accession no. CP032466.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112313325B (zh) 2024-03-08
US20220064589A1 (en) 2022-03-03
US20210324326A1 (en) 2021-10-21
US11447741B2 (en) 2022-09-20
KR101930438B1 (ko) 2018-12-18
CN112313325A (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020075949A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2011010770A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
WO2019151843A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도
WO2011007922A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
WO2010064777A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
WO2011052996A2 (en) Novel lactobacillus plantarum and composition comprising the same
WO2021182829A1 (ko) 장관 면역조절 기능과 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주
WO2019088379A1 (ko) 신규 유산균 및 이의 용도
KR101937758B1 (ko) 락토바실러스 퍼멘텀 ubc-u32, 및 이의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 용도
WO2017047962A1 (ko) 신규 유산균 및 퇴행성 뇌질환 또는 인지기능 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2013151362A1 (ko) 신규 바실러스 서브틸리스
WO2016064000A1 (ko) 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 가진 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 및 이의 생산물
WO2020091312A1 (ko) 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물
WO2020116733A1 (ko) 도파민 분비 증진 기능이 있는 신규한 락토바실러스 루테리 atg-f4 균주, 이를 함유하는 정신질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023055188A1 (ko) 신규 프로바이오틱스 및 이의 용도
WO2020013669A1 (ko) 항바이러스 효과 및 면역조절 효능을 가지는 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 이를 포함하는 조성물
WO2015156509A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
WO2021221398A1 (ko) 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스
KR20120064416A (ko) 항바이러스 및 항균 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 ｃｌｐ-1 균주 및 이를 포함하는 생균제
WO2010064778A1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
WO2012105804A2 (en) Probiotics for biological control against saprolegnia sp.
WO2022039561A1 (ko) 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물
WO2012169842A2 (ko) 차나무 잎에서 분리한 신규 락토바실러스 플란타룸
WO2017026635A1 (ko) 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 포함하는 동물 사료용 조성물
WO2022231178A1 (ko) 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 atg-v5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19871145

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19871145

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1