CN112313325B - 新的植物乳杆菌菌株以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物 - Google Patents

新的植物乳杆菌菌株以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株ATG‑K2、ATG‑K6或ATG‑K8以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物，其中所述植物乳杆菌菌株ATG‑K2、ATG‑K6或ATG‑K8对多种致病性菌株以及白色念珠菌(Candida albicans)和阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)(其是阴道炎的致病菌)具有优异的抗菌作用，并且因此可容易地用作用于治疗细菌性阴道炎、念珠菌阴道炎等的组合物。

Description

新的植物乳杆菌菌株以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴 道炎的组合物
相关申请的交叉引用
本申请是2019年6月10日提交的国际申请No.PCT/KR2019/006936的国家阶段，其要求基于2018年10月12日提交的韩国专利申请No.10-2018-0121634的优先权，其整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物。
背景技术
阴道炎是在女性泌尿生殖系统中发生的炎性疾病，并且阴道炎可广泛地分类为感染性和非感染性形式，并且在准确的医学分析之前不容易自我诊断发病原因。阴道炎的典型症状包括气味、过渡分泌、pH提高、炎性肿胀、红斑、皮肤破裂等(Morris et al.,2001；Egan和Lipsky,2002)。这些之中，感染性阴道炎的分类预计为40％至50％的细菌性阴道病，25％至25％的阴道念珠菌病，以及15％至20％的滴虫阴道炎(Sobel,1997；Egan和Lipsky,2002)。通常，根据感染的原因，用抗生素、抗真菌剂或组合的经口施用或直接施用尝试对患处进行处理。在感染性阴道炎中，阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)是引起细菌性阴道病的主要微生物，并且白色念珠菌(Candida albicans)是引起阴道念珠菌病的主要微生物。这些感染性疾病的关键发病机制是：由于多种原因，例如过量的抗生素、应激、由内在因素引起的原发性阴道炎等，阴道中能够产生过氧化氢的乳杆菌的量减少，并且最终，通过过氧化氢进行的直接消毒和由乳杆菌的乳酸产生明显减少，从而提高了pH，创造了多种细菌容易生长的环境(Sobel,1997)。因此，添加了能够再次降低pH的乳酸菌，并且特别地，补充具有产生过氧化氢能力的乳酸菌被认为是改善女性生殖器健康的重要方法。
因此，本公开内容的发明人已经进行了关于使用乳酸菌减少阴道炎的方法的多种研究，并且已经确定新的植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8对多种阴道炎病原体具有抗微生物作用，并且具有优异的增强免疫的效力，因此以本公开内容告终。
[引文列表]
[专利文献]
(专利文献1)韩国专利No.10-1750468(标题：包含发酵乳杆菌MG901(Lactobacillus fermentum MG901)或植物乳杆菌MG989的组合物(Compositioncomprising Lactobacillus fermentum MG901 or Lactobacillus plantarum MG989)，申请人：Mediogen Co.Ltd.等，登记日期：2017年6月19日)
(专利文献2)韩国专利No.10-1098241(标题：对尿路感染和念珠菌病具有抑制作用的乳杆菌属HY7801以及包含其作为有效成分的产品(Lactobacillus sp.HY7801 havinginhibitory effect against urinary tract infection and candidiasis,andproducts containing the same as effective component)，申请人：Korea YakultCo.Ltd.，登记日期：2011年12月19日)
(专利文献3)韩国专利No.10-1860513(标题：包含从人阴道分离的唾液乳杆菌MG242(Lactobacillus salivarius MG242)的用于预防或治疗念珠菌性阴道炎的药物组合物(Pharmaceutical composition for preventing or treating candidal colpitiscomprising Lactobacillus salivarius MG242 isolated from human vagina)，申请人：Mediogen Co.Ltd.等，登记日期：2018年5月16日)
(专利文献4)韩国专利No.10-1784847(标题：用于预防和治疗阴道病的包含乳酸菌的组合物及其用途(A composition comprising lactic-acid bacteria forprotecting and treating vaginosis disease and the use thereof)，申请人：Haudongchun Co.Ltd.，登记日期：2017年9月28日)
[非专利文献]
(非专利文献1)Aslim B.,Onal D.,Beyatli Y.2007.Factors influencingautoaggregation and aggregation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusisolated from handmade yogurt.J.Food Protec.70:223-227。
(非专利文献2)Begley M.,Hill C.,Gahan CGM.2006.Bile salt hydrolaseactivity in probiotics.Appl Environ Microbiol 72:1729-1738。
(非专利文献3)Bover-Cid S.,Holzapfel W.H.1999.Improved screeningprocedure for biogenic amine production by lactic-acid bacteria.Int.J.FoodMicrobiol.53:33-41。
(非专利文献4)Dashkevicz M.P.,Feighner S.D.1989.Development of adifferential medium for bile salt hydrolase-active Lactobacillusspp.Appl.Envrion.Microbiol.55:11-16。
(非专利文献5)de Vries M.C.,Vaughan E.E.,Kleerebezem M.,de VosW.M.2006.Lactobacillus plantarum-survival,functional and potential probioticproperties in the human intestinal tract.Int.Dairy J.16:1018-1028。
(非专利文件6)EFSA Panel on Additives and Products or Substances usedin Animal Feed(FEEDAP).2012.Guidance on the assessment of bacterialsusceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance.EFSAJournal 10(6):2740。
(非专利文献7)Egan M.,Lipsky M.S.2002.Vaginitis:case reports and briefreview.AIDS Patient Care STDS16:367-373。
(非专利文献8)Fielding C.A.,MacLoughlin R.M.,McLeod L.,Colmont C.S.,Najdovska M.,Grail D.,et al.2008.IL-6regulates neutrophil trafficking duringacute inflammation via STAT3.J.Immunol.181:2189-2195。
(非专利文献9)Fiorentino D.F.,Zlotnik A.,Mosmann T.R.,Howard M.,O’Garra.1991.IL-10inhibits cytokine production by activatedmacrophages.J.Immunol.147:3815-3822。
(非专利文献10)Handley P.S.,Harty D.W.S.,Wyatt J.W.,Brown C.R.,DoranJ.P.,Gibbs A.C.1987.Acomparison of the adhesion,coaggregation and cell-surface hydrophobicity properties of fibrillary and fimbriate strains ofStreptococcus salivarius.J.Gen.Microbiol.133:3207-3217。
(非专利文献11)McGroarty J.A.,Tomeczek L.,Pond D.G.,Reid G.,BruceA.W.1992.Hydrogen peroxide production by Lactobacillus species:correlationwith susceptibility to the spermicidal compound nonoxynol-9.J.Infect.Diseases165:1142-1144。
(非专利文献12)Morris M.,Nicoll A.,Simms I.,Wilson J.,CatchpoleM.2001.Bacterial vaginosis:a public health review.Br.J.Obstet.Gynaecol.108:439-450。
(非专利文献13)Scheller J.,Chalaris A.,Schmidt-Arras D.,Rose-JohnS.2001.The pro-and anti-inflammatory properties of the cytokine interleukin-6.Biochim.Biophys.Acta 1813(5):878-888。
(非专利文献14)Sobel J.D.1997.Vaginitis.N.Engl.J.Med.337:1896-1903。
(非专利文献15)Vujanovic N.L.2011.Role of TNF superfamily ligands ininnate immunity.Immunol.Res.50:159-174。
公开内容
技术问题
本公开内容的一个目的是提供新的植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物。
技术方案
本公开内容涉及植物乳杆菌ATG-K2(登记号：KCTC 13577BP)、植物乳杆菌ATG-K6(登记号：KCTC 13570BP)或植物乳杆菌ATG-K8(登记号：KCTC 13571BP)，所有这些均对选自白色念珠菌和阴道加德纳菌的至少一种阴道炎病原体具有抗微生物活性。
植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8对选自以下的至少一种细菌具有抗微生物活性：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8不引起溶血并且不产生选自组胺、酪胺、腐胺和尸胺的至少一种生物胺。
植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8具有胆盐水解酶活性，并且还具有产生过氧化氢的能力或抗氧化活性。
植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8对选自以下的至少一种抗生素没有抗性：氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、四环素和氯霉素。
植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8具有提高选自IL-6(白介素-6)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的至少一种细胞因子的量的先天免疫活性，并且具有提高IL-10(白介素-10)的量的抗炎活性。
本公开内容涉及用于治疗或改善阴道炎的药物组合物，其包含植物乳杆菌ATG-K2、植物乳杆菌ATG-K6或植物乳杆菌ATG-K8。
本公开内容的菌株可在MRS液体或固体培养基(肉汤或琼脂)中培养，并且在MRS肉汤中，植物乳杆菌K2可培养至约5×108CFU/ml的浓度，植物乳杆菌K6可培养至约3×109CFU/ml的浓度，并且植物乳杆菌K8可培养至约3×109CFU/ml的浓度。
这些菌株优选在30至37℃下培养16至48小时，并且最佳培养温度为37℃，最低培养温度为15℃，最高培养温度为38℃，最佳培养pH为6.5，最小培养pH为4.0，并且最大培养pH为7.8。最佳培养时间为16小时，最小培养时间为10小时，并且最大培养时间为120小时。
另外，本公开内容提供了用于预防或治疗阴道炎的药物组合物，其包含新的植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8。新的植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8可以以0.001wt％至30wt％的量添加至本公开内容的药物组合物。
药物组合物可根据各典型方法被配制成经口剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂制剂，以及外用制剂、栓剂等。药物组合物中可包含的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸类、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂通常可使用稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来制备。用于经口施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这样的固体制剂可通过将本公开内容的菌株与至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。除简单的赋形剂之外，可使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。经口液体制剂可包括混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且还可不仅包含简单的稀释剂，例如水或液体石蜡，而且还可包含多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水性溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂和阴道栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用(Witepsol)、聚乙二醇/>吐温61、可可豆脂、月桂精酯、甘油明胶等。
当施用时，根据本公开内容的药物组合物的量可根据待治疗的对象的年龄、性别和体重，治疗的具体疾病或病理状况，疾病或病理状况的严重程度，施用途径以及开处方者的判断而有所不同。基于这些因素的剂量确定将由本领域技术人员容易地进行，并且剂量通常为0.01mg/kg/天至约2000mg/kg/天。优选地，剂量设定为1mg/kg/天至500mg/kg/天。施用可每天一次或每天数次地进行。剂量不以任何方式限制本公开内容的范围。
根据本公开内容的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物，例如小鼠、家畜、人等。由于本公开内容的菌株具有小的毒性和最小的副作用，因此其是即使为了预防目的而长时间服用时也可安全使用的药物。
有利效果
本公开内容涉及新的植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8以及包含所述菌株的用于预防或治疗阴道炎的组合物，并且植物乳杆菌菌株ATG-K2、ATG-K6或ATG-K8对多种致病性菌株以及白色念珠菌和阴道加德纳菌(其是阴道炎病原体)具有优异的抗微生物作用，并且因此可容易地用作用于治疗细菌性阴道病、阴道念珠菌病等的组合物。
附图说明
图1示出了本公开内容的植物乳杆菌K2(SEQ ID NO:1的1079-1378)、K6(SEQ IDNO:2的1081-1380)和K8(SEQ ID NO:3的1081-1380)菌株中的每一种的16S rRNA序列的比较结果。
图2示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种的耐热性的确认结果。
图3A和3B示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种的溶血的确认结果(图3)以及由此的生物胺产生的结果(图3B)。
图4A、4B和4C示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种的胆盐水解酶活性(图4A)、产生过氧化氢的能力(图4B)和抗氧化活性(图4C)的确认结果。
图5A、5B、5C和5D示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种抑制白色念珠菌KCTC7678(CA)生长的活性(图5A)、其抑制阴道加德纳菌KCTC5096(GV)生长的活性(图5B)、其在白色念珠菌KCTC7678(CA)上的共聚(图5C)、以及其在阴道加德纳菌KCTC5096(GV)上的共聚(图5D)的确认结果。
图6A、6B、6C和6D示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种与白色念珠菌KCTC7678(CA)共培养的结果(图6A和图6B)以及其与阴道加德纳菌KCTC5096(GV)共培养的结果(图6C和图6D)。
图7A和7B示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种增强先天免疫(提高IL-6和TNF-α水平)的作用；并且
图8示出了本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8菌株中的每一种抑制炎症(提高IL-10水平)的作用。
具体实施方式
通过以下实施例将获得对本公开内容的更好的理解。然而，本公开内容不限于这些实施例，并且可以以其他形式实施。提供这些实施例以彻底地解释本公开内容并将本公开内容的精神充分传达给本领域技术人员。
<实施例1.乳酸菌和感染性微生物的制备>
所使用的乳酸菌是植物乳杆菌ATG-K2(K2)、植物乳杆菌ATG-K6(K6)和植物乳杆菌ATG-K8(K8)，它们是于2016年1月从韩国忠清地区的泡菜样品中分离的新微生物。用于抗微生物试验的细菌是七种类型的感染性或机会性细菌，包括金黄色葡萄球菌KCTC1621(SA)、大肠杆菌KCTC1682(EC)、铜绿假单胞菌KCTC2004(PA)、单核细胞增生李斯特菌KCTC3569(LM)、阪崎肠杆菌KCTC2949(CS)、变异链球菌KCTC3065(SM)和唾液链球菌ATG-P1(SS)。至于阴道炎病原体，使用白色念珠菌KCTC7678(CA)作为真菌模型，并且使用阴道加德纳菌KCTC5096(GV)作为细菌模型。乳酸菌在MRS(Difco实验室，美国)琼脂或肉汤培养基中培养，并且除GV之外的细菌在BHI(脑心浸出液(Brain Heart Infusion))(Difco实验室，美国)琼脂或肉汤培养基中培养。将GV接种到含有20％经热处理的马血清(Gibco，美国)的BHI琼脂或肉汤培养基中，随后使用OxoidTM AnaeroGenTM系统(Oxoid，英国)进行厌氧培养。CA在YM(Difco实验室，美国)琼脂或肉汤培养基中培养。将所有微生物在37℃下进行静置培养，持续约20小时。
<实施例2.乳酸菌的生理特性的确认>
实施例2-1.乳酸菌的16S rRNA序列的鉴定
为了进行分子生物学鉴定，通过Solgent(Daejeon)进行了从泡菜分离的乳酸菌K2、K6和K8菌株的16S rRNA测序。使用27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；SEQ IDNO:4),518F(5’-CCA GCAGCC GCG GTA ATA C-3’；SEQ ID NO:5),907R(5’-CCG TCA ATTCMT TTR AGT TT-3’；SEQ ID NO:6)和1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’；SEQ IDNO:7)作为测序用引物，总共进行四次核苷酸序列读取，并使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST在线工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析通过每次读取的核苷酸序列比对获得的重叠群。使用EMBL-EBI的Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)，分析了K2、K6和K8菌株之间16S rRNA序列的差异。
基于16S rRNA测序的结果，确认了各个菌株具有下面SEQ ID NO:1至3的核苷酸序列，并且如图1中所示，三种类型菌株的核苷酸序列与植物乳杆菌相同，并且当比较K2、K6和K8菌株的核苷酸序列时，似乎核苷酸序列之间有一个核苷酸不同(图1)。
SEQ ID NO:1：乳杆菌_植物_ATG-K2_16S_rRNA_序列_部分的
SEQ ID NO:2：乳杆菌_植物_ATG-K2_16S_rRNA_序列_部分的
SEQ ID NO:3：乳杆菌_植物_ATG-K8_16S_rRNA_序列_部分的
实施例2-2.糖发酵模式特征的确认
进行API50 CH测试(BioMerieux，法国)，以通过糖发酵模式研究鉴定和特征。
简言之，将在10ml的API 50CHL培养基(BioMerieux，法国)中培养至纯的乳酸菌混悬，直到获得约0.5的吸光度OD600，之后将培养混悬液接种到API 50CH测试条(test strip)的每个杯形托(cupule)中，并在37℃下培养。在接种之后24、48和72小时确认糖发酵的结果，并且其结果示于下表1中。
[表1]
(+：阳性，w：弱阳性，-：阴性)
参照表1，在基于由BioMerieux提供的APIWEB数据库的糖发酵模式中，K2表现出与植物乳杆菌组1的52％的相似性，K6表现出与植物乳杆菌组1的99.4％的相似性，并且K8表现出与植物乳杆菌组1的99.5％的相似性。至于不同的糖发酵特性，K2和K8菌株不降解L-阿拉伯糖，而K6呈深绿色，由此表明低的发酵效率(w，弱)。K2不发酵松三糖或棉子糖，K6发酵松三糖和棉子糖二者，并且K8仅发酵松三糖。松二糖发酵能力在K6和K8中表现出来。基于这些结果，确认了三种类型菌株的糖发酵模式之间的差异。
实施例2-3.耐热性的确认
为了研究本公开内容的乳酸菌的耐热性，在70℃下于水浴中沐浴的同时，在20秒、40秒、60秒和80秒处获得样品，进行活细胞计数来由此确定耐热性，并且其结果示于下表2和图2中。在表2和图2中，活细胞计数表示为Log10 CFU/ml值，并且括号中的数字表示与初始计数相比的生存力(％)。每个结果值是三个独立实验的平均值。
[表2]
如根据表2和图2明显的，K8在热处理60秒之后具有74.32％的生存力，表现出最高的耐热性，并且次高的耐热性是具有68.88％生存力的K6的耐热性，接着具有70.95％生存力的K2。在此，对于每个培养实验，在MRS肉汤中能够生长的最大细菌浓度对于K2为约5×108CFU/ml，对于K6为约3×109CFU/ml，对于K8为约3×109CFU/ml。
实施例2-4.乳酸菌溶血的确认
为了评价与益生菌的安全性有关的乳酸菌溶血的存在或不存在，将K2、K6和K8菌株接种到含有5％羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(tryptic soybean agar，TSA)(Difco实验室，USA)中，并随后在37℃下培养约24至48小时。
作为结果，如图3A中所示，存在乳酸菌K2、K6和K8的生长，但是未观察到溶血和由此引起的透明区域。
实施例2-5.由乳酸菌进行的生物胺产生的确认
按照Bover-Cid和Holzapfel(1999)建议的方法，测试了是否产生了可能对人体有害的生物胺，例如组胺、酪胺、腐胺或尸胺。简言之，在使用Bover-Cid和Holzapfel(1999)建议的测试固体培养基的成分制备培养基之后，将每种乳酸菌菌株接种并在37℃下培养约72小时，并且观察培养基的颜色变化。如果存在生物胺，则由于脱羧酶的作用，接种细菌周围的pH值会升高，并且培养基中所含的溴甲酚紫试剂从黄色变为紫色。
作为结果，如图3B中所示，即使在用于观察是否合成了生物胺的固体培养基中，也存在K2、K6和K8的生长，但是没有颜色变化，表明没有产生组氨酸、酪胺、腐胺和尸胺中的任何一种生物胺。
实施例2-6.抗生素测试
使用包括氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、四环素和氯霉素在内的9种类型抗生素的E-测试条(E-test strip)(BioMerieux，法国)进行抗生素测试，以确定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。简言之，将待测试的乳酸菌各自混悬至约0.8的吸光度OD600，并随后使用无菌棉签将其散布在MRS固体培养基上。将其上散布有乳酸菌的固体培养基干燥约3分钟，并将E-测试条置于其上，随后在37℃下培养48小时。在此，由于乳酸菌的性质，可出现对氨基糖苷庆大霉素、卡那霉素和链霉素的固有抗性，因此，作为相应抗生素的测试培养基，使用了平板计数琼脂(plate-count agar，PCA)(Difco实验室，美国)或Mueller-Hinton琼脂(Mueller-Hinton agar，MHA)Difco实验室，美国)。对于抗生素的类型和可被认为是安全的最低抑菌浓度的标准，参考了欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)发布的指南(动物饲料中使用的添加剂和产品或物质的EFSA小组，2012年)。上述实验的结果示于下表3中。
[表3]
表3中各数值的单位为μg/ml，并且各缩写如下：AMP，氨苄青霉素；VAN，万古霉素；GEN，庆大霉素；KAN，卡那霉素；STR，链霉素；CD，克林霉素；ERY，红霉素；TET，四环素；CM，氯霉素；NR，不需要的。
如根据表3明显的，本公开内容的所有三种类型的植物乳杆菌菌株均符合EFSA建议的指南的标准，并因此被确定为安全的。在此，VAN的最低抑菌浓度为94至128μg/ml，并且STR的为94至194μg/ml，但是植物乳杆菌物种不需要基于EFSA的VAN和STR的敏感度值，这表示为NR(不需要的)。
实施例2-7.乳酸菌抗微生物作用的确认
为了确认K2、K6和K8的抗微生物功能，通过盘式测试测量透明区域来确定乳酸菌K2、K6和K8对总共七种类型的感染性或机会性细菌的抗微生物活性，所述细菌包括四种类型的革兰氏阳性：SA、LM、SM和SS以及三种类型的革兰氏阴性：EC、PA和CS。将在BHI平板培养基中培养过夜的7种类型的细菌分别混悬在1×磷酸缓冲盐水(PBS)中，直到获得约0.8的OD600。将每种混悬液用无菌棉签吸收，散布在用于乳酸菌抗微生物活性测试的琼脂培养基上，其中BHI和MRS以1:1的比例混合，并干燥约3分钟。将每个8mm纸盘(Advantec，日本)附着在干燥的测试琼脂培养基上，并将在MRS肉汤中培养约18至20小时的各35μl的K2、K6和K8溶液接种到纸盘上，干燥约3分钟，在37℃下培养并观察。在培养之后形成的透明区域的尺寸以测量其直径的方式确定，并在减去纸盘的直径8mm之后进行计算。
基于K2、K6和K8对七种类型的感染性或机会性细菌的抗微生物活性的测量结果，对七种类型的目标细菌进行了四次测试的所有乳酸菌的抗微生物作用表示为平均值，并且其结果示于下表4中，表明所有菌株均具有抗微生物作用。
[表4]
透明区域的直径(表4中的各数值)的单位是mm，并且各缩写如下：金黄色葡萄球菌KCTC1621(SA)、单核细胞增生李斯特菌KCTC3569(LM)、变异链球菌KCTC3065(SM)、唾液链球菌ATG-P1(SS)、大肠杆菌KCTC1682(EC)、铜绿假单胞菌KCTC2004(PA)、阪崎肠杆菌KCTC2949(CS)。
通过这样的实验，可通过以下来确定K2、K6和K8的稳定性：不存在溶血、不存在引起变态反应或疾病的生物胺、以及与抗生素敏感性有关的安全性、和基于常识考虑植物乳杆菌属的安全性(de Varies et al.,2006)，可以发现，本公开内容的乳酸菌对于应用于人是安全的。
实施例2-8.胆盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH)活性的确认
为了确认作为每种乳酸菌的功能的胆盐水解酶(BSH)活性的存在或不存在，根据Dashkevicz和Feighner(1989)中描述的方法进行了实验。简言之，通过向MRS添加0.5％(w/v)牛磺胆酸钠(TDCA，Sigma-Aldrich，德国)来制备琼脂培养基。将K2、K6和K8乳酸菌接种到相应的琼脂培养基中，置于厌氧罐中，并在37℃下培养约72小时，并确认其结果。
如图4A中所示，所有K2、K6和K8乳酸菌均表现出BSH活性，并且观察到不透明的白色硬菌落的形成而没有沉淀物渗入到外围中，这是植物乳杆菌具有BSH活性的特征现象。
实施例2-9.产生过氧化氢的能力的确认
对于作为每种乳酸菌的功能的产生过氧化氢的能力，通过向MRS添加0.25mg/ml的四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich，德国)和0.01mg/ml来制备琼脂培养基(McGroarty et al.,1992)。在此，在MRS琼脂高压灭菌之后，在约50℃下添加添加剂。将每种乳酸菌接种到完全硬化的测试琼脂培养基中，置于厌氧罐中，并在37℃下培养约48至72小时。培养之后，将乳酸菌从厌氧罐中取出并暴露于空气，观察菌落和周围的颜色变化。
如图4B中所示，关于产生过氧化氢的能力，每种乳酸菌的菌落和与其相邻的表面变成深蓝色，表明乳酸菌K2、K6和K8产生了过氧化氢。
实施例2-10.抗氧化活性的确认
为了评价每种乳酸菌菌株的抗氧化活性，使用2,2’-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Sigma-Aldrich，德国)进行了自由基清除实验。简言之，将乳酸菌培养约24小时，使其在37℃下与溶菌酶(Sigma-Aldrich，德国)反应2小时，并通过声处理进行裂解以获得每种乳酸菌裂解物。使用含水量分析仪测量其固体含量，并将储备溶液调节至50mg/ml的浓度。为了制备ABTS，将14mM ABTS储备溶液和4.9mM过硫酸钾以1:1的体积比混合，然后进行黑暗反应过夜，以使所得混合物变为蓝绿色。将通过稀释相应溶液直至吸光度OD734达到约0.7而获得的工作溶液添加有10％的每种乳酸菌裂解物样品，然后进行黑暗反应10分钟，在此之后测量在734nm波长下的吸光度，并将每个测量值代入以下公式。
ABTS自由基清除活性(％)＝{1-(OD样品/OD对照)}×100
使用ABTS的实验结果示于图4C中，并且所有K2、K6和K8菌株均表现出自由基清除活性。在这些菌株中，K6在10mg及以上时表现出最大的作用，并且次大的抗氧化活性是K8的抗氧化活性，接着是K2。
即使通过这些实验结果，BSH也参与了次级胆盐的代谢，因此，当本公开内容的菌株以能够摄取具有BSH活性的乳酸菌的形式被开发为产品时，可以确认乳酸菌具有胆汁抗性，并参与宿主胆固醇代谢的中间过程，从而降低了宿主的胆固醇(Begley et al.,2006)。
此外，本公开内容的乳酸菌产生过氧化氢的能力表明，它可以通过帮助抗微生物活性来抑制阴道炎病原体和机会性细菌的增殖。而且，可以证实，通过其裂解物的抗氧化作用，可以清除在患处产生的过量自由基，从而对患处的恢复具有积极作用。
实施例3.乳酸菌对阴道炎病原体的抗微生物作用的确认
实施例3-1.乳酸菌培养液的生长的确认
为了测量乳酸菌培养液抑制阴道炎病原体生长的活性，制备了10倍浓缩的无细胞培养上清液(cell-free culture supernatant，CFCS)。将K2、K6和K8乳酸菌的每一种的培养液以4,000rpm离心25分钟，从而将乳酸菌的细胞与培养上清液彼此分离。使用0.2μm孔注射式过滤器(Sartorius，德国)过滤培养上清液。将过滤的培养物上清液冻干并混悬在1×PBS中以得到与初始培养液的体积相比浓缩10倍的溶液。在独立的培养条件下，以1×105CFU/ml的浓度接种CA，并且以1×106CFU/ml的浓度接种GV。将乳酸菌的CFCS以相当于最终体积的0.1倍的体积添加至接种了阴道炎-病原体的溶液中以达到1×，并且将未添加CFCS的测试组用作对照。在独立的阴道炎-病原体培养条件下，对于CA，将混合的组合物培养24小时，对于GV培养48小时，并在OD600的波长下测量吸光度。基于测得的吸光度，使用以下细胞毒性计算公式确定生长抑制。在该公式中，OD对照表示对照的吸光度，且ODcfcs表示添加了CFCS的组的吸光度。
生长抑制(％)＝(OD对照-ODcfcs)/OD对照×100
用每种乳酸菌的CFCS以1×的浓度处理接种有每种阴道炎病原体的培养液的结果，如图5A和5B中所示，对于CA在培养24小时之后，K2表现出87.05％的生长抑制，K6表现出82.11％的生长抑制，而K8表现出81.34％的生长抑制，并且对于GV在培养48小时之后，K2表现出37.49％的生长抑制，K6表现出28.25％的生长抑制，而K8表现出44.60％的生长抑制。
**白色念珠菌KCTC7678(CA)，阴道加德纳菌KCTC5096(GV)。
实施例3-2.共聚的确认
作为抗微生物活性的另一指标，根据Handley et al,1987建议的方法，测量了乳酸菌在阴道炎病原体上的共聚。
简言之，将乳酸菌和阴道炎病原体以13,000rpm离心5分钟，并倾倒出上清液，在此之后使用1×PBS洗涤沉淀的微生物细胞。重复洗涤两次之后，使用1×PBS将微生物各自混悬，直到获得1.0的吸光度OD600。将乳酸菌混悬液和阴道炎病原体以相同的体积比混合，通过涡旋匀化，并静置，在此之后在1、4和8小时时小心地获得混合溶液的上清液，并测量其吸光度。将未混合微生物的混悬液用作对照。基于所测量的吸光度，使用以下公式计算共聚。在此，OD病原体表示阴道炎病原体的吸光度，ODLAB表示乳酸菌的吸光度，并且OD混合表示微生物混合溶液的吸光度。
共聚(％)＝{(OD病原体+ODLAB)/2-OD混合}/(OD病原体+ODLAB)/2
基于如上所述的对乳酸菌和阴道炎病原体的共聚的评价结果，如图5C和5D中所示，对于CA，在8小时时，K2表现出70.73％的共聚，K6表现出58.57％的共聚，而K8表现出57.88％的共聚，并且对于GV，K2表现出32.72％的共聚，K6表现出30.39％的共聚，而K8表现出20.45％的共聚。
**白色念珠菌KCTC7678(CA)，阴道加德纳菌KCTC5096(GV)。
通过这些实验结果，表现出了对是感染性阴道炎之主要原因的CA和GV的生长抑制、共聚和消毒的作用。此外，通过对七种类型的机会性细菌的定性抗微生物活性，发现本公开内容的菌株在平衡阴道微生物区系和预防感染方面非常有效。特别地，可以证实，从乳酸菌的细胞中排出的物质具有基于K6和K8培养液对CA和GV的生长抑制的抗微生物作用，以及本公开内容的菌株可以基于共聚能力通过与相应的病原体紧密接触来使消毒能力和生长抑制作用最大化。
实施例3-3.通过共培养的消毒能力的确认
通过共培养测试了本公开内容的乳酸菌对阴道炎病原体的消毒能力的抗阴道炎作用。在抗CA实验中，以1:1的比例混合浓度为约2.5×106CFU/ml的CA和浓度为约2.5×106CFU/ml的每种乳酸菌，并且其共培养在1:1混合的YM和MRS的培养基中进行。在抗GV实验中，以1:1的比例混合浓度为约1.0×108CFU/ml的GV和浓度为约1.0×108CFU/ml的每种乳酸菌，并随后接种到10％的马血清BHI肉汤中。每个共培养实验进行48小时，并在初始和每24小时收集样品的一部分，并通过连续稀释法和平板散布法进行活细胞计数。在抗CA实验中，为了单独测量CA，使用了含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的YM平板培养基。在抗GV实验中，通过使用5％兔血BHI平板培养基区分GV和乳酸菌之间的菌落形成来测量CFU。
在乳酸菌和阴道炎病原体的48小时共培养实验中，如图6A和图6B中所示，在其中K2、K6和K8与CA共培养的实验组中，CA在48小时时完全消失，并且在24小时时的消毒能力在K2中为99.03％，在K6中为99.49％，而在K8中为99.53％。
在GV的实验中，如图6C和6D中所示，在24小时时的消毒能力在K2中为87.37％，在K6中为92.50％，而在K8中为93.71％。在此，在最初的24小时之后，GV平均死亡约90％，并随后缓慢生长，推测这是由于为自我保护而形成的生物膜，其是GV的特征之一。在CA和GV的共培养实验中，已确认与每种阴道炎病原体的初始值(0小时)相比，在24小时和48小时时的消毒值在统计学上具有显著性。
实施例4.乳酸菌的阴道健康改善作用
实施例4-1.乳酸菌增强先天免疫的作用
为了测量K2、K6和K8乳酸菌的免疫学作用，进行了使用细胞的细胞因子定量实验。所使用的细胞是小鼠巨噬细胞系RAW264.7，并且每个细胞实验所使用的培养基是补充有10％胎牛血清(Gibco，美国)和1％青霉素/链霉素混合物(Sigma-Aldrich，德国)的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM，Gibco，美国)。回收在材料处理之前以约80％至90％汇合度培养的RAW264.7细胞，并以24孔板的每孔1×106个细胞的量接种。接种之后，在37℃和5％ CO2的环境中进行培养24小时，以实现对24孔板的附着和使其稳定。每个孔用浓度为100μg/ml和500μg/ml的乳酸菌裂解物处理，并将1μg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma-Aldrich，德国)用作阳性对照，并将未用任何材料处理的实验组用作阴性对照。在材料处理之后，将细胞在37℃和5％ CO2下培养24小时，并回收细胞培养液，然后对IL-6和TNF-α进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)。使用小鼠IL-6Quantikine ELISA试剂盒(R&D系统，美国)进行IL-6的测量，并且使用小鼠TNF-αQuantikine ELISA试剂盒(R&D系统，美国)进行TNF-α的测量。
作为结果，如图7A和7B中所示，当用乳酸菌裂解物处理RAW264.7细胞时，与对照相比，IL-6和TNF-α的浓度提高。当使用浓度为500μg/ml的K8裂解物时，与使用浓度为100μg/ml的K8裂解物时相比，所产生的IL-6的量显著降低，并且在K2裂解物的情况下，发现所产生的TNF-α的量随着其浓度的提高而显著提高。总体上，在用乳酸菌裂解物处理的所有组中，IL-6和TNF-α的量均提高，并且其提高低于LPS处理的组的提高。
实施例4-2.乳酸菌抑制炎症的作用
以与用于确认实施例4-1的先天免疫的提高的测试方法相同的方式进行炎症抑制实验，但是进一步添加了使用乳酸菌裂解物和LPS二者的实验组。该实验旨在测量抑制由LPS诱导的炎症的能力。为此，每个实验组在材料处理之后在37℃和5％ CO2的环境中培养24小时，回收细胞培养液，并使用小鼠IL-10Quantikine ELISA试剂盒(R&D系统，美国)进行IL-10的ELISA。
作为结果，如图8中所示，当用1μg/ml的LPS和用100μg/ml的每种乳酸菌裂解物二者处理RAW264.7细胞时，IL-10的浓度显著提高。
用K2裂解物和K6裂解物进一步处理的组表现出相似的提高的IL-10水平(约1100至1150pg/ml)，而用K8裂解物处理的组与用K2裂解物和K6裂解物处理的组相比表现出相对较小的IL-10的提高(约400pg/ml)。但是，与用单独的LPS处理的组相比，用乳酸菌和LPS二者处理的所有实验组均表现出统计学上显著的提高。
从免疫学的角度出发，基于这些实验结果，所有三种类型的乳酸菌裂解物K2、K6和K8在巨噬细胞系RAW264.7中诱导IL-6和TNF-α，认为这证明了提高先天免疫或增强免疫的作用。IL-6是免疫调节中非常重要的细胞因子，具有例如促炎和抗炎作用，包括巨噬细胞的活化、中性粒细胞的诱导和聚集以及针对入侵病原体的炎性响应活性(Scheller et al.,2001；Fielding et al.,2008)。基于与代表性炎性物质LPS诱导的IL-6和TNF-α相比的低的提高，将此作用视为免疫增强作用而不是病理性炎性响应是合理的。此外，TNF-α(其是具有例如抗肿瘤作用、抑制发热和病毒增殖、活化巨噬细胞等作用的细胞因子)产生的提高也表明本公开内容的乳酸菌具有提高先天免疫的作用(Vujanovic,2011)。通常，用LPS进行的处理引起炎症，并且产生的IL-10控制和抑制炎性应答，并且所产生的IL-10的量比LPS诱导的IL-10的量高2至5倍，基于此乳酸菌被评价为有效抑制过度的炎性应答。
因此，可以得出结论，K2、K6和K8乳酸菌是安全的菌株，具有针对阴道炎病原体的抗微生物活性、抗氧化作用以及提高先天免疫和抑制炎症的作用，最终改善了使用者的泌尿生殖健康。
实施例5.乳酸菌的全基因组分析
对于K2、K6和K8乳酸菌的全基因组分析，提取基因组DNA，并使用PacificBioscience的单分子实时(Single-Molecule Real-Time，SMRT)测序技术分析其核苷酸序列。使用SMRT分析软件v2.3.0的分级基因组装配过程(Hierarchical Genome AssemblyProcess，HAGP)2协议来装配由此获得的核苷酸序列数据，并且利用使用子系统技术的快速注释(Rapid Annotation using a Subsystem Technology，RAST)服务器(http://rast.nmpdr.org/)进行注释。此外，为了确认三种类型乳酸菌的独立性，进行了平均核苷酸同一性(ANI)分析，并使用PathoFinder 1.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder/)从遗传信息中再次验证了安全性。
基于分析乳酸菌K2、K6和K8的全基因组的结果，如根据下表5和6明显的，其染色体DNA大小不同，并且质粒的数量和大小也不同。
在为了确认三种类型乳酸菌的独立性而进行的ANI分析中，K2和K6表现出96.25％的同一性，K2和K8表现出96.09％的同一性，而K6和K8表现出99.92％的同一性，表明这些属于植物乳杆菌物种，但是它们之间存在0.08％至3.91％的差异。
[表5]
[表6]
此后，基于使用上述基因组信息通过RAST服务器的注释结果，确认了各个菌株的基因组成也不同，如下表7中所示。K2乳酸菌具有49个与细胞壁和荚膜相关的基因，而K6和K8乳酸菌具有71个基因。在与碳水化合物相关的基因的情况下，K2乳酸菌具有215个基因，K6乳酸菌具有235个基因，并且K8乳酸菌具有245个基因。它们之间的差异呈现为三种类型的乳酸菌属于同一物种，但表现出不同的生长速率或功能。
[表7]
/>
<制剂实施例1.药物制剂>
制剂实施例1-1.片剂的制备
将200g本公开内容的植物乳杆菌K2、K6和K8中的任一种与175.9g乳糖、180g马铃薯淀粉和32g胶体硅酸混合。将所得混合物添加10％明胶溶液，粉碎，并通过14目筛。将所得产物干燥并添加160g马铃薯淀粉，50g滑石和5g硬脂酸镁，并将所得混合物制成片剂。
[保藏机构]
保藏机构的名称：韩国典型培养物保藏中心
登记号：KCTC13577BP
登记日期：20180710
保藏机构的名称：韩国典型培养物保藏中心
登记号：KCTC13570BP
登记日期：20180703
保藏机构的名称：韩国典型培养物保藏中心
登记号：KCTC13571BP
登记日期：20180703

Claims (11)

1.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATG-K2的保藏号：KCTC 13577BP；保藏地址：韩国典型培养物保藏中心。
2.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATG-K6的保藏号：KCTC 13570BP；保藏地址：韩国典型培养物保藏中心。
3.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATG-K8的保藏号：KCTC 13571BP；保藏地址：韩国典型培养物保藏中心。
4.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌对选自白色念珠菌(Candida albicans)和阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)的至少一种阴道炎病原体具有抗微生物活性。
5.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌对选自以下的至少一种细菌具有抗微生物活性：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)。
6.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌不引起溶血并且不产生选自组胺、酪胺、腐胺和尸胺的至少一种生物胺。
7.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌具有胆盐水解酶活性、产生过氧化氢的能力或抗氧化活性。
8.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌对选自以下的至少一种抗生素没有抗性：氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、四环素和氯霉素。
9.权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌，其中所述植物乳杆菌具有提高选自白介素-6和肿瘤坏死因子-α的至少一种细胞因子的量的先天免疫活性或提高白介素-10的量的抗炎活性。
10.用于预防或治疗阴道炎的药物组合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的植物乳杆菌。
11.包含权利要求1至3中任一项所述植物乳杆菌的组合物在制备用于在有此需要的对象中预防或治疗阴道炎之药物中的用途。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101930438B1 (ko) 2018-10-12 2018-12-18 (주) 에이투젠 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물
CN109908185B (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 江南大学 一种抑制变异链球菌和白色念珠菌双菌生物膜的方法
KR102139687B1 (ko) 2019-05-03 2020-07-30 주식회사 메디오젠 가드네렐라 바기날리스 및 칸디다 알비칸스에 항균 효과를 갖는 질염 치료 또는 개선용 유산균 mg4288
KR102063757B1 (ko) 2019-05-03 2020-01-08 주식회사 메디오젠 가드네렐라 바기날리스 및 칸디다 알비칸스에 항균 효과를 갖는 질염 치료 또는 개선용 유산균
CN110499271B (zh) * 2019-09-02 2021-11-23 千禾味业食品股份有限公司 一种植物乳杆菌qr19及其应用
KR102163551B1 (ko) 2020-04-21 2020-10-07 (주) 에이투젠 락토바실러스 플란타룸 atg-k2 또는 atg-k6를 함유하는 지질관련 대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR102549522B1 (ko) * 2021-09-16 2023-07-03 일동바이오사이언스(주) 락토바실러스 플란타럼 idcc 3501을 포함하는 질염에 유용한 조성물
WO2023227648A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Universiteit Antwerpen Bacterial biocontrol agent
CN115137758B (zh) * 2022-06-08 2024-01-19 诺佰克（武汉）生物科技有限公司 一种有利于女性生殖道健康的益生菌的制备及其应用
WO2024032452A1 (zh) * 2022-08-09 2024-02-15 成都倍特生物制药有限公司 一株植物乳杆菌及其应用
CN115851491A (zh) * 2022-08-31 2023-03-28 西北农林科技大学 植物乳植杆菌及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1888051A (zh) * 2005-06-28 2007-01-03 北京天佑达生物工程科技有限公司 一株植物乳杆菌及其应用
WO2016128414A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 Ab-Biotics, S.A. Probiotic strains for urinary tract infections
WO2016167489A1 (ko) * 2015-04-16 2016-10-20 주식회사 고바이오랩 질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주
WO2017108955A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Roelmi Hpc S.R.L Probiotic compositions and use thereof
WO2017162669A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Yun NV Vaginal preparations for maintaining and/or restoring healthy female microbiota
CN107299065A (zh) * 2017-06-20 2017-10-27 广东强基药业有限公司 一种植物乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用
KR101860513B1 (ko) * 2017-03-30 2018-05-24 주식회사 메디오젠 질에서 분리한 락토바실러스 살리바리우스 mg242를 포함하는 칸디다성 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8460917B2 (en) * 2002-03-21 2013-06-11 Bifodan A/S Lactobacillus strains
KR101098241B1 (ko) 2009-11-09 2011-12-23 주식회사한국야쿠르트 요로감염과 칸디다성 질염을 억제하는 활성을 갖는 락토바실러스 에스피. 에이취와이 7801 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR102531695B1 (ko) * 2014-11-25 2023-05-12 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 프로바이오틱으로서 사용하기 위한 락토바실러스, 및 프로바이오틱을 비롯한 제제에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 사용되는 혈액 세포 집단
KR101750468B1 (ko) 2016-03-04 2017-06-27 주식회사 메디오젠 락토바실러스 퍼멘툼 mg901 또는 락토바실러스 플란타룸 mg989를 포함하는 조성물
KR101784847B1 (ko) 2016-05-10 2017-10-13 주식회사 하우동천 질염 예방 및 치료용 유산균 함유 조성물 및 이의 용도
KR101720145B1 (ko) * 2016-07-08 2017-04-07 (주)정가진면역연구소 여성 질염 예방 및 개선 기능성 조성물
KR101930438B1 (ko) 2018-10-12 2018-12-18 (주) 에이투젠 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 atg-k2, atg-k6 또는 atg-k8, 이를 포함하는 질염의 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1888051A (zh) * 2005-06-28 2007-01-03 北京天佑达生物工程科技有限公司 一株植物乳杆菌及其应用
WO2016128414A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 Ab-Biotics, S.A. Probiotic strains for urinary tract infections
WO2016167489A1 (ko) * 2015-04-16 2016-10-20 주식회사 고바이오랩 질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주
WO2017108955A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 Roelmi Hpc S.R.L Probiotic compositions and use thereof
CN109069551A (zh) * 2015-12-22 2018-12-21 罗尔米健康及个人护理有限公司 益生菌组合物及其用途
WO2017162669A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Yun NV Vaginal preparations for maintaining and/or restoring healthy female microbiota
CN109562134A (zh) * 2016-03-21 2019-04-02 Yun股份有限公司 用于维持和/或恢复健康女性微生物群的阴道制剂
KR101860513B1 (ko) * 2017-03-30 2018-05-24 주식회사 메디오젠 질에서 분리한 락토바실러스 살리바리우스 mg242를 포함하는 칸디다성 질염의 예방 또는 치료용 조성물
CN107299065A (zh) * 2017-06-20 2017-10-27 广东强基药业有限公司 一种植物乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vitro probiotic properties of vaginal Lactobacillus fermentum MG901 and Lactobacillus plantarum MG989 against Candida albicans;Kang CH等;《Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol》;第229卷;DOI: 10.1016/j.ejogrb.2018.07.005. *
Whole Genome Analysis of Lactobacillus plantarum Strains Isolated From Kimchi and Determination of Probiotic Properties to Treat Mucosal Infections by Candida albicans and Gardnerella vaginalis;Beck BR等;《Front Microbiol》;第10卷;DOI: 10.3389/fmicb.2019.00433，特别是第1、5-11页 *
抑制阴道加德纳菌的乳酸菌的筛选及其生物学特性;柳迎春;《中国优秀硕士学位论文全文 数据库医药卫生科技辑》(第1期);第E059-197页 *
植物乳杆菌的益生特性及其在乳制品中的应用;马千里等;《中国奶牛》(第01期);第36-40页 *

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