KR101724601B1

KR101724601B1 - 아토피 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101724601B1
Application number: KR1020140152296A
Authority: KR
Inventors: 정명준
Original assignee: 주식회사 쎌바이오텍
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2017-04-10
Also published as: KR20160053447A

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5, (KCTC 12398)), 락토바실루스 플란타룸 LP3((Lactobacillus plantarum LP3(KCTC 10782)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP), 및 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)), 또는 이들의 배양물을 포함하는 아토피의 예방 또는 치료에 효과적인 조성물에 관한 것이다.

Description

아토피 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ATOPIC DERMATITIS}

본 발명은 아토피의 예방이나 치료에 유용한 신규한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 4종의 유산균 균주들을 포함하여 아토피의 예방 및 치료에 유용한 식품 및 의약 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염(Atopic Dermatitis, "AD")은 주로 유아기 혹은 소아기에 시작되는 만성적이고 재발성의 염증성 피부질환으로 소양증과 피부건조증, 특징적인 습진을 동반한다. 아토피성 피부염은 세계적으로 급증하는 추세이며 유병률이 인구의 20%라는 보고도 있다. 더욱이, 아토피성 피부염은 단지 피부질환일 뿐만 아니라, 알레르기성 천식 및 비염과 같은 알레르기성 행진(allergic march)의 신호가 된다. 그러나 아토피성 피부염의 정확한 병태생리학은 아직 규명되지 않고 있고, 현재로서는 아토피성 피부염은 유전적 감수성과 연관된 다인성 질병으로, 손상된 피부 또는 내장의 장벽기능, 또는 환경 및 식습관과 같은 어떠한 생활방식의 산물로 인하여 증가한 항원에 대한 면역반응으로 알려져 있을 뿐이다. 아토피성 피부염을 치료하는 것은 쉽지 않기 때문에 아토피성 피부염의 변경가능한 위험 인자들을 관리하고 아토피성 피부염에 대한 면역반응을 조정하는 것이 필요하다.

또한, 아토피 환자들의 경우에는 면역학적 장애가 보고되어 왔다. 아토피성 피부염 환자 관련 피부 병변은 Th2-세포-매개 면역 반응(Th2-cell- mediated immune response)에 의하여 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13의 과잉 생성을 보인다. 더욱이, 아토피성 피부염은 혈청 면역글로불린(IgE) 농도의 증가 및 Th1 면역반응으로 생성되는 인터루킨-12(IL-12) 및 인터페론 감마 (IFN-γ) 생성의 감소와 관련되어 있다.

아토피성 피부염의 치료제로서는 항히스타민제로 대표되는 화학전달 물질의 길항제나, 항염증제로 이용되는 스테로이드제가 주로 사용되고 있다. 이들은 모두 대증요법적으로 이용되는 약제로, 발증의 주요 인자인 혈청 면역글로불린 IgE의 양을 직접적으로 감소시키는 기능은 없다. 또한, 항히스타민제는 졸음이나 구갈 등의 부작용을 초래하고, 스테로이드제는 면역계 전반을 억제하는 등의 부작용의 우려가 있다. Th2세포가 현저하게 우위가 되는 상황을 완화시킬 수 있는 약제는 알레르기의 근본적 치료를 가능하게 할 것으로 보여지나 이러한 약제는 아직 개발되지 않았다.

이러한 배경 하에서 IgE의 생성을 억제하는 기능을 갖는 유산균이 아토피성 피부염의 유용한 보충제로서 주목되고 있다. 유산균의 아토피성 피부염 치료 작용은 균주에 특이적인데, 현재 식품 또는 약품으로 이용되고 있는 제품들의 아토피 개선 효과는 충분하지 아니하므로, 효과가 우수한 프로바이오틱스를 포함하는 아토피의 치료에 유용한 조성물의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 내산성, 내담즙성, 장상피세포 부착능이 우수할 뿐만 아니라, 면역 증강 효과, 특히 Th2 반응 과잉으로 인한 Th1/Th2 불균형을 조절하는 효과가 우수한 다양한 종의 유산균 균주들을 포함하여 아토피의 예방 및 치료에 효과적인 식품 및 의약 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 락토바실러스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) (KCTC 12398BP), 락토바실루스 플란타룸 LP3(Lactobacillus plantarum LP3) (KCTC10782BP)), 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5)(KCTC 12202BP), 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP) 또는 이들의 배양물을 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 복합 유산균을 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물은 기타 유산균 또는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 Th2 세포가 우위가 되는 상황을 완화시키는 4종의 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양물을 포함하므로, 본 발명에 따르면 아토피의 치료에 유용한 조성물이 제공될 수 있다.

또한 본 발명의 아토피 예방 또는 치료용 조성물은 아토피성 피부염의 발증의 주요 인자인 혈청 면역글로불린 IgE의 양을 직접적으로 감소시켜 아토피 예방 또는 치료용 조성물로서 의약품, 식품, 또는 건강 보조 식품으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) KCTC 12398BP 균주의 16S rRNA 서열, 및 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5와 관련 락토바실루스 속 유산균종들의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계(phylogenetic relationship)를 비교 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 락토바실루스 카제이 LC5 균주의 지놈 DNA의 RAPD(R및om Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과 및 PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3) KCTC 10782BP 균주의 16S rRNA 서열 및 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주와 관련 비피도박테리움 속 균종의 16S rRNA 서열의 상동성 및 계통발생적 관계를 비교 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 지놈 DNA의 RAPD 분석 결과 및 PFGE 분석 결과이다.
도 5a는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 장정착성 실험 결과를 도시한 사진이고, 도 5b는 본 발명의 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 장정착성 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 실시예에서 아토피성 피부염이 유발된 NC/Nga 마우스 준비 과정 및 본 발명의 조성물(ATP) 투여 순서를 나타낸 모식도이다.
도 7a는 아토피성 피부염이 유발된 NC/Nga 마우스 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 후 피부 병변의 상태 변화를 보여주는 사진이다.
도 7b는 아토피성 피부염이 유발된 NC/Nga 마우스 모델에 본 발명의 조성물을 투여한 후 긁기 행동(scratching behavior)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 조성물의 투여가 생체 내에서의 IgE 농도에 미치는 효과를 보여주는 그래프이고, 도 8b는 본 발명의 조성물의 투여가 생체 내에서의 IL-4 농도에 미치는 효과를 보여주는 그래프이며, 도 9c는 본 발명의 조성물의 투여가 생체 내에서의 IL-5 농도에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 조성물은 DNCB-감작된 NC/Nga 마우스에 처리한 다음 Th1 반응 유도 사이토카인인 IL-12p40의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 유산균 조성물의 투여가 실험 그룹들의 IFN-γ 싸이토카인 농도에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10a-b는 각종 유산균 제제의 반복 투여가 아토피성 피부염 모델 동물의 아토피 증상에 미치는 효과를 나타내는 조직병리학적 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 유산균 조성물의 투여가 아토피성 피부염 모델 동물(NC/Nga 마우스)의 비만세포의 수에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 유산균 조성물의 투여가 실험 그룹들의 체중에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

본 명세서에 사용되는 경우에, "치료하다(treat)", 및 "치료(treatment)"라는 용어는 아토피성 피부염 증상의 예방, 감소, 경감 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 하나의 양상은 아토피의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물에는 아래와 같은 유산균 균종들이 포함되는데, 이러한 유산균 균주들은 한국생명공학연구원 유전자은행에 아래와 같이 기탁되었다.

1) 락토바실러스 카제이 LC5(Lactobacillus casei LC5)(KCTC 12398BP),

2) 락토바실루스 플란타룸 LP3(Lactobacillus plantarum LP3) (KCTC 10782BP),

3) 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5)(KCTC 12202BP),

4) 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)

본 발명의 조성물은 IL-4의 생성을 억제하고 IL-12의 생성을 촉진함으로써 Th2 세포가 분화·성숙하는 과정을 억제할 수 있다. 이러한 메카니즘에 의한 아토피성 피부염 치료제는 아토피 질환에 대하여 원인 요법적으로 이용할 수 있는 치료제가 될 수 있고, 또한 항히스타민제나 스테로이드제와 같은 부작용의 위험이 없어 더욱 바람직하다.

상기 조성물은 4종의 유산균을 동일한 비율로 포함하거나, 락토바실루스 속 유산균과 비피도박테리움속 유산균을 2:1 ~ 10:1의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 균주의 혼합물을 10⁷ 내지 10¹² cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 상술한 유산균 이외에 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스( Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함할 수 있다.

상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 제형화되어 조제될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유산균들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화 될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.

분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.

코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아토피 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1x 10⁶ 살아있는 세포 이상, 바람직하게는 1x 10⁸ 내지 1 x 10¹² 살아있는 세포가 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.

본 발명의 유산균 함유 아토피 예방 또는 치료용 조성물은 사람 또는 동물에 약 또는 식품으로 투여 또는 섭취될 수 있다. 본 발명의 유산균 함유 아토피 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 약품은 본 발명의 하나의 실시형태이고, 본 발명의 유산균 함유 아토피 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 식품 또한 본 발명의 실시형태이다. 이러한 식품의 예로는 요구르트 및 발효된 유제품을 들 수 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

일반적으로 아토피성 피부염에서 싸이토카인 농도의 변화는 분화되지 않은 T-헬퍼세포-1(Th1)이 T-헬퍼세포-2(Th2)로 분화가 매우 촉진되는 Th2의 활성화에 기초한 면역 체계에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 이러한 Th2 세포의 활성화 과정에서, Th2 세포는 인터루킨-4(IL-4), IL-5, IL-13, IL-9 및 IL-10을 생성한다. 이들 사이에서, IL-4 및 IL-13은 면역글로불린E(IgE) 및 IgG의 합성을 촉진시키고, 인체 내에서, 이들은 IgE 및 IgG4의 합성을 촉진시킨다.

본 발명에서는 신규한 단일 유산균 균주들 및 이들을 포함하는 혼합 유산균의 투여 후 쥐의 Th2 혈청과 관련한 싸이토카인의 농도 변화 패턴을 조사한 결과, 유산균 처리하지 않은 그룹 보다 IgE 및 IL-4의 상당한 감소를 보여주었다. 특히, IgE는 단독 유산균 균주를 투여한 그룹보다 혼합 유산균 투여한 그룹에서 더 크게 감소하는 경향을 나타내었다. 더욱이 유산균 처리한 모든 그룹의 IL-4의 농도가 양성 대조군 보다 더 두드러지게 감소하였다. 따라서 동물 모델에서 혼합된 유산균의 투여는 아토피성 피부염 증상을 완화시키는 것에 효과적인 것으로 확인되었다.

본 발명의 유산균 조성물은 IL-12, IL-18 및 IFN-α등의 생성을 증가시키므로 Th1 세포로의 분화를 촉진하고 이들의 IFN-γ 생성을 유도하므로, Th2가 우세한 상황에서 Th1/Th2 균형을 맞추는 작용을 한다. 따라서 Th2 반응 과잉으로 인한 Th1/Th2 불균형으로 유발되는 암, 아토피, 알레르기, 및 자가 면역 질환을 예방 또는 치료에 효과적이다.

또한 본 발명에서는 4종류의 유산균 균주들을 포함하는 복합 유산균의 투여로 인한 IL-4의 농도의 감소(Th2 군)와 IL-12 및 IFN-γ(싸이토카인의 Th1 군)농도의 증가에 의하여 아토피성 피부염의 증상을 완화하였다는 것을 확인하였고, 동시에 혼합 유산균 처리한 싸이토카인의 농도는 단독 유산균 균주로 처리한 그룹의 싸이토카인의 농도 보다 정상적인 농도에 더욱 근접하였다는 점에서 혼합 유산균의 투여는 단독 유산균 투여보다 더 효과적임을 확인할 수 있었다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 락토바실루스 카제이 LC5 ( Lactobacillus casei LC5) KCTC 12398BP 균주의 분리 및 동정

(1) 요약

유제품인 치즈에서 분리한 락토바실루스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5)는 L. casei ^T (ATCC 393)를 대조군으로 한 생화학적 방법 (API) 및 분자생물학적 방법 (16s rDNA 서열분석, RAPD, PFGE)을 통해 동정하였고, 기능성 (효소 활성) 및 안전성 (항생제 내성)을 통해 프로바이오틱스(Probiotics)의 기능을 가질 수 있는 유산균 제제임을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 분리된 락토바실루스 카제이 LC5을 한국생명공학연구원, 미생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12398BP를 부여받았다.

(2) 분리 및 동정

2-1. 신규 미생물의 분리

치즈를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 희석액 각 1 ㎖을 Man-Rogosa-Sharpe (MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 성장한 콜로니는 다시 MRS에 BCP(bromocresol purple)를 첨가 (0.17g/L)한 고체 배지에 피킹한 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 되므로, 콜로니 주위의 색이 노란 색으로 변한 콜로니를 유산균으로 판단하였고, 이 콜로니를 취하여 생화학적, 및 분자생물학적 동정을 진행하였다.

2-2. 신규 미생물의 동정

1) API 키트를 이용한 생화학적 동정

MRS 육즙에서 순수 배양한 락토바실루스 카제이 LC5 균주(Lactobacillus casei LC5) 1 ㎖을 취하여 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전물을 CHL 용액 1 ㎖에 현탁한 후 원심분리하였다. 침전물을 9 ㎖의 CHL 용액에 재현탁한 후 API 50CHL 키트에 적당량 분주한 후 멸균한 파라핀 오일을 웰 위에 분주하고 37℃ 배양기에서 3일간 배양하여 당 이용도를 관찰하였다. 당 이용성 확인 결과는 API 웹(https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 분리한 락토바실루스 카제이 LC5는 글리세롤, 글루코스, 말토스, 락토스, 만니톨, 소르비톨 등 다양한 당을 잘 이용하는 것으로 확인되었다.

No	Carbohydrates	이용	No	Carbohydrates	이용
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	+	26	Salicine	+
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	+
3	D-Arabinose	+	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	+	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	-
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	+
8	Adonitol	+	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	-
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	+	40	D-Turanose	+
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	+
17	Inositol	+	42	D-Tagatose	+
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	+	44	L-Fucose	+
20	α-Methyl-D-mannoside	+	45	D-Arabitol	-
21	α-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	+
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	+
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	+
24	Arbutine	+	49	5-Ceto-gluconate	-

2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정

락토바실루스 카제이 LC5는 균주를 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하기 위해서 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 치즈에서 분리한 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 프라이머 R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여 E.coli 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/ampplate에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다(도 1의 (A) 참조).

DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V method를 이용하여 L. casei ^T (ATCC 393)와 유연관계가 높은 균종들과 염기서열의 동일성을 비교함으로써 확인하였다. 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은, 도 1의 (B)에 도시된 바와 같이, L. casei ^T(ATCC 393)와 가장 높은 96.9%의 동일성을 보였다

또한 16s rDNA 유전자 염기서열들을 이용하여 진화학적 유연관계를 계통수(phylogenetic tree)를 통해서 분석한 결과 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 L. casei ^T(ATCC 393)과 동일한 군으로 묶이는 것을 확인하였다 (도 1의 (C)). 따라서 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 유전학적으로도 L. casei 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD (R및om Amplified Polymorphic DNA) 분석

RAPD 분석은 치즈에서 분리한 락토바실루스 카제이 LC5로부터 지놈 DNA를 추출하였으며, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)₅ (5’-GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. 최종 산물인 PCR 산물은 EtBr에 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하여 도 2(a)에 나타내었다.

또한, PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) 분석은 순수 배양한 락토바실루스 카제이 LC5를 최종 흡광도(OD)를 OD₆₀₀=4로 해서 플러그를 제작한 후 여러 가지 효소를 이용해 지놈 DNA를 잘라서 전기영동을 행한 후 대조군인 L. casei ^T(ATCC 393)와 비교 분석하였다. 결과는 도 2(b)에 나타내었다.

RAPD 결과에서는 분리한 균주는, 도 2(a)에 도시된 바와 같이, L. casei ^T(ATCC 393)와 상이한 밴드 패턴을 보였다. 도 2(a)에서 레인 1은 L. casei ^T(ATCC 393)의 결과이고, 레인 2는 락토바실루스 카제이 LC5의 결과이다. 위의 결과를 토대로 치즈에서 분리한 미생물인 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T(ATCC 393)와 다른 신규 균주임을 확인하였다.

RAPD 또는 PFGE에 의한 DNA 지문 패턴을 분석한 결과, LC5와 L. casei ^T(ATCC 393)는 전반적으로 유사한 지문 패턴을 보이나 각 균주 특이적인 밴드가 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 이와 같은 분자 타이핑 분석을 통해서 락토바실루스 카제이 LC5는 락토바실루스 카제이 종에 속하는 신규한 균주임을 재확인하였다.

이상의 결과들을 토대로 치즈에서 분리한 해당 균주를 락토바실루스 카제이 LC5(Lactobacillus casei LC5)로 명명하였으며, 2013년 4월 11일에 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원, 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 12398BP를 부여받았다.

(3) 기능성 및 안전성

3-1. 신규 미생물의 기능성 및 안정성

1) 효소 활성 시험 (API ZYM 키트)

락토바실루스 카제이 LC5의 효소활성을 측정하기 위해 API ZYM 키트를 사용하여 생성 효소를 확인하여 하기 표 2에 나타내었다. 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T (ATCC 393)보다 Naphol-AS-BI-phosphohydrolase와 α-Glucosidase의 효소 활성이 높았다. Naphol-AS-BI-phosphohydrolase는 백혈구 내 호중구의 식균 작용을 활성화하고 α-glucosidase는 유당분해효소결핍증에 효과 있는 효소로 특히 유제품 분리 유산균에서 그 활성이 높은 것으로 알려져 있다. 표 2를 통해서 확인되는 바와 같이, 유제품에서 분리된 락토바실루스 카제이 LC5는 L. casei ^T (ATCC 393) 보다 우수한 효소활성을 보인다.

Enzyme	L. casei ^T (ATCC393)	L. casei LC5
1. Control	0	0
2. Alkaline phosphatase	0	1
3. Esterase (C4)	2	2
4. Esterase Lipase(C8)	3	2
5. Lipase (C14)	0	0
6. Leucine arylamidase	5	5
7. Valine arylamidase	5	5
8. Crystine arylamidase	2	2
9. Trypsin	0	0
10. α-Chymotrypsin	0	1
11. Acid phospatase	2	4
12. Naphol-AS-BI-phosphohydrolase	1	3
13. α-Galactosidase	0	1
14. β-Galactosidase	5	3
15. β-Glucuronidase	0	0
16. α-Glucosidase	0	3
17. β-Glucosidase	4	5
18. N-Acetyl-β-glucosidase	0	1
19. α-Mannosidase	0	0
20. α-Fucosidase	0	0
0, 0 nmol; 1, 5 nmol; 2, 10 nmol; 3, 20 nmol; 4, 30 nmol; 5, ≥ 40 nmol.

3-2. 신규 미생물의 안정성

1) 항생제 내성

분리된 락토바실루스 카제이 LC5의 항생제 내성을 측정함으로써 안전성을 검증하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

시너시드를 제외한 항생제에 대해서는 ISO-sensitest 육즙 10%와 MRS 육즙 90%를 혼합한 육즙에 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ㎍/㎖의 농도로 첨가해 사용하였으며, 시너시드는 BioMeriux 사의 E-테스트 스트립을 이용하여 진행하였다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 락토바실루스 카제이 LC5가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

신규한 유산균주인 락토바실루스 카제이 LC5는 실험에 사용된 모든 항생제에 대해 EFSA가 제시한 항생제 내성 기준 이하로 나타났다. 반코마이신 및 스트렙토마이신에 대한 내성은 내성 유전자의 존재에 의한 것이 아니라 락토바실루스 카제이의 유산균 균주가 가지는 고유한 특성이므로 EFSA에서는 락토바실루스 카제이의 반코마이신과 스트렙토마이신 내성에 대한 자료를 따로 요구하지 않는다. 따라서 락토바실루스 카제이 LC5 균주는 항생제 내성에 대한 우려가 없는 안전한 균주로 확인되었다.

항생제	MIC of LC5	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	0.5	2
Vancomycin (VAN)	>512	n.r
Gentamycin (GEN)	8	32
Kanamycin (KAN)	64	64
Streptomycin (ST)	32	n.r
Erythromycin (ERM)	0.5	1
Clindamycin (CM)	0.25	1
synercid (Q/D)	0.5	4
Tetracycline (TET)	1	4
Chloramphenicol (CP)	1	4
n.r: not required

2. 락토바실루스 플란타룸 LP3 ( Lactobacillus plantarum LP3) KCTC 10782BP의 분리 및 동정

(1) 요약

전통 발효식품인 김치에서 분리한 락토바실루스 플란타룸 LP3 (Lactobacillus plantarum LP3)는 L. plantarum ^T (ATCC 14917)를 대조군으로 한 생화학적 방법 (API) 및 분자생물학적 방법 (16s rDNA sequence, RAPD, PFGE)을 통해 동정하였고, 기능성(장정착성) 및 안전성(항생제 내성)을 통해 프로바이오틱스(Probiotics)의 기능을 가질 수 있는 유산균 제제임을 확인하였다. 이 결과들을 토대로 분리된 락토바실루스 플란타룸 LP3을 한국생명공학연구원, 미생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10782BP를 부여받았다.

(2) 분리 및 동정

2-1. 신규 미생물의 분리

김치를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 희석액 각 1 ㎖을 Man-Rogosa-Sharpe (MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 성장한 콜로니는 다시 MRS에 BCP (bromocresol purple)를 첨가 (0.17g/L)한 고체배지에 피킹한 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. BCP 지시약은 유산균이 젖산을 형성하여 주변 pH가 낮아지면 보라색에서 노란색으로 변하게 되므로, 콜로니 주위의 색이 노란 색으로 변한 콜로니를 유산균으로 판단하였고, 이러한 콜로니를 취하여 생화학적 및 분자생물학적 동정을 진행하였다.

2-2. 신규 미생물의 동정

1) API 키트를 이용한 생화학적 동정

MRS 육즙에서 순수 배양한 락토바실루스 플란타룸 LP3 1 ㎖을 취하여 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전물을 CHL 용액 1 ㎖에 현탁한 후 원심분리하였다. 침전물을 9㎖의 CHL 용액에 재현탁한 후 API 50CHL 키트에 적당량 분주한 후 멸균한 파라핀 오일을 웰 위에 분주하고 37℃ 배양기에서 3일간 배양하여 당 이용도를 조사하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 당 이용 여부를 API 웹 (https://apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 분석한 결과 락토바실루스 플란타룸과 99.9% 동일한 생화학적 특성을 가지는 것으로 나타났으며, 이 결과는 분리된 균주가 락토바실루스 플란타룸에 속하는 균주라는 것을 의미한다.

No	Carbohydrates	이용	No	Carbohydrates	이용
0	Control	-	25	Esculine	+
1	Glycerol	-	26	Salicine	+
2	Erythritol	-	27	Cellobiose	+
3	D-Arabinose	-	28	Maltose	+
4	L-Arabinose	+	29	Lactose	+
5	Ribose	+	30	Melibiose	+
6	D-Xylose	-	31	Saccharose	+
7	L-Xylose	-	32	Trehalose	+
8	Adonitol	-	33	Inuline	-
9	β-Methyl-xyloside	-	34	Melezitose	+
10	Galactose	+	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Amidon	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogene	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	β-Gentiobiose	+
15	Rhamnose	-	40	D-Turanose	-
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	-	42	D-Tagatose	-
18	Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	Sorbitol	+	44	L-Fucose	-
20	α-Methyl-D-mannoside	+	45	D-Arabitol	-
21	α-Methyl-D-glucoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl glucosamine	+	47	Gluconate	+
23	Amygdaline	+	48	2-Ceto-gluconate	-
24	Arbutine	+	49	5-Ceto-gluconate	-

2) 16s rDNA 유전자 염기서열 결정을 통한 동정

락토바실루스 플란타룸 LP3 균주의 순수 배양액 1 ㎖로부터 Accuprep Gemomic Extraction 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 주형으로 16s rDNA 유전자 부위를 프라이머 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 프라이머 R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-T Easy vector (Promega, USA)에 연결한 후 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 형질전환된 형질전환체는 LB/X-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하여 선별하였다. 선별된 형질전환체로부터 16s rDNA 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 서열결정을 통해 클로닝된 DNA 절편의 염기서열을 결정하여 도 3의 (A)에 나타내었다.

결정된 DNA 염기서열은 DNA Star 프로그램의 Cluster V method를 이용하여 L. plantarum ^T (ATCC 14917)와 유연관계가 높은 균종들과 염기서열의 동일성을 비교함으로써 확인하였다. 그 결과 도 3의 (B)를 통해서 확인되는 바와 같이, 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 L. plantarum ^T(ATCC 14917)와 가장 높은 99.9%의 동일성을 보였다.

또한 16s rDNA 유전자 염기서열들을 이용하여 진화학적 유연관계를 계통수를 통해서 분석한 결과 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 L. plantarum ^T(ATCC 14917)과 동일한 군으로 묶이는 것을 확인하였다(도 3의 c). 따라서 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 유전학적으로도 락토바실루스 플란타룸 종에 속하는 균주임을 확인하였다.

3) RAPD 및 PFGE에 의한 DNA 지문 분석

락토바실루스 플란타룸 LP3 균주로부터 추출한 지놈 DNA를 주형으로 하고 (GTG)₅ (5'- GTGGTGGTGGTGGTG-3') 프라이머를 이용한 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 EtBr에 염색한 후 UV illuminator (G:BOX, SYNGENE, UK)로 관찰하였다 (도 4(a)).

PFGE 분석은 락토바실루스 플란타룸 LP3을 순수 배양하여 최종 흡광도 (OD)가 4가 되도록 하여 플러그(plug)를 제작한 후 여러 제한효소 (SmaI, ApaI, XhoI)로 지놈 DNA를 절단하였다. 절단된 DNA 절편은 전기영동을 실시한 후 대조군인 L. plantarum ^T(ATCC 14917)와 비교 분석하였다 (도 4(b)).

RAPD 또는 PFGE에 의한 DNA 지문 패턴을 분석한 결과, 락토바실루스 플란타룸 LP3와 L. plantarum ^T(ATCC 14917)는 전반적으로 유사한 지문 패턴을 보이나 각 균주 특이적인 밴드가 존재하는 것으로 확인되었다. 따라서 이와 같은 분자 타이핑 분석을 통해서 락토바실루스 플란타룸 LP3은 L. plantarum 종에 속하는 신규한 균주임을 재확인하였다.

이상의 결과들을 토대로 치즈에서 분리한 해당 균주를 락토바실루스 플란타룸 LP3로 명명 하였으며, 2005년 3월 21일로부터 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원, 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10782BP를 부여받았다.

(3) 기능성 및 안정성

3-1. 신규 미생물의 기능성

1) 장 정착성

락토바실루스 플란타룸 LP3의 장 정착성 측정은 L. plantarum ^T (ATCC 14917)를 대조군으로 하여 사람의 대장 상피세포에서 유래한 HT-29 세포주에서 실시하였다. HT-29 세포주에 각 균주들을 1시간 처리한 후 그람 염색과 생균수를 측정함으로써 균주들의 장 정착능을 비교하여 하기 표 5 및 도 5a-5b에 타내었다.

	L. plantarum ^T	L. plantarum LP3	대조군
정착률(%)	80.85	84.93	00.00

장 정착성 측정 결과, 락토바실루스 플란타룸 LP3는 프로바이오틱스 균주로 상업적으로 잘 알려진 L. plantarum ^T(ATCC 14917) 보다 우수한 장 정착성을 보이는 균주임을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 상기 균주가 장 상피세포에 부착하여 장내 환경을 개선할 수 있음을 나타낸다.

3-2. 신규 미생물의 안정성

1) 항생제 내성

분리된 락토바실루스 플란타룸 LP3의 항생제 내성을 측정함으로써 안전성을 검증하였다. 항생제 내성실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용된 항생제는 10종으로 암피실린(AMP), 반코마이신(VAN), 젠타미신(GEN), 카나마이신(KAN), 스트렙토마이신(STM), 에리트로마이신(ERM), 시너시드(Q/D), 클린다마이신(CLM), 테트라사이클린(TET) 및 클로람페니콜(CP)이다.

마이크로플레이트를 37℃하 혐기성 조건하에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 MIC를 가시적인 성장이 관찰되지 않는 최저 항생제 농도로 측정하였다. EFSA 브레이크포인트에 기초하여, 락토바실루스 플란타룸 LP3가 각각의 항생제에 대해서 내성이 있는지 여부를 확인하여 하기 표 6에 나타내었다.

신규한 유산균주인 락토바실루스 플란타룸 LP3는 실험에 사용된 모든 항생제에 대해 EFSA가 제시한 항생제 내성기준 이하로 나타났다. 반코마이신과 스트렙토마이신에 대한 내성은 내성 유전자의 존재에 의한 것이 아니라 락토바실루스 플란타룸의 유산균 균주가 가지는 고유한 특성이므로 EFSA에서는 락토바실루스 플란타룸의 반코마이신과 스트렙토마이신 내성에 대한 자료를 따로 요구하지 않는다. 따라서 락토바실루스 플란타룸 LP3 균주는 항생제 내성에 대한 우려가 없는 안전한 균주인 것으로 나타났다.

항생제	MIC of LP3	EFSA breakpoint (mg/L)
Ampicilin (AMP)	2	2
Vancomycin (VAN)	256	n.r
Gentamycin (GEN)	16	16
Kanamycin (KAN)	64	64
Streptomycin (ST)	256	n.r
Erythromycin (ERM)	1	1
Clindamycin (CM)	1	1
synercid (Q/D)	0.38	4
Tetracycline (TET)	32	32
Chloramphenicol (CP)	8	8
n.r: not required

실험예

1. 아토피 예방/치료용 조성물 제조

(1) 유산균 발효 배지

본 발명의 조성물에 포함되는 유산균 균주의 배양을 위한 발효 배지는 탈지분유와 대두 분리 단백질을 각각 단독 혹은 혼합하여 1%-10% (w/v) 수용액으로 만든 후 유산균종에 따라 단백질 대비 0.01%-1% (w/w) 범위의 단백분해 효소 (Delvolase; DSM, 네덜란드) 용액을 가하여 효소처리하였다.

효소처리 후 상기 효소처리 반응액에 0.1%-5% (w/v) 범위의 포도당, 유당, 과당, 혹은 자당 등의 당류, 0.1%-5% (w/v) 범위의 효모추출물, 0.1%-5% (w/v) 범위의 소이펩톤, 0.01%-0.1% (w/v) 범위의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드의 이온성분을 첨가하고 용해시켜 유산균 배양배지를 준비하였다. 준비된 유산균 배양배지는 열교환기 (Heat exchanger)를 이용하여 살균하였다.

(2) 유산균 배양 및 유산균 원말 제조

상기 (1) 단계에서 준비된 유산균 발효 배지에 전배양한 유산균 종균을 0.1%-1% (v/v) 수준으로 접종하고 37℃, pH 5.0-6.0 범위에서 유지되도록 하여 유산균종에 따라 8시간-18시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 유산균체를 연속식 원심분리기를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.

(3) 유산균 조성물의 제조

상기 단계(2)에서 제조된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다;

락토바실루스 카제이 LC5 유산균 (1.25X10⁸ CFU/g 이상),

락토바실루스 플란타룸 LP3 유산균 (1.25X10⁸CFU/g 이상),

비피도박테리움 락티스 BL3 비피더스균(1.25X10⁹ CFU/g 이상),

락토바실루스 람노수스 LR5 유산균(1.25X10⁸CFU/g 이상).

본 발명의 조성물을 "듀오락-ATP" 조성물이라 약칭한다. 본 실시예에서는 각 유산균종을 부형제와 함께 혼합하여, 총 생균수는 5x10⁸ CFU가 되도록 제조하였다.

2. 동물 및 실험 디자인

본 실험예에서는 아토피성 피부염이 유발된 6주령의 수컷 NC/Nga 마우스(Shizuoka Laboratory Animal Center (Tokyo, Japan)) 모델에 대하여 각종 유산균 균주와 본 발명의 4 종류의 유산균의 병용 투여 효능을 양성 대조군 및 음성 대조군과 비교 평가하였다. 음성 대조군은 거짓 대조군(sham group)에 해당되는 정상군이고, 양성 대조군은 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(DNCB)(Sigma-Aldrich, USA)에 의해 아토피성 피부염이 유발된 NC/Nga 마우스 그룹이다.

실험 동물들을 실험실에 도착 후 1주일간 환경에 적응시켰고, 이 기간 동안 특별한 증상을 보이지 않는 동물들만 실험에 사용하였다. 적응기간 동안, 동물들은 온도는 섭씨 22±2℃, 상대습도 40~60%, 명/암 사이클은 12시간/12시간에서 사육하였고, 시판되는 설치류 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.

모든 동물 절차 및 실험은 동물실험윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인된 실험동물 사용 및 사육 관리 규정을 준수하여 진행하였다. 마우스는 DNCB 처리 2일전 에테르로 마취하여 가위와 면도기로 털을 면도하였다. 본 실시예에서는 DNCB (1-클로로-2,4-디니트로벤젠)(Sigma-Aldrich, USA)에 대한 민감화 및 반복된 접종으로 아토피성 피부염과 유사한 피부병변을 유발하였다. 구체적으로 도 6에 도시된 바와 같이, 아토피성 피부염을 유발하기 위하여, 쥐를 4주 동안 1%의 DNCB 용액으로 4회 처리하였다. DNCB 용액은 DNCB에 아세톤: 올리브 오일을 3:1의 비율로 첨가하여 제조하였다.

마우스를 6개의 처리 그룹(n=8/그룹)으로 구분하였다: 1x10⁷CFU/day 듀오락-ATP(ATP-L); 1x10⁸CFU/day 듀오락-ATP(ATP-M); 1x10⁹CFU/day 듀오락-ATP(ATP-H); 2.5 mg/kg/day 덱사메타손(DEX); 및 200 ㎕/day의 증류수를 4-10주차에 1일 1회 투여 (도 6 참조). AD에 대한 음성 대조표준으로서, NC/Nga 마우스를 병원균이 없는 특수한 조건(SPF) 하에서 DNCB 처리 없이 유지하였다.

3. 유산균의 경구투여를 통한 항소양 효과의 평가

DNCB로 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 듀오락-ATP를 6주 동안 주당 3회씩 경구투여하였다. 실험기간 동안, 체중은 6주간 1주일에 2회 측정하였다. 스크래치 스코어는 1주일 간격으로 측정하였으며, 하나의 그룹에서 3 마리의 쥐를 무작위로 선택하여 새로운 케이지로 이동시킨 후, 머리, 목, 복부 피부, 위 및 코에 대해서 10분 동안 쥐가 긁은 횟수를 세어 평균값으로 측정하였다. 코, 귀, 및 복부를 뒷발로 긁는 동작을 기록하고, 배와 등 피부를 핥는 동작은 기록하지 않았다. 처리 부위에 대한 소양을 스크래칭 스코어로 평가하였다. 측정값은 평균± SD(n=3)로 표현하였고, 도 7b에서 ＊표시는 P < 0.05를 나타낸다.

피부염에 대한 육안 검사(gross examination)를 시행하여 스크래치 스코어를 측정하였다. 유산균을 실험기간 동안 투여하였을 때, 유산균 또는 유산균의 경구투여에 기인한 스트레스로 인한 체중의 감소는 관찰되지 않았다.

10주간의 각 그룹의 피부 병변의 심각도를 도 7A에 나타내었다. 감작 후 4주까지 각 그룹의 피부 병변은 거의 비슷하였다. 그러나 4주후, 대조군 그룹에서는 듀오락-ATP 그룹과 비교하여 극적인 변화가 일어났다.

각 마우스 그룹에서의 긁기 행동을 도 7b에 나타내었다. 음성 대조군에서 아토피성 피부염의 지표인 스크래치 스코어는, 4주에서 10주 사이에 거의 일정하게 유지되었다. 이와 대조적으로, 스크래치 스코어는 양성 대조군(PC), 및 듀오락-ATP 그룹에서 현저하게 증가하였다: 1x10⁷CFU/day, 1x10⁸CFU/day 및 1x10⁹CFU/day 마우스. 그러나 이 경우에 1x10⁸CFU/day 및 1x10⁹CFU/day 투여한 듀오락-ATP 마우스에서 스크래칭 스코어(각각 25.8±3.2 및 21.2±1.9)는 1x10⁷CFU/day (39.0±1.0) 투여한 듀오락-ATP 마우스에 비해서 낮았다. DEX 처리한 마우스의 긁기(9.8±1.5)는 이 기간 동안에 거의 완전하게 억제되었다(도 7b 참조).

3. 싸이토카인 농도 변화의 생체 외 분석(ex-vivo assay)

DNCB-유도 아토피 피부염(AD) 이후의 면역반응을 IFN-감마, IgE, 및 IL-4, IL-5, 및 IL-12의 농도를 측정하여 모니터링하였다. 각각의 처리 그룹으로부터 수득한 16주령 마우스로부터 전혈(whole blood)을 수득하였다. 전혈을 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 회수하고, 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다. 싸이토카인 농도는 마우스 싸이토카인용 검출 키트를 이용하여 ELISA에 의해 측정하였다.

단클론 항-마우스 항체를 PBS로 1:250으로 희석하여, 면역플레이트(Nunc, Denmark)에 넣고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세정 버퍼(0.05% Tween-20 함유 PBS)로 3회 세정한 후, 10% 우태아혈청을 포함하는 PBS 200 ㎕를 각 웰이 첨가하였다. 이어서 시료들을 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 버퍼로 플레이트를 3회 세정하였다. 혈청 시료들(100 ㎕)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 시료들을 각각의 타입의 싸이토카인에 대해서 10% 우태아혈청을 포함하는 PBS로 희석하였다. 플레이트를 3회 세정한 후, 100 ㎕의 스텝트아비딘-고추냉이 과산화수소-컨쥬게이트 검출 항체(SAv-HRP; BD Biosciences)를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 실온에 1시간 두었다가, 5회 세정하고, 100 ㎕의 기질 용액(0.1M 시트르산, 0.2 M Na₂HPO₄, o-페닐렌디아민 및 H₂O₂; BD Biosciences)을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 실온에서 20분간 반응이 진행되도록 놓아두고, 중지 용액(50 ㎕의 2N H₂SO₄; BD Biosciences)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이어서 각 웰 내의 흡광도를 450 nm 파장에서 ELISA 리더(Bio-Rad Laboratories, USA)로 측정하여, 그 결과를 도 8a 내지 도 9b에 나타내었다.

IgE 농도의 증가는 아토피성 피부염의 공통된 인디케이터이다. 도 8a를 참고하면, 10주차에, 가용성 혈청 IgE 농도는 듀오락-ATP 처리군에서 현저하게 감소되었다. 양상 대조군 그룹에서, IgE 농도는 30382±1731 ng/mL이었던데 비해서, 듀오락-ATP 처리군에서의 IgE의 농도는 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day 처리 군에서 각각 16652±430, 1565±247 및 1393±125 ng/mL이었다. 아토피성 피부염이 없는 아토피 NC/Nga의 음성 대조군에서 혈청내 IgE 농도는 155±38 ng/mL로 훨씬 낮았다. 이러한 결과를 함께 고려하면, 이러한 결과는 IgE 농도 증가가 아토피성 피부염에 의한 피부 병변과 연관이 있다는 것을 시사한다. 듀오락-ATP의 처리는 IgE 생성을 억제하고, 이것이 아토피성 피부염의 피부 병변을 감소시킨다. 따라서 듀오락-ATP는 IgE의 하향 조절과 동시에 아토피성 피부염-유사 증상들을 완화시킨다.

Th2 면역 반응을 나타내는 IL-4, 및 IL-5의 농도를 16주령 NC/Nga 마우스로부터 분리된 혈청에서 측정하였다. 양성 대조군 마우스에서 IL-4, 및 IL-5의 농도는 23.8±0.8 pg/mL이었다가, 듀오락-ATP를 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day 처리했을 때, 각각 15.9±0.8, 15.2±2.0 및 15.2±0.5 pg/mL로 감소되었다. 듀오락-ATP 처리 마우스에서의 이러한 농도는 음성 대조군 마우스에서의 농도와 유사한 것이다(도 8b). 이러한 결과는 듀오락-ATP 처리시 혈청 IgE 및 IL-4 농도의 감소를 초래한다는 것을 보여준다.

양성 대조군 마우스에서 IL-5 혈청농도는 72.9±14.1 pg/mL이었는데, 듀오락-ATP를 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day로 처리할 경우 각각, 39.8±10.4, 27.1±2.8 및 25.8±0.9 pg/mL 로 감소되었다(도 8c). 이러한 결과는 듀오락-ATP 처리 시 혈청 IgE 및 IL-5 농도의 감소를 초래한다는 것을 보여준다(도 8a 및 8b).

전체적으로, 생체 내 실험에서 듀오락-ATP를 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day 투여 시가 1x10⁷ CFU/day 투여한 경우에 비하여, 아토피성 피부염-유사 피부병변에 더욱 효과적이었다. 덱사메타손(DEX)은 싸이토카인 생성에 있어서 듀오락-ATP 투여 시와 유사한 패턴을 초래하였다(도 8a-c). IL-4, IL-5 및 IgE 농도는 각각 14.4±2.3 pg/mL, 32.5±2.7 pg/mL 및 698±89 ng/mL로 나타났다.

4. 듀오락-ATP의 투여로 인한 IL-12p40, 및 IFN-γ의 상향 조절

마크로파지에서 주로 생성되는 IL-12는 ThO 림프구를 Th1 림프구로 분화 유도하고, Th1 림프구에서 생성되는 IFN-γ는 마크로파지를 활성화시킬 뿐만 아니라 Th2 림프구의 분화와 활성을 억제한다. 따라서 본 발명에 따른 유산균 조성물이 마크로파지 및 수상세포의 IL-12p40, 및 IFN-γ의 증가에 미치는 영향을 평가하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

본 실시예에서 측정 데이터는 Graphpad Prism^TM 5.0으로 처리하여 그룹의 통계학적 파라미터 및 평균과 표준오차를 계산하여 다른 그룹과 비교하였다. ANOVA를 사용하여 유의성(significance)을 결정하였다(P〈0.05).

양성 대조군 마우스에서 IL-12p40 혈청 농도는 1056±489 pg/mL로 측정되었는데, 듀오락-ATP를 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day로 처리할 경우, 각각 2681±566, 2205±441 및 1981±66 pg/mL로 증가하였다(도 9a). 이와 대조적으로, 덱사메타손 처리 그룹에서는 IL-12p40 혈청 농도를 264±94 pg/mL로 감소시켜, 양성 대조군과 현격한 차이를 보였다. 또한 양성 대조군 마우스에 비해서, IFN-γ 농도 153±4 pg/mL는, 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day의 듀오락-ATP 투여 시, 175±5, 191±12 및 201±22 pg/mL로 증가하였다(도 9B).

이러한 데이터를 종합해 보면, 듀오락-ATP 처리가 혈청 IL-12p40 및 IFN-γ 농도의 증가를 초래하는 것을 보여준다. 이러한 결과들은 1x10⁷ CFU/day, 1x10⁸ CFU/day 및 1x10⁹ CFU/day의 듀오락-ATP가 아토피성 피부염-유사 피부 병변을 감소시키는데 매우 효과적임을 입증한다. 덱사메타손(DEX) 처리 그룹에서 IFN-γ농도는 듀오락-ATP 투여 시와 유사한 패턴을 초래하였다(도 9b). IFN-γ 농도는 168±4 pg/mL로 나타났다.

5. 유산균의 경구투여 후의 조직병리학 검사

아토피 피부염에서는 반복되는 염증 반응에 따라 피부의 두께가 증가하고 림프구, 단핵구, 에오시노필, 비만세포 등 주요 면역세포가 조직 내로 많이 침윤하여 염증 반응을 일으킬 뿐만 아니라 신경 섬유가 비정상적으로 표피층까지 확장되어 가려움증이 유발되는 것으로 알려져 있다. 따라서 아토피 유발 마우스의 피부를 적출하여 상기 면역세포 및 신경세포의 수를 카운팅하고 관찰하였다.

아토피성 피부염 환자에서 전형적으로 나타나는 비대증과 각막비후증이 나타나도록 양성 대조군인 NC/Nga 마우스에 DNCB에 의해서 아토피성 피부염을 일으켰다(도 10A 참조).

조직병리학적 검사를 위한 피부 샘플을 준비하기 위하여, DNCB-유도 아토피성 피부염을 갖는 마우스의 피부조직을 절단하여 4%의 파라포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에 고정시켰다. 파라핀에 고정된 피부 단면들을 가열하여 녹인 후, 자일렌에 담가서 파라핀을 제거하고, 에탄올(70%, 80%, 90%, 100%)을 이용하여 재수화한 후 증류수로 세정하였다.

등 피부들을 4 μm의 절편으로 절단하여 헤마톡실린-에오신(H&E) 또는 톨루이딘 블루(Sigma-Aldrich)로 염색한 후, 광 현미경(Leica Microsystems, Germany)으로 관찰하였다. 서로 상이한 세 개의 현미경 상의 필드에 대해서 비만 세포를 계수하였고, 단위 면적(n/㎟)의 등 피부당 비만세포의 수를 계산하여, 그 결과를 도 10a, 도 10b 및 도 11에 나타내었다.

도 10a에 도시된 바와 같이, 듀오락-ATP를 경구투여한 NC/Nga 마우스에서 표피종(acanthosis)이 명백하게 억제되었다. 이러한 결과는 듀오락-ATP가 DNCB-유도 NC/Nga 마우스에서 피부 비대증을 개선한다는 것을 입증한다.

도 10b를 참조하면, 양성 대조군은 듀오락-ATP 처리 그룹에 비해서, 톨루이딘 블루 염색한 등 피부 분절들은 상피층 내의 비만세포들의 침윤과 탈과립을 분명하게 나타내었다. 도 10c는 피부 병변 부위에서의 비만세포의 수를 나타낸 것이다. 평방 밀리미터당 비만 세포의 수는 양성 대조군, 듀오락-ATP-L, 듀오락-ATP-M, 듀오락-ATP-H 및 DEX 그룹에서 각각 57.7±3.5, 27.7±2.1, 18.0±2.0, 14.3±0.2 및 9.7±0.6로 측정되었다. 10주차에 듀오락-ATP 그룹 및 덱사메타손(DEX) 그룹에서 비만세포의 수는 양상 대조군에 비해서 52.0%, 68.8%, 75.1%, 및 83.2% 만큼 감소되었다. 이러한 결과들은 복강 내 듀오락-ATP가 NC/Nga 마우스에서 비만세포의 침윤을 줄여서 DNCB-유도 아토피성 피부염-유사 피부 병변을 억제한다는 것을 입증한다.

흥미롭게 DEX를 투여한 마우스의 피부 병변은 듀오락-ATP 그룹 보다 깨끗하였다. DEX의 효과는 스크래칭 스코어, IgE 및 Th2 농도 및 조직학적 실험에서 확인되었다. 그러나 덱사마이신 투여한 그룹의 경우, 도 12에서 확인되는 바와 같이 체중은 정상 상태로 회복되지 않았다. 즉, 아토피성 피부염은 치료되었지만, 몸은 정상 상태로 회복되지 않았다는 것을 가리킨다. 스테로이드 계통의 약물들은 효과는 좋지만 많은 부작용을 수반하여 가능하면 응급의 경우에만 사용하는 것이 바람직하다. 이에 비해서 본 발명의 듀오락-ATP 그룹은 이러한 부작용이 없어서, Th1과 Th2 사이의 불균형을 복원하고 면역 기능을 강화시켜 안전하게 사용할 수 있다.

아직까지 아토피성 피부염의 병인론이 명확하게 밝혀지지 않았으나, 전형적인 아토피성 피부염 증상들은 Th2-매개 싸이토카인의 농도 증가 및 Th1-유래 싸이토카인 농도 감소와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 이상의 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 듀오락-ATP는 Th1-매개 싸이토카인들의 분비는 증가시키고 Th2-매기 싸이토카인들의 분비는 감소시켜서 손상된 Th1과 Th2 사이의 균형을 복원시킬 수 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 듀오락-ATP를 경구 투여할 경우, 아토피성 피부염으로 인한 피부 병변의 발생을 억제하였다. 대조군에서는 심각한 출혈, 피부비후증, 및 피부벗겨짐과 같은 피부 병변이 나타났으나, 듀오락-ATP는 이러한 피부 변화를 억제하였다. 또한 듀오락-ATP 투여는 조직학적으로 피부에서 비대, 각화증, 염증 세포의 침윤을 감소시켰다. 이러한 결과는 듀오락-ATP가 부작용의 위험을 최소화하면서 다양한 알레르기 질환의 치료를 위한 천연의 안전한 치료제의 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.

한국생명공학연구원

KCTC12398BP

20130411

한국생명공학연구원

KCTC10782BP

20050321

한국생명공학연구원

KCTC12202BP

20120507

한국생명공학연구원

KCTC11904BP

20120507

Claims

락토바실러스 카제이 LC5 (Lactobacillus casei LC5) (KCTC 12398BP), 2) 락토바실루스 플란타룸 LP3(Lactobacillus plantarum LP3 (KCTC 10782BP)), 3) 락토바실루스 람노수스 LR5 (Lactobacillus rhamnosus LR5(KCTC 12202BP)), 및 4) 비피도박테리움 애니말리스 락티스 BL3 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL3 (KCTC 11904BP)) 또는 이들의 배양물을 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 유산균 혼합물을 10⁸ 내지 10¹² CFU/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 속 유산균 및 비피도박테리움속 유산균을 2:1 ~ 10:1의 생균수 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 4종의 유산균을 동일한 생균수 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 유산균 균주들을 동결건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 아토피 예방 또는 치료용 조성물.
제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 유산균 함유 아토피 예방 또는 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 약품.
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