WO2016167489A1 - 질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 - Google Patents

질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 Download PDF

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vaginitis
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고광표
유현주
권보미
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention includes a strain of Lactobacillus CL ac t 0 ⁇ CZ 7 / z ⁇ ) genus having an activity of inhibiting the proliferation of pathogenic microorganisms in the vagina, a proliferation inhibitor of intravaginal pathogenic microorganisms containing the same as an active ingredient, and the inhibitor
  • the present invention relates to a product for improving, preventing or treating vaginitis. More specifically, the vaginal pathogenic microorganisms include fungi, bacteria, and viruses, and specific examples include Candida spp. And Gardnerella ( ⁇ r ⁇ ere // fl).
  • the present invention relates to a novel Lactobacillus genus strain having a proliferation inhibitory effect on a genus strain or Snichia strain, and a pharmaceutical composition, health functional food or cleaning product containing the same as an active ingredient. [Technique to become background of invention]
  • Women's vaginal microbial community is a major factor in maintaining vaginal health, where a variety of bacteria, yeasts and other microorganisms coexist in balance. Healthy vagina
  • the dominant species of the flora is Lactobacillus lactobacillus, which is known to inhibit various pathogens causing vaginitis and female diseases by performing functions such as maintaining vaginal acidity, generating hydrogen peroxide, and activating the mucosal immune system.
  • the present invention screened the inhibitory activity of vaginal pathogenic microorganisms in 190 Lactobacillus strains isolated from healthy women, and the inhibitory activity against Snichia spp. Reported as a microbiological marker of HPV infection and the causative agent causing vaginitis.
  • Lactobacillus strains we have identified probiotic Lactobacillus strains with new activity and have a comprehensive inhibitory effect on the development of vaginitis.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease related to proliferation of pathogenic microorganisms in the vagina containing the strain of the genus Lactobacillus as an active ingredient.
  • lactobacillus characterized in that it has an activity of inhibiting the growth of pathogenic microorganisms in the vagina It is related to the genus strain.
  • the strain Lactobacillus is isolated from the vaginal flora of healthy women, for example, Lactobacillus crispatus (acto1 ⁇ 2 // i «cr ⁇ at3 ⁇ 4s) SNUV220, Lactobacillus fermentum (acto ⁇ 7 / i « / erme wm) SNUV175, Lactobacillus
  • Lactobacillus jensenii SNUV360, and Lactobacillus gasseri SNUV281 may be one or more Lactobacillus strains selected from the group consisting of.
  • the vaginal pathogenic microorganism may be one or more selected from the group consisting of fungi, bacteria, and viruses, for example, strains of the genus Ca 3 ⁇ 4, which is a causative agent of candida vaginitis, and sniches associated with the development of bacterial vaginosis ( Sneat a) may be one or more selected from the group consisting of the genus strain, the genus Gardnerella (Gart ⁇ re // a) strain of the vaginitis pathogen, and the human papilloma virus associated with HPV infection, the strain of the genus Lactobacillus May be used to prevent and / or treat female vaginitis by showing a proliferation inhibitory effect on each or simultaneously thereof.
  • the strain of the genus Snichia is snichia sni eat a i iO or snichia
  • It may be a raw guineagen (eat / n ' a mgw ⁇ egera), but is not limited thereto.
  • the acid resistance of the strain was determined based on the change in growth rate when incubated in acidic liquid medium at pH 2 and pH 3 for 24 hours, and the bile resistance was 0.1% to 4% (w / v) of liquid medium containing bile salts. It can be determined based on the change in growth rate during incubation for 24 hours.
  • the strain of the genus Lactobacillus may exhibit a survival rate of 50% or more at a concentration of 0.1% (w / v) bile salt, but is not limited thereto.
  • Another example of the present invention is a proliferation inhibitor of a vaginitis pathogen containing a Lactobacillus strain as an active ingredient, a pharmaceutical composition for treating and / or preventing vaginitis including the inhibitor, improving vaginitis, and treating and / or preventing food A composition or cleaning product.
  • the strains of the genus Lactobacillus are Lactobacillus crispatus (£ acto6ad // 3 ⁇ 4y crispatus), Lactobacillus permentum (acto? A7 / 1 ⁇ 2y / erwe «tww), Lactobacillus
  • the strain is Lactobacillus crispatus CLacto ⁇ c /// ⁇ cr at) with accession number KCTC 18374P) SNUV220, Lactobacillus fur with accession number KCTC18371P Lactobacillus zenseni with SNUV175, accession number KCTC18372P 8 ⁇ 360, and accession number
  • Lactobacillus gasteria CLCto6a 7 / iw garaeri) having KCTC 18375P) SNUV281 may be at least one Lactobacillus strain selected from the group consisting of.
  • strains were deposited on April 7, 2015 and April 9, 2015 in the microbial resource center located in Yuseong-gu, Daejeon Metropolitan City received a deposit number.
  • Proliferative inhibitors of vaginitis pathogens containing the Lactobacillus strain according to the present invention as an active ingredient exhibit antiviral activity, antifungal activity against fungal pathogens, and antibacterial activity against bacteria.
  • Candida (Ca // a) strain, Gardnerella (Ga "ere / / a) strain and Sniche (S" eat a) may be due to one or more strains selected from the group consisting of strains.
  • the strain of the genus Candida may be Candida albicans ( ⁇ « ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ), but is not limited thereto.
  • the genus Gardnerella strain may be Gardnerella varnalis (Gflr ⁇ ere / / a vag «afc), but is not limited thereto.
  • the strain of the genus Snichia is snichia amni (S «eat a am 7) or snichia
  • compositions according to the invention can be administered to a mammal, including humans, by various routes.
  • the mode of administration may be any of the methods commonly used, and may be administered by, for example, oral, skin, vein, muscle, subcutaneous, etc.
  • compositions of the present invention may be prepared in the form of powders, granules, tablets, capsules, ointments, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, or the like, or transdermal, suppository, and sterile injectable solutions according to a conventional method. It may be used by formulating it into a parenteral formulation and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is pharmaceutically suitable and physiologically
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, xylly, erythris, malty, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water,
  • Methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil are mentioned.
  • diluents or excipients such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants may be used .
  • Pharmaceutical compositions for the prevention and / or treatment of vaginitis are mentioned.
  • topical dosages such as liquids, gels, cleaning compositions, intravaginal tablets, suppository forms, creams, ointments, dressing solutions, sprays, and other coatings, solution forms, suspensions
  • a liquid formulation such as an emulsion
  • the formulation may be prepared by, for example, adding a dissolution aid, emulsifier, a complete layer for controlling ⁇ and the like in sterile water.
  • non-aqueous solvent or the suspension solvent propylene glycol, Polyethylene glycol, vegetable oils such as rive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone, but is generally selected in consideration of the mode of administration and standard pharmaceutical practice. It can be administered in combination with a carrier.
  • Lactobacillus strain-containing compositions of the present invention may be in the form of tablets containing starch or lactose, or in the form of capsules containing single or excipients, or elixirs containing chemicals that flavor or color. Or in suspension, orally, orally or sublingually.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the strain of the genus Lactobacillus of the present invention may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient. Administration may be from one to several divided doses.
  • the daily dosage may be 0.1 to 500 mg / kg, preferably 0.5 to 300 mg / kg, based on the active ingredient content.
  • the above dosages are illustrative of the average case and may be high or low depending on individual differences. If the daily dose of the mixed extract containing the composition of the present invention is less than the dose, a significant effect cannot be obtained, and if it exceeds the above, it is uneconomical and out of the range of the normal dose, so there is a concern that undesirable side effects may occur. Since it may occur, it is preferable to set the above range.
  • Another embodiment of the present invention provides a nutraceutical improvement, treatment and / or prevention health functional food containing a strain of the genus Lactobacillus as an active ingredient.
  • the health functional food may be various beverages, fermented milk, food additives, and the like.
  • the strain Lactobacillus is as described above.
  • the content of the active ingredient as a Lactobacillus sp contained in the health functional food is not appropriately particular restriction depending on the type of food, a desired purpose, for example, may be added in an amount of 0.01 to 15 parts by weight 0/0 of the total food weight
  • the health beverage composition may be added at a ratio of 02 to 10 g, preferably 0.3 to lg, based on 100 1.
  • the beverage is an essential ingredient at the indicated ratio.
  • the liquid component may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in general beverages.
  • natural carbohydrates are monosaccharides, for example, disaccharides such as glucose, fructose and the like, for example maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as textine, cyclodextrin and the like.
  • Phosphorous sugars and sugars such as Xyl, sorbide, and erythr.
  • Natural flavors tauumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthesis as flavoring agents other than those mentioned above
  • Flavored crabs can be used advantageously.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ⁇ of the composition of the present invention.
  • Flavoring agents such as minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, ⁇ modifiers, stable It may contain a topical agent, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agent used in the carbonated beverage and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain natural fruit juice and fruit flesh for producing fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination.
  • the proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the health functional food of the present invention.
  • Another example of the present invention is Lactobacillus strains as an active ingredient
  • the cleaning product may be a solidifying equipment soap, a hand washing crab, a liquid shampoo, a liquid soap, a liquid rinse, a body cleaner, a creamy soap, or the like.
  • the strain Lactobacillus is as described above.
  • the cleaning product may further comprise a carrier for formulating it.
  • the carrier may be a binder, a suspending agent, a suspending agent, a solubilizer, a loosening agent, a preservative, a lubricant, an isotonic agent, a mold crab, a stabilizer, a dispersant, a suspending agent, a dye, a fragrance, and the like.
  • the present invention is human papilloma
  • 1 is a graph showing the results of measuring the bile resistance by checking the growth rate after culture for 24 hours in a medium containing 0.1% to 4% (w / v) bile salt according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a Lactobacillus fermentum (acto0ad / / ⁇ fermentum) SNUV175 strain and Lactobacillus genseni in accordance with an embodiment of the present invention It is a representative figure for the antibiotic resistance measurement result about nine antibiotics of SNUV360 strain.
  • Figure 3 shows four Lactobacillus strains according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 shows four Lactobacillus strains according to an embodiment of the present invention
  • PCoA principal component analysis
  • Figure 5 shows four Lactobacillus strains according to an embodiment of the present invention
  • Swab samples were transferred to our laboratory in the form of storage for storage within 4 hours after obtaining them in modified Liquid Amies solution and immediately used for strain isolation. Samples were serially diluted from 10-1 to 10-8 times and plated on three kinds of media, Chocolate agar, Rogosa agar and Columbia agar, and then incubated for 48 hours in 37, anaerobic conditions. After incubation, purely isolated colonies were randomly selected and shaken in a brain heart infusion (BHI) liquid medium containing 5% human serum. Genomic DNA was extracted from the cells and UnivFwd (5 ') was used for typing 16S ribosomal RNA genes.
  • BHI brain heart infusion
  • PCR reaction was performed using AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ') primer and UnivRev (5'- GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer. PCR reactions were purified using a QIAquick PCR purification kit, and then sequenced using an ABI3711 automatic sequencer.
  • SNUV220 1 crispat s TGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACC DD11D1DDVIDDI0
  • VV11IV10O0VDI1ODV1VD11O1DVV1OVOVD1VIODVDVV snij Dqojooj 9VV9VVV ⁇ ⁇ D ⁇ ⁇ 0 ⁇ 3 ⁇ ⁇ £ X1K) £) £) £) £) :) ⁇ ⁇ ⁇ E> () £) VVi) VVD
  • VDVVDlDVi lC> 3D3:) 03VV30V () 0 ⁇ VD ⁇ :) ⁇ E> VV:) iX) VOO ⁇ V
  • glycerol (16% v / v) was added to the broths reached to the exponent to make stock and stored at -80 ° C. Anaerobic for cell culture preparation for evaluation of inhibitory activity of vaginitis pathogens of each strain
  • Example 1 Each Lactobacillus strain isolated in Example 1 was cultured at 37 ° C for 20 hours using MRS liquid medium (Difco, USA) was used for the test, the strains of the genus Snichia and Gardnerella pannalisis NYCm After inoculation into the liquid medium was used for the test by anaerobic incubation for 48 hours or 24 hours at 37 ° C respectively.
  • MRS liquid medium Difco, USA
  • the strains of the genus Snitchia used in the experiments were Srteat a aw strains reported at the Virginia Commonwealth University School of Medicine and reported in the paper. Two snicheia guineagens (S «eflt / ⁇ « g? Egmy) were used. Gardnetella pannalis strains used in the experiment was used KCTC5096 strain was sold from the KCTC microbial resource center.
  • Inhibitory activity was expressed as the diameter of the clear ring, in which the growth of the strain was inhibited around the disk (mm). Disk inhibition assay was performed on the strains of the genus Snichia and Gardnerella pannalis strains of the isolated Lactobacillus cell culture, and the results are shown in Table 4 below.
  • Lactobacillus gasseri SNUV445 As can be seen in Table 4, the inhibitory ring size of the Lactobacillus culture medium showed a slight difference with respect to the type of inhibitory strain, but inhibited the growth of Snichia and Gardnerella strains simultaneously.
  • Four isolates of Lactobacillus isolates namely Lactobacilhis crispatus SNUV220, Lactobacillus fermentum SNUV175, Lactobacillus jensenii SNUV360, Lactobacillus gasseri ⁇ 0 ⁇ 7 / ⁇ ⁇ /) 8 1 ⁇ 281 was selected.
  • Lactobacillus genseni (a o6ac // w ' erae 7) SNUV360 strain showed high inhibitory effects on both snichia and gardnerella.
  • Example 3 Candida albicans Inhibitory Activity of Lactobacillus Isolates
  • Candida albicans (Ca «i fo a / ⁇ to confirm the inhibitory activity against the Candida albicans (Ca fo aa / s) strain, the causative agent of Candida vaginitis of the four types of Lactobacillus screened in Example 2 cara) ATCC44858 strain (Americal Type Culture Collection), which has been proven to induce vaginitis in animal experiments
  • MYA4788 strain (Americal Type Culture Collection) was selected as the target strain for the selection of inhibitory functional strains.
  • Candida strain it was evaluated by using a 96 well diffusion test. For the experiment, put 100 ul of Candida albicans ATCC44858 strain (or Candida albicans M4788) in 96 well of lOOul YM medium and lOOul lactobacillus cell culture, and then incubate at 37 ° C for 24 hours. The absorbance was measured at 600 nm for the proliferation of isolated Candida bacteria and the results are shown in Table 5. Table 5
  • Lactobacillus gasseri SNUV281 0.012 0.010 As can be seen in Table 5 above, the selected Lactobacillus
  • Lactobacillus crispatus SNUV220, Lactobacillus fermentum SNUV 175, Lactobacillus jensenii Lactobacillus jensenii SNUV360, Lactobacillus jensenii (£ acto6a 7 / ⁇ gimerO SNUV281 are all close to 100% for Candida. It was confirmed that the killing ability, and thus all four isolated strains can have a great effect on the prevention of yeast infection Example 4. Hydrogen peroxide generating activity of Lactobacillus
  • TMB medium was prepared as shown in Table 6 (medium composition per 1L).
  • Lactobacillus crispatus (acto6ac /// i «cr 3 ⁇ 4oati «) SNUV220, Lactobacillus
  • the acid resistance of the strains was compared with the growth rate under basic liquid medium conditions of pH 6.7 when grown at 37 ° C for 24 hours in acidic liquid medium prepared by titrating MRS liquid medium (pH 6/7) to pH 2 and pH 3. And the results are shown in Table 8 below.
  • antibiotic resistance of a novel strain of Lactobacillus sp. which has a pathogenic microbial growth inhibitory activity.
  • EFSA standard which is an international standard for antibiotic resistance of microorganisms added to animal feed.
  • CHR chloramphenicol
  • CLM clindamycin
  • ERY erythromycin
  • GEN gentamycin
  • KAN kanamycin
  • STR streptomycin
  • VAN vancomycin
  • the test method used for the evaluation of antibiotic resistance was performed according to ISO 10932: 2010 (IDF 223: 2010), an SOP standard for testing antibiotic resistance of lactic acid bacteria, and LSM-broth (90% IsoSensitest- and 10% MRS-broth; Oxoid) was inoculated with each Lactobacillus strain at ⁇ 6> ⁇ 10 6 CFU / mL, followed by MIC test strip for each antibiotic.
  • beta estradiol (beta-esteradiol 3-benzonate) was intraperitoneally administered to BALB / c mice to induce hormonal regulation and estrous cycle, and 3 days later, the pathogen Gardnerella vaginalis (Gar ⁇ ere)
  • the vaginitis animal model was established by directly injecting // a vag / "afc) into the vagina at lxl 0 7 CFU.
  • vaginal Lactobacillus isolates corresponding to 10 8 to 10 9 CFU were then intravaginally administered (7 per group).
  • total DNA was extracted from vaginal specimens washed with 0.1 mL of PBS (Phosphate Buffered Saline) in the vagina to measure micronasal cluster analysis and relative abundance of Gardnerella pannalis.
  • DNA extraction from vaginal samples was performed using Mobio PowerSoil DNA extraction kit, PCR amplification using primers corresponding to V4 region of 16S rDNA for cluster analysis, and next-generation genome sequence analysis using Illumina Miseq equipment. .
  • Gardnerella barnacles treated group Lactobacillus after Gardnerella infection
  • Lactobacillus of the present invention Chris ⁇ tooth (Lactobac us crispatus) SNUV220 hakto Bacillus Zen Senigallia Lactobacillus jensenii) SNUV360, Lactobacillus peomen SNUV175, Lactobacillus gasteria (£ ⁇ 0 ⁇ // ⁇ ⁇ 08 1; ⁇ 281 strain is gardenetella

Abstract

본 발명은 질염 병원균 증식 억제 활성을 지닌 신규의 락토바실러스 속 분리균주, 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능식품, 및 세정제품에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 인.유두종 바이러스 (HPV) 감염 및 세균성 질염의 발병과 관련된 스니치아 속 (Sneathia spp.) 병원균, 질염 병원균인 가드네텔라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 칸디다성 질염의 원인균인 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에 대한 증식 억제 효과 및 질 내 균총의 회복과 유지 효과를 나타내어 여성 질염의 예방과 치료에 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
질 내 병원성 미생물에 대한 증식억제활성을 갖는 락토바실러스 속 균주 【기술분야】
본 발명은 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 갖는 락토바실러스 CLact0^CZ7/z^) 속 균주, 이를 유효성분으로 함유하는 질 내 병원성 미생물의 증식 억제제, 및 상기 억제제를 포함하는 질염의 개선, 예방 또는 치료 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 질 내 병원성 미생물은 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하며 , 구체적인 예로는 칸디다 속 균주, 가드너렐라 (< r^ere//fl) 속 균주 또는 스니치아 (S eat a) 속 균주 등에 대한 증식 억제 효과를 갖는 신규한 락토바실러스 속 균주, 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능식품 또는 세정제품에 관한 것이다. 【발명의 배경이 되는 기술】
전 세계적으로 여성 인구의 3/4이 살아가면서 세균성 질염을 포함한 염증성 여성 질환의 감염을 겪으며 , 이 중 50%는 재발을 경험하는 것으로 보고된다. 또한, 여성 질염의 60% 이상이 무증상 감염에 해당하며, 항생제， 스트레스, 폐경기 이후의 호르몬 변화 등을 겪으며 질염에 대한 감수성이 크게 증가하게 된다.
감염에 의한 질염은 크게 3가지 주요 원인으로 나뉘는데， 세균성 질염 (Bacterial vaginosis, BV), 칸디다증 (Candida vaginitis, CV), 트리코모나스 질염 (Trichomonas vaginalis)이다. 이 중 세균성 질염은 최근 가장 흔한 질염으로 인식되고 있으며， 세균성 질염 환자로부터 분리한 질 분비물에서는 Atop^him vaginae, Megasphaera 속, Gardnerella vaginalis, Eggerthella 속，
Figure imgf000003_0001
속, Prevotella bivia, Peptostreptococcus micros 등이 발견된 것으로 보고된 바 있으며 , 특히 가드너렐라 바지날리스 (Garc/"ere//a vagz 7afc)는 세균성 질염의 주요 원인균으로 알려져 있다.
여성의 질 내 미생물 군집은 질 내 건강을 유지시키는 주요한 요인으로, 다양한 세균, 효모 및 기타 미생물이 균형을 이루며 공존하고 있다. 건강한 질 내 균총의 우점종은 락토바실러스 유산균으로 질 내 산성도 유지와 과산화수소 생성， 점막 면역계의 활성화 등의 기능을 수행함으로써, 질염을 비롯한 여성 질환을 일으키는 다양한 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다.
항생제를 통한 기존의 질염 치료는 재발률의 증가， 락토바실러스 균총의 동반 감소， 가드네렐라 및 칸디다 이외의 기타 항생제 내성 균주로 인한 염증의 발생 등 다양한 부작용을 수반하므로 프로바이오틱 락토바실러스 유산균올 활용한 질염 병원균의 증식 억제 및 질 내 균총 회복의 중요성이 부각되었다. 현재까지 보고된 질염의 원인균으로 대표적인 것은 가드네렐라
바지날리스와 칸디다 알비칸스 등이 대표적이나， 최근 스니치아 속 균주가 인유두종 바이러스의 감염에 밀접한 연관이 있으며 더불어 교란된 질 내
균총에서 질염의 병원균으로도 작용할 수 있음이 보고되었다ᅳ 이에 기존에 알려진 질염 병원균 외에 스니치아 속 병원균의 성장 억제능을 가진 락토바실러스 유산균의 발굴이 필요한 실정이다. 【발명의 내용]
【해결하고자 하는 과제】
본 발명은 건강한 여성에서 분리된 락토바실러스 균주 190종을 대상으로 질 내 병원성 미생물의 억제 활성을 스크리닝하였으며, 인유두종 바이러스 감염의 미생물학적 마커 및 질염 유발 원인균으로 보고된 스니치아 속 균주에 대한 억제 활성을 가진 락토바실러스 균주의 탐색을 통해 신규 활성을 지닌 프로바이오틱 락토바실러스 균주를 발굴하고 질염 발생에 대한 포괄적인 저해 효과를
확인하였다.
이에， 본 발명의 목적은 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 갖는 락토바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질 내 병원성 미생물의 증식과 관련된 질환, 예컨대 질염 치료 및 /또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 속 균주를 이용하여, 질 내 병원성 미생물의 증식과 관련된 질환을 갖는 환자에 투여하여， 질 내 병원성 미생물의 증식과 관련된 질환을 예방 및 /또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른목적은 상기 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질 내 병원성 미생물의 증식과 관련된 질환, 예컨대 질염 개선, 치료 및 /또는 예방용 건강기능식품 또는 세정제품 등을 제공하는 것이다. 【과제의 해결 수단】
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질 내 병원성 미생물 증식 억제 활성을 지닌 신규의 락토바실러스 속 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능식품 또는 세정제품 등을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 예는 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러
Figure imgf000005_0001
속 균주에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 속 균주는 건강한 여성의 질 내 균총에서 분리된 것이며, 예를 들면, 락토바실러스 크리스파투스 ( acto½ //i« cr^at¾s) SNUV220, 락토바실러스 퍼멘툼 ( acto ^7/i«/erme wm) SNUV175, 락토바실러스
젠세니 (^Lactobacillus jensenii) SNUV360, 및 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri) SNUV281로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스 균주일 수 있다. 상기 질 내 병원성 미생물은 곰팡이, 세균 및 바이러스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어， 칸디다성 질염의 원인균인 칸디다 (Ca ¾) 속 균주, 세균성 질염의 발병과 관련된 스니치아 (Sneat a) 속 균주, 질염 병원균인 가드너렐라 (Gart^re//a) 속 균주, 및 인유두종 바이러스 (HPV) 감염질환과 관련된 인유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 락토바실러스 속 균주는 이들에 대하여 각각 또는 동시에 증식 억제 효과를 나타내어 여성 질염의 예방 및 /또는 치료에 활용될 수 있다.
또한， 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비
Figure imgf000005_0002
a/6/cara)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 가드너렐라 속 균주는 가드너렐라
바지날리스 ( r^ere//a vagi K/fc)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 스니치아 속 균주는 스니치아 암니 eat a i iO 또는 스니치아
생귀네젠스 ( eat/n'a mgw^egera)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 락토바실러스 속 균주는 과산화수소 생성이 활발한 것일 수 있으며， 또한 내산성 및 내담즙성을 가진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 과산화수소 활성은 락토바실러스 배양용 MRS 한천배지에 3,3'， 5,5' -tetramethy lbenzidine (250 mg/L), hemin (5 mg/L), vitamin K (0.5 ug/L)를 첨가한 TMB배지에서 배양 시 암녹색의 색깔 변화를 유도하는 균주를 대상으로 정성적 판별이 가능하다.
균주의 내산성은 pH 2와 pH 3의 산성 액체 배지에서 24시간 동안 배양 시 성장율의 변화를 바탕으로 판별하였으며, 내담즙성은 0.1% 내지 4%(w/v) 에 이르는 담즙산염을 첨가한 액체 배지에서 24시간 동안 배양 시 성장률의 변화를 바탕으로 판별할 수 있다.
상기 락토바실러스 속 균주는 0.1%(w/v) 담즙산염 농도에서 50%이상의 생존율을 나타낸 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 예는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 병원균의 증식 억제제, 상기 억제제를 포함하는 질염 치료 및 /또는 예방용 약학적 조성물， 질염 개선, 치료 및 /또는 예방용 식품 조성물 또는 세정제품에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 크리스파투스 (£acto6ad//¾y crispatus), 락토바실러스 퍼멘툼 ( acto ?a7/½y/erwe«tww), 락토바실러스
^세니
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및 락토바실러스 가세리 gaMerO일 수 있다.
구체적으로, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 18374P를 갖는 락토바실러스 크리스파투스 CLacto^c///^ cr at ) SNUV220, 기탁번호 KCTC18371P를 갖는 락토바실러스 퍼
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SNUV175, 기탁번호 KCTC18372P를 갖는 락토바실러스 젠세니
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8Νυν360, 및 기탁번호
KCTC 18375P를 갖는 락토바실러스 가세리 CLacto6a 7/iw garaeri) SNUV281로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스 균주일 수 있다.
상기 균주들은 대전광역시 유성구에 소재한 미생물자원센터에 2015년 4월 7일과 4월 9일자로 기탁하여 기탁번호를 수여 받았다.
본 발명에 따른 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 병원균의 증식 억제제는 항바이러스 활성, 진균성 병원균에 대한 항진균 활성, 및 세균에 대한 항세균 활성을 나타내는 것으로서, 상기 질염 병원균은
칸디다 (Ca //a) 속 균주, 가드너렐라 (Ga "ere//a) 속 균주 및 스니치아 (S"eat a) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비칸스 (Οϊ«ί¾ ΐ Ω ζ· ^)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 가드너렐라 속 균주는 가드너렐라 바지날리스 (Gflr^ere//a vag «afc)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 스니차아 속 균주는 스니치아 암니 (S«eat a am 7) 또는 스니치아
생귀네젠스 (S«eat a «wgwz j^era)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대， 경구， 피부， 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며,
바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라산제， 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액， 에멀견, 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로
허용되는.담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 회석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스， 솔비를, 만니를, 자일리를, 에리스리를, 말티를, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀를로즈, 메틸 셀를로즈, 미정질 셀를로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물,
메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제, 증량제， 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다 본 발명에 따른 .질염의 예방 및 /또는 치료용 약학적 조성물을
비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔 (gel)제, 세정 조성물, 질 내 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제， 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고， 젤리， 거품, 세척게 또는 질 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔 (gd)제， 세정 조성물, 질 내 삽입용 정제 등의 피부
외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제 , ρΗ 조절을 위한 완층제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 을리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나， 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 흔합되어 투여될 수 있다.
예를 들면， 본 발명의 락토바실러스 속 균주 함유 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 속 균주 함유 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 mg/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 흔합 추출물 함유 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 일 예는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 개선, 치료 및 /또는 예방용 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강 기능성 식품은 각종 음료, 발효유, 식품 첨가제 등일 수 있다. 상기 락토바실러스 속 균주는 상술한 바와 같다.
상기 건강 기능성 식품에 함유된 유효성분으로서의 락토바실러스 속 균주의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량0 /0로 가할 수 있으며， 건강 음료 조성물은 100 1 를 기준으로 으02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 l g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 중 음료에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 락토바실러스 균주를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 텍스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리를, 소르비를, 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 , 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성
향미게 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ^당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민,
광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진게 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산， 보호성 콜로이드 증점제 , ρΗ 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로
함유하는 질염 개선, 치료 및 /또는 예방용 세정제품을 제공한다. 상기 세정제품은 고체화장비누, 손 세정게, 액체샴푸, 액체비누, 액체린스, 바디 세정제, 크림상 비누 등 일 수 있다. 상기 락토바실러스 속 균주는 상술한 바와 같다.
상기 세정제품은 이를 제형화하기 위한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제， 가용화제, 완층제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형게, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다. 【발명의 효과】 본 발명은 질 내 병원성 미생물 증식 억제 활성을 지닌 신규의
락토바실러스 속 균주, 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능식품, 및 세정제품에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 인유두종
바이러스 (HPV) 감염 및 세균성 질염의 발병과 관련된 스니치아 속 (Sweat/z/a spp.) 병원균에 대한 증식 억제능, 질염 병원균인 가드네렐라 바지날리스 (Gan «ere//a vaginalis), 칸디다성 질염의 원인균인 칸디다 알비칸스 ( t fo a/ cara) 등에 대한 증식 억제 효과를 나타내어 여성 질염의 개선, 예방 및 /또는 치료에 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 0.1% 내지 4%(w/v)의 담즙산염이 포함된 배지에서 24시간 배양 후 성장률을 확인하여 내담즙성 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘툼 ( acto0ad//^ fermentum) SNUV175 균주와 락토바실러스 젠세니
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SNUV360 균주의 9종의 항생제에 대한 항생제 저항성 측정 결과에 대한 대표도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 4종의 락토바실러스 균주를
Gardnerella vaginalis 를 감염시킨 생쥐 동물모델에 질 내 투여한 후 마이크로비음 분석을 실시한 결^ ^로, Gardnerella vaginalis 의 상대 함량 (relative abundance)을 투여 그룹별로 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 4종의 락토바실러스 균주를
Gardnerella vaginalis를 감염시킨 생쥐 동물모델에 질 내 투여한 후 마이크로비음 분석을 실시한 결과로, 투여 후 2일째의 질 내 균총 군집 구조의 변화를 나타낸 주성분 분석 (PCoA)그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 4종의 락토바실러스 균주를
Gardnerella vaginalis를 감염시킨 생쥐 동물모델에 질 내 투여한 후 마이크로비음 분석올 실시한 결과로, 각 그룹별 유의적으로 변화된 미생물군을 단변량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】 이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 균주의 분리，및 동정
건강한 여성의 질 내 균총에서 190여 개의 서로 다른 락토바실러스 균주를 분리하였다. 구체적으로， 질 내 균총 분리용 시료는 한국인 쌍둥이 -가족 코호트 연구에 참여한 대상자 중 실험에 동의한 3쌍의 일란성 쌍등이와 어머니를 포함한 9명의 대상자에서 수득하였으며, mid- vaginal의 질 내 swab 시료의 형태로 삼성병원에서 제공받았다 (IRB 번호, 144-2011-07-1 1).
Swab 시료는 modified Liquid Amies solution에 담긴 형태로 수득 후 4시간 안에 넁장 보관의 형태로 본 연구실에 운송되어 즉시 균주 분리에 사용하였다. 시료는 10-1에서 10-8배까지 순차 희석하여 Chocolate agar, Rogosa agar, Columbia agar 세 종류의 배지에 도말한 후, 37, 혐기조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 순수 분리된 집락을 무작위적으로 선발하여 5%의 human serum올 포함한 Brain heart infusion(BHI) 액체 배지에서 진탕배양 하였고， 균체에서 genomic DNA를 추출하여 16S ribosomal RNA 유전자 타이핑을 위해 UnivFwd (5 '-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') primer와 UnivRev (5'- GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer를 이용해 PCR반웅을 실시하였다. PCR 반응물은 QIAquick PCR purification kit를 사용해 정제한 후, ABI3711 automatic sequencer를 이용해 염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과는 하기 표 1 및 2의 서열과 같으며, 이 서열정보를 이용하여 종전 결과보고서의 동정자료와 함께 Genbank의 BLAST 프로그램
(www.ncbi.nkn.nhi. gov)과 ExTaxon database 프로그램 (www.ezbiocloud.net/eztaxon)으로 다중 비교하여 최종적으로 균주의 동정을 완료하였다.
【표 1】
SEQ
Species Name Nucleotide sequence (5'- 3') ID
NO
Lactobacillus TTACTTCGGCAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGG
SNUV220 1 crispat s TGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACC DD11D1DDVIDDI0
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ON
αι
3S
[Z 5]
IT
886Z00/9T0ZaM/X3d 6817 .9Ϊ/9Ϊ0Ζ OAV 【표 3】
그 결과는 표 1 내지 표 3에서 보듯이, 각각 락토바실러스
크리스파투스 (ϋ<3 ο6α '//½5· crispatus), 락토바실러스 퍼멘툼 (ί<β ο6α<:///ϊ"· fermentum) 락토바실러스 젠세니 Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 가세리 LactobacUlus gasseri) 종류로 확인되었다. 따라서, 이들을 각각 SNUV220, SNUV175, SNUV360, SNUV281로 명명하고, 대전광역시 유성구에 소재한 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC18374P(SNUV220,4월 9일 기탁)， KCTC18371P(SNUV175,4월 7일 기탁)， KCTC18372P(SNUV360,4월 7일 기탁) 및 KCTC18375P(SNUV281, 4월 9일 기탁)를 부여 받았다ᅳ
순수 분리 및 동정된 균주의 장기 보관을 위해서는 지수기에 도달한 배양액에 글리세롤 (16%v/v)을 첨가하여 스탁을 만들어 -80°C에 보관하였다. 각 균주의 질염 병원균 억제 활성 평가를 위한 세포 배양액 제조를 위해 혐기성
MRS 배지에 1%씩 접종하여 37 °C에서 24시간 동안 배양한 후 미생물 세포를 OOOXg, 10분간 원심분리하여 제거하고， 상등액을 0.22um의 공극 크기를 갖는 멤브레인 필터에 통과시킨 후 실험 사용 전까지 -80 °C에 보관하였다. 실시예 2. 억제환 테스트 (disk inhibition assavV
실시예 1에서 분리한 각각의 락토바실러스 균주를 MRS 액상배지 (Difco, USA)를 이용하여 37 °C에서 20시간 배양하여 시험에 사용하였으며, 스니치아 속 균주와 가드네렐라 바지날리스 균주는 NYCm 액체배지에 접종한 후 37 °C에서 각각 48시간 또는 24시간 동안 혐기배양하여 시험에 사용하였다.
실험에 사용된 스니치아 속 균주로는 미국 버지니아 커먼웰스 의과대학 (Virginia Commonwealth University School of Medicine) 에서 분리하여 논문으로 보고된 스니치아 앰니 (Srteat a aw ) 균주와， 본 연구진이 한국인 여성에서 분리한 스니치아 생귀네젠스 (S«eflt/^ « g ?egmy) 2종을 사용하였다. 실험에 사용된 가드네텔라 바지날리스 균주는 KCTC 미생물 자원센터에서 분양받은 KCTC5096 균주를 사용하였다.
\ 5 i MRS 한천배지를 플레이트에 분주하고 굳힌 후, 위에 스니치아 속 균주와 가드네텔라 바지날리스 균주를 5 X 106 CFU/mL 수준으로 접종한 NYCm soft 한천배지 (0.75% 한천) 7ι 를 중층하였다. 위층의 soft 한천배지기 굳으면 배지 위에 diffusion paper disk (직경 8mm)를 올려놓고 각각의 락토바실러스 균주의 배양물 약 20 를 흡수시킨 후, anaerobic jar에 플레이트를 넣어 37 °C에서 48시간 동안 혐기배양하였다. 배양 후 disk를 중심으로 나타나는 스니치아 속 균주와 가드네렐라 바지날리스 균주의 생장억제환의 크기를 측정하였다. 억제 활성은 disk를 중심으로 균주의 성장이 저해된 투명환의 직경 (mm)으로 나타내었다. 분리된 락토바실러스 세포 배양액의 스니치아 속 균주와 가드네렐라 바지날리스 균주에 대해 억제환 테스트 (disk inhibition assay)를 실시하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
【표 4】
Species Isolates—No disk inhibition (diameter, mm)
Sn, Amnii Sn. Sanguinegens G. vaginalis Lactobacillus crispatus SNUV220 23 46 19
Lactobacillus fermentum SNUV175 - 19 -
Lactobacillus jensenii SNUV360 60 60 25
Lactobacillus gasseri SNUV281 - 23 19
Lactobacillus crispatus SNUV215 - - -
Lactobacillus fermentum SNUV1 10 - - -
Lactobacillus jensenii SNUV212 - - -
Lactobacillus gasseri SNUV445 - - - 상기 표 4에서 확인할 수 잇는 바와 같이, 락토바실러스 배양액의 억제환 크기는 저해균주의 종류에 대해 약간의 차이를 보였으나， 스니치아와 가드네렐라 균주의 성장을 동시에 억제하는 4종의 락토바실러스 분리 균주， 즉 락토바실러스 크리스 ᅳ투스 (ᅳ Lactobacilhis crispatus) SNUV220, 락토바실러스 퍼멘 ^{Lactobacillus fermentum) SNUV175, 락토바실러스 젠세니 (Lactobacill jensenii) SNUV360, 락토바실러스 가세리 ^ 0 ^7/^ ^^/) 8 1^281를 선발하였다. 특히, 락토바실러스 젠세니 ( a o6ac //w 'erae 7) SNUV360 균주의 경우 스니치아와 가드네렐라 모두에 높은 저해능을 나타내었다. 실시예 3. 락토바실러스 분리균주의 Candida albicans 억제활성
상기 실시예 2에서 스크리닝한 4종류의 락토바실러스의 칸디다성 질염의 원인균인 칸디다 알비칸스 (Ca fo a a/ s) 균주에 대한 억제활성을 확인하기 위하여, 칸디다 알비칸스 (Ca«i fo a/^cara) 균주 중 동물 실험 등에서 질염의 유발이 검증된 균주인 ATCC44858 균주 (Americal Type Culture Collection)와
MYA4788 균주 (Americal Type Culture Collection)를 억제 기능성 균주 선발을 위한 대상 균주로 선정하여 실험을 실시하였다.
구체적으로, 칸디다 균주의 경우, 96웰 디퓨전 테스트 (96well diff sion test)를 이용해 평가하였다. 실험을 위해 96웰에 l OOul의 YM배지, lOOul의 락토바실러스 세포 배양액을 넣고 희석한 칸디다 알비칸스 ATCC44858 균주 (혹은 칸디다 알비칸스 M4788) 배양액 50ul를 넣은 후, 37 °C에서 24시간 배양 후, 저해된 칸디다균의 증식을 600nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 【표 5】
Species Isolates No optical density after 24h (O.D. at 600nm) Candida 44858 Candida MYA4788
(co-culture) (co-culture)
Negative control group 1 1
Lactobacillus crispatus SNUV220 0.028 0.007
Lactobacillus fermentum SNUV175 - 0.003
Lactobacillus jensenii SNUV360 - 0.007
Lactobacillus gasseri SNUV281 0.012 0.010 상기 표 5에서 확인할 수 잇는 바와 같이, 선발된 락토바실러스
크리스 ^투스 {Lactobacillus crispatus) SNUV220, 락토바실러스 퍼멘 ^{Lactobacillus fermentum) SNUV 175, 락토바실러스 젠세니 Lactobacillus jensenii) SNUV360, 락토바실러스 젠세니 (£acto6a 7/^ gimerO SNUV281 모두 칸디다균에 대해서도 100%에 가까운 사멸능을 가지는 것을 확인하였으며, 따라서 상기 4가지 분리 균주 모두 질염 예방에 큰 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 실시예 4. 락토바실러스의 과산화수소 생성활성
과산화수소 생성 정도를 살피기 위하여 TMB배지를 하기 표 6과 같이 제조하였다 (1L 당 배지 조성).
【표 6】
Figure imgf000017_0001
그 다음 상기 실시예 2에서 스크리닝한 4종류의 락토바실러스인
락토바실러스 크리스파투스 ( acto6ac///i« cr ¾oati«) SNUV220, 락토바실러스
^맨툼 (Lactobacillus fermentum) SNUV 175, 락토바실러스 젠세니 ( acto6ac///
SNUV360, 락토바실러스 젠세니 CLacto^ Y/^ gimerO SNUV S l 각각을 MRS 액상배지를 사용하여 37 °C에서 20시간 배양한 다음 TMB배지에 접종한 후 2일간 37 °C에서 혐기 배양하였다. 배양 후 배지를 공기 중에 30분간 노출 시키고 균락이 푸른색으로 변화되는 정성 실험으로 평가하였다. 균락의 색깔이 푸른색으로 변하는 정도를 육안으로 관찰하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.
【표 7】
Figure imgf000018_0002
상기 표 7에서 확인할 수 잇는 바와 같이， 각 균주의 과산화수소 생성능은 다른 패턴을 보였으며, 락토바실러스 퍼
Figure imgf000018_0001
SNUV175, 락토바실러스 젠세니 (j ctobacill jensenii) SNUV360, 락토바실러스
가세리(£«<^0 ^7/^ ^^^0 51^11¥281은 과산화수소 생성이 활발하게 일어남을 확인할 수 있었다. 따라서， 선발 균주의 in vivo 억제능에 대해서는 작용기작 상의 차이가 나타날 것으로 사료된다. 실시예 5. 락토바실러스의 내산성 평가
균주의 내산성은 MRS 액체 배지 (pH 6/7)를 pH 2와 pH 3으로 적정하여 만든 산성 액체 배지에서 24시간 동안 37 °C에서 배양 시 성장률과 pH 6.7의 기본 액체 배지 조건에서의 성장률을 비교하여 상대적으로 판별하여, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
【표 8]
Figure imgf000018_0003
상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 4개 균주 모두 pH 3의 배양 조건에서 성장을 확인하였고, 특히 SNUV175 균주와 SNUV281 균주의 경우 pH2의 조건에서도 성장을 보여 강한 내산성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 실시예 6. 락토바실러스의 내담즙성 평가
내담즙성에 대해서는 으 1 %에서 4%의 담즙산염이 포함된 배지에 24시간 이상 배양 후 성장률을 측정하여 그 결과를 표 9 및 도 1에 나타내었다.
【표 9】
Figure imgf000019_0001
상기 표 9 및 도 1에서 확인할 수 잇는 바와 같이, 전체적으로 0.1 % 담즙성염 농도에 대해서 , 4개 균주 모두 50% 이상의 성장률을 나타냈으며, 특히 락토바실러스 퍼멘툼 (£acto6acz7/i«/er entw ) SNUV175 균주의 경우 0.5%에서 4%의 이르는 담즙산염 농도에서 비처리군 대비 104.9% 내지 75.1 %의 성장률을 유지하여, 담즙산에 대한 매우 큰 저항성을 나타내었다. 따라서, 경구 섭취 시에도 높은 생존율을 유지할 것으로 기대된다. 실시예 7. 락토바실러스의 항생제 저항성 평가
기능성 식품 소재 등으로 활용시의 안전성을 확인하기 위해 질 내 병원성 미생물 증식 억제 활성을 지닌 신규의 락토바실러스 속 분리균주의 항생제 저항성을 평가하였다. 현재 락토바실러스 계열 유산균의 식품 활용시의 항생제 저항성에 관한 규격기준은 설정되어 있지 않아, 동물성 사료에 첨가되는 미생물의 항생제 저항성에 관한 국제 기준인 EFSA 기준을 바탕으로 평가하였다.
구체적으로, 락토바실러스 균주의 항생제 저항성 평가는 국제 기준인 EFSA(European Food Safety Authority) 지침에 의거하여, ampicillin(AMP),
chloramphenicol(CHR), clindamycin(CLM), erythromycin(ERY) , gentamycin(GEN), kanamycin(KAN), streptomycin(STR), tetracycline(TET), vancomycin(VAN) 등 9종의 항생제를 대상으로 실시하였다. 항생제 저항성 평가 시에 사용된 시험방법은 유산균의 항생제 저항성 시험을 위한 SOP 기준인 ISO 10932:2010 (IDF 223 :2010)에 따라 실시하였으며 , LSM-broth(90% IsoSensitest- and 10% MRS-broth; Oxoid)에 ~6>< 106 CFU/mL로 각 락토바실러스 균주를 접종한 후, 각 항생제 별 MIC test strip
(Liofilchem, Italy)을 을려놓고 37 °C에서 48시간 동안 혐기배양 후 억제 정도 및 MIC를 평가하고, 그 결과를 표 10 및 도 2에 나타내었다.
【표 10]
Figure imgf000020_0002
상기 표 10 및 도 2에서 확인할 수 잇는 바와 같이， 4개의 분리 균주 중 락토바실러스 젠세니
Figure imgf000020_0001
SNUV360 균주와 락토바실러스
퍼멘툼 CLacto6a //^/er e«tw ) SNUV175 균주의 경우 사용된 9종의 항생제에 ；대하여 모두 EFSA의 기준 (상기 표 10에서 EFSA guideline)을 만족하는 항생제 감수성을 나타내어, 경구 섭취를 통한 건강기능식품으로의 활용가능성이
기대된다. 실시예 8. 락토바실러스의 Gardmerella vaginalis 감염 억제능 평가
암컷 생쥐 (BALB/c mice)에 0.5mg의 베타 에스트라디을 (beta-esteradiol 3-benzonate)올 복강 투여하여 호르몬 조절 및 estrous cycle을 유도하고, 3일 후에 병원균인 가드너렐라 바지날리스 (Gar^ere//a vag/"afc)를 l x l 07 CFU 농도로 질 내로 직접 감염시켜 질염 동물 모델을 수립하였다.
이후 108 내지 109 CFU에 해당하는 4종의 락토바실러스 분리 균주를 질 내 투여하고 (각 그룹당 7마리) . 2일째에 질 내를 0.1 mL의 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 씻어낸 질 가검물에서 total DNA를 추출하여 마이크로비음 군집분석 및 가드너렐라 바지날리스의 relative abundance를 측정하였다. 질 가검물에서의 DNA 추출은 Mobio PowerSoil DNA extraction kit를 사용하였고, 군집 분석을 위해 16S rDNA의 V4 영역에 해당하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, Illumina Miseq 장비를 이용해 차세대유전체염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Qiime 분석 파이프라인을 통해 taxonomy 분석, α-diversity 및 그룹 간의 군집 (community) 구조 차이를 나타내는 β-diversity 분석을 실시하였고, 락토바실러스 투여 시 가드네렐라 바지날리스 균 수의 변화는 relative abundance(/%GV투여그룹)으로 평가하였다. 그 결과를 표 11 및 도 3 내지 도 4 및 도 5에 나타내었다.
가드네렐라 바지날리스 투여군, 가드네렐라 감염 후 락토바실러스
크리스파투스(^ 0 ^7/^^^ 1«) 8 1^220 투여군, 가드네렐라 감염 후 락토바실러스 젠세니 ( acto>acz7/i« erae 7)SNUV360 투여군, 가드네텔라 감염 후 락토바실러스 퍼멘툼 (£acto ci// /er e W ) SNUV175 투여군, 가드네렐라 감염 후 락토바실러스 가세리( (^½£^7/^^^^/) 3 11¥281 투여군, 가드네렐라 감염 후 양성 대조군으로 메트로니다졸 (0.75%) 항생제 투여군을 각각 'GV', 'SNUV220', 'SNUV360', 'SNUV175', 'SNUV281' 및 'MTZ'로 표시하였다.
【표 11】
Figure imgf000021_0002
표 11 및 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 크리스 ■투스 (Lactobac us crispatus) SNUV220 학토바실러스 젠세니 Lactobacillus jensenii) SNUV360, 락토바실러스 퍼멘
Figure imgf000021_0001
SNUV175, 락토바실러스 가세리(£^^0^^//^ ^^08 1；¥281 균주는 가드네텔라
바지날리스균을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 4종의 균주를 투여하였을 때 가드네렐라 바지날리스 감염 후의 질 내 균총의 군집 구조가 모두 변화하였음을 알 수 있었다. 가드네렐라 및 락토바실러스 투여 후 군집 구조의 변화 는 Unweighted UniFrac distance를 이용해 측정하였으며, 도 4에 표시하였다. 현재 질염 질환의 치료제로 사용되는 양성 대조군인 메트로니다졸의 질 내 투여 시에는 락토바실러스 균주의 투여군에서 보여진 군집구조의 변화는 나타나지 않았다.
가드네렐라 감염 후 락토바실러스를 투여하면 질 내 미생물의 군집 구조가 변화하는 것을 확인함과 더불어, 각 투여군에서 유의적으로 변화된 미생물의 종 (species)이 무엇인지를 LefSe 프로그램을 통해 분석하였다.
그 결과는 도 5의 cladogram과 같다. 위 분석을 통해 가드네렐라만을 감염시킨 그룹 (C)에서 유의적으로 Gardnerellct vaginalis, Staphylococcus spp.가 증가하였고, 본 발명의 락토바실러스 균주를 가드네렐라 감염 후에 1회 투여한 그룹 (D, E, G)에서는 유의적으로 락토바실러스 균주가 증가함을 확인함으로써 락토바실러스의 투여가 질 내 군집 구조를 바꾸고 질 내 균총에 영향을 미치고 있음을 확인하였다.
【수탁번호】
기탁기관명: 미생물자원센터
수탁번호: KCTC18371 P
수탁일자: 20150407 기탁기관명: 미생물자원센터
수탁번호: KCTC18372P
수탁일자: 20150407 기탁기관명: 미생물자원센터
수탁번호: KCTC 18374P
수탁일자: 20150409 기탁기관명: 미생물자원센터
수탁번호: KCTC 18375P
수탁일자: 20150409
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Figure imgf000026_0001
특허절차상 미생물 기탁의 승인에 관한 부다페스트 조약 국제용 양식
원기탁에 관한수령
규정 7. 1에 따른 발행 수 신: 고광표
서울대학교
관악로 1
관악구
서을 (우) 08826
대한민국
I . 미생물의 명칭 기탁자에 의해 주어진 명칭: 국제기탁기관이 부여한 수탁번호:
Lactobacillus fermentum SNUV175 KCTC 12993BP
Π . 과학적 성질 및 /또는분류학상위치 상기 I에 표시된 미생물에 다음을 첨부하였다.
[ X 〕 과학적 성질
[ ] 분류학상 위치
(적용대상에 체크할 것)
. 수령 및 수탁 본 국제기탁기관은 상기 I .에 표시된 미생물을 수탁 받고 , 2016 년 03 월 22 일 수령하였다.
IV. 전환요청의 수령
상기 I .에 표시된 미생물은 본 국제기탁기관에 2015 년 04 월 07 일에 수탁되었고， 원 기탁 (KCTC18371P)의 부다페스트조약에 의한 기탁으로의 변환 요청이
2016년 03월 22일에 수령되었다.
V. 국제기탁기관
명 칭 : 생물자원센터 국제기탁기관을 대표하는 권한을 주 소: 한국생명공학연구원 가지거나 권한을 부여받은 담당자의 과학로 125 날인:
유성구
대전시 (우) 305-806
대한민국 날짜 : 2016년 03월 23일
FORM BP/4 (KCTC Form 17) 단일 페이지
SUBSTITUTE SHEET RULE 26 RO/KR 수
시 특허절차상 미생물 기탁의 승인에 관한 부다페스 서고관서관대 국제용 양식
울광악울악한
표로대구민 h 원기탁에 관한수령
히「i 1 규정 7.1에 따른 발행 이건 문서의 아랫부분에 기재된 국제기탁기관에 의해 조약 7.1에 따라 발행된 원기탁에 관한 접수
Figure imgf000028_0001
B T HEET RULE 26 RO/KR -허절차상 미생물 기탁의 승인에 관한 부다페스트 조약 국제용 양식
원기탁에 관한수령
규정 7. 1에 따른 발행 수 신: 고광표
서울대학교 이건 문서의 아랫부분에 기재된 관악로 1 국제기탁기관에 의해 관악구 조약 7. 1에 따라 발행된 서울 (우) 08826 원기탁에 관한 접수 대한민국
Figure imgf000029_0001
SUBSTITUTE SHEET RULE 26 RO/KR 특허절차상 미생물 기탁의 승인에 관한 부다페스트 조약 서고관서관대 국제용 양식
울광악울악한
표로대구민 h 원기탁에 관한수령
학국 1
교 o 규정 7. 1에 따른 발행 수 신
이건 문서의 아랫부분에 기재된 국제기탁기관에 의해 조약 7. 1에 따라 발행된 원기탁에 관한 접수
Figure imgf000030_0001
SUBSTITUTE SHEET RULE 26 RO/KR

Claims

【특허청구범위】
【청구항 11
질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 가지는
락토바실러스 (£acto>a«//t«) 속 균주.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 병원성 미생물은 곰광이， 세균 및 바이러스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 락토바실러스 속 균주.
【청구항 3]
제 2항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 칸디다 ( ^a) 속 균주， 스니치아 속 균주, 가드너텔라 (Garc/"ere//a) 속 균주 및 인유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인， 락토바실러스 속 균주.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 스니치아 속 균주는 스니치아 암니 ( eat/n'aaw 7) 또는 스니치아 생귀네젠스 (S"eat/za« gwiegmy)인 락토바실러스 속 균주.
【청구항 5】
거 13항에 있어서, 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비칸스 (Ca«^i ? a½z'cara)이고, 상기 가드너렐라 속 균주는 가드너렐라 바지날리스 (Gari ere//a vag/«ato)인 것인, 락토바실러스 속 균주.
【청구항 6】
제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스
크리스파투스 (Ζ<α ο)ίϊ(:ζ'//Μ5· crispatus), 락토바실러스 퍼멘툼 ( ^acto^aaY/ws fermentum), 락토바실러스 젠세니 ( acto6a 7/i« erae 7), 및 락토바실러스 가세리 ( acto6acz7/i« gasseri)로— 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 락토바실러스 속 균주.
【청구항 7】
거 11항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 기탁번호 KCTC18374P를 갖는 락토바실러스 크리스파투스 ( acto d/Z^cr ati ) SNUV220, 기탁번호
KCTC18371P를 갖는 락토바실러스 퍼멘툼0^ 0 ^7/^/^/^« ) 8 1；\^175, 기탁번호 KCTC18372P를 갖는 락토바실러스 젠세니
Figure imgf000031_0001
SNUV360: 및 기탁번호 KCTC18375P를 갖는 락토바실러스 가세리 ( acto6a 7/^ ga^ ')
SNUV281로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 락토바실러스 속 균주.
【청구항 8 ]
제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 0.1%(w/v) 담즙산염 농도에서 50%이상의 생존율을 나타낸 것인, 락토바실러스 속 균주.
【청구항 9】
제 1항 내지 게 8항 중 어느 한 항에 따른 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 가지는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 10]
제 9항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 스니치아 속 균주에 의한 것인, 질염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 1 1】
제 10항에 있어서, 상기 상기 스니치아 속 균주는 스니치아 암니 ( eflt/2/β amnii) 또는 스니치아 생귀네젠스 (S«eat/z^ « g /«egera)인 것인, 질염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 12]
제 10항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 추가로 칸디다 (Ca //i^) 속 균주 및 가드너렐라 ( ri/«ere//a) 속 균주 및 인유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 질염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 13 ]
제 12항에 있어서, 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비칸스 ( ¾a a!biccms)이고, 상기 가드너텔라 속 균주는 가드너렐라 바지날리스 (Garc «ere//a vaginalis)인 것인, 질염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
【청구항 14】
게 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 가지는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 개선, 치료 또는 예방용 건강기능식품.
【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 스니치아 속 균주에 의한 것인, 질염 개선， 치료 또는 예방용 건강기능식품.
【청구항 16] 제 15항에 있어서, 상기 상기 스니치아 속 균주는 스니치아 암니 (S^at a amnii) 또는 스니치아 생귀네젠스 (S"eat/^^ g 7ege )인것인, 질염 개선, 치료 또는 예방용 건강기능식품ᅳ '
【청구항 17】
제 15항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 추가로 칸디다 (O c ¾) 속 균주 및 가드너렐라 ( r^ere//a) 속 균주 및 인유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인， 질염 개선, 치료 또는 예방용
건강기능식품.
【청구항 18】
제 17항에 있어서, 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비칸스 (Cana a 이고, 상기 가드너렐라 속 균주는 가드너렐라 바지날리스 (Ga «ere//a vag««fc)인 것인， 질염 개선, 치료 또는 예방용 건강기능식품.
【청구항 19】
제 14항에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료, 발효유, 또는 식품 첨가제인 것인, 질염 개선， 치료 또는 예방용 건강기능식품.
【청구항 20】
거 11항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 질 내 병원성 미생물의 증식을 억제하는 활성을 가지는 락토바실러스 속 균주를 유효성분으로 함유하는 질염 개선, 치료 또는 예방용 세정제품.
【청구항 21】
제 20항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 스니치아 속 균주에 의한, 것인, 질염 개선, 치료 또는 예방용 세정제품.
【청구항 22】
제 21항에 있어서, 상기 스니치아 속 균주는 스니치아 암니 (Sneathia amnii) 또는 스니치아 생귀
Figure imgf000033_0001
sa«gw/«egera)인 것인, 질염 개선, 치료 또는 예방용 세정제품.
【청구항 23】
제 21항에 있어서, 상기 질 내 병원성 미생물은 추가로 칸디다 ( cZ/^a) 속 균주 및 가드너렐라 (Gari/«ere//a) 속 균주 및 인유두종 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 }종 이상을 포함하는 것인, 질염 개선, 치료 또는 예방용 세정제품.
【청구항 24 ]
제 23항에 있어서, 상기 칸디다 속 균주는 칸디다 알비칸스 (Omi ¾a a /cim)이고, 상기 가드너렐라 속 균주는 가드너렐라 바지날리스 (Ga «ere//a ra^nafc)인 것인, 질염 개선， 치료 또는 예방용 세정제품.
【청구항 25】
제 20항에 있어서, 상기 세정제품은 고체화장비누， 손 세정게, 액체샴푸， 액체비누， 액체린스, 바디 세정게， 또는 크림상 비누인 것인, 질염 개선, 치료 또는 예방용 세정제품.
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