TW201800098A - 嗜熱鏈球菌tci633菌株及其代謝產物於預防及/或治療骨質疏鬆症之應用 - Google Patents
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Abstract
一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一藥劑及/或食品之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),該藥劑係用於預防及/或治療骨質疏鬆症,該食品係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。
Description
本發明係關於嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物的應用,尤其是關於使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於預防及/或治療骨質疏鬆症的應用,包括抑制蝕骨細胞之活化及分化。其中,該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。
骨質疏鬆症為一種全身性骨骼疾病,其特徵為骨量減少、骨組織的結構變弱。由於骨質疏鬆症患者的骨量減少且骨組織結構變弱,故骨折風險較高,且常因骨折而產生其他併發症,例如:功能障礙、骨骼變形、疼痛、甚至死亡等。已知,骨質密度會隨著老化而降低,女性在停經後骨質密度更會急遽地下降;此外,其他例如甲狀腺疾病、糖尿病、服用類固醇、吸菸、酗酒、或腸道吸收不良等因素,亦可能促使鈣質流失。經研究發現,骨質密度降低的主要病理機制係蝕骨細胞(osteoclast)的活性高於成骨細胞(osteoblast),此使得鈣質由骨骼往血液移動,造成骨骼鈣質流失。
雖然適當的鈣質補充及運動係有助於維持骨質密度,但現代人多半缺乏運動,且單純的鈣質補充並無法有效降低鈣質流失的速度或減緩骨質疏鬆症所引起的疼痛。因此,業界仍亟需可有效預防及/或治療骨質疏鬆症的方法及藥物。
本發明即針對上述問題之研發成果。本案發明人研究發現,嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物係可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,從而可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
本發明之一目的,在於提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一藥劑之用途,其中該藥劑係用於預防及/或治療骨質疏鬆症,且該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。較佳地,該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之活化及/或分化,且係以口服之劑型提供。
本發明之另一目的,在於提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一食品之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),且該食品係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。其中,該食品可以為保健食品、營養補充食品或特殊營養食品。較佳地,該食品係保健食品。
本發明之又一目的,在於提供一種用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼之至少一者的方法,其係包含對一有需要之個體投予一有效量之嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物。較佳地,該嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物係以口服之投藥方式施用。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣;惟,在不背離本發明精神下,本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。
此外,除非文中有另外說明,於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式;所謂「治療」,不應被解釋為治療一個體直至完全恢復,而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質;所謂「預防」係指抑制或防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性;所謂「有效量」,係指投予至個體時,可有效地至少部分改善懷疑個體之病情的物質數量;所謂「個體」係指哺乳動物,該哺乳動物可以為人類或非人動物;所謂「CFU/公斤體重」係指每公斤體重個體所須之投藥量。
骨質疏鬆症會對患者的生活造成許多不便,所導致的併發症甚至可能致命,目前業界仍需要可有效預防及/或治療骨質疏鬆症的手段。本案發明人研究發現,嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物係可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,故可用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼。
因此,本發明係提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼之應用。前述應用包括:使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一預防及/或治療骨質疏鬆症之藥劑;使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼之食品;以及對有需要之個體投予嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物以預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼的方法。
根據本發明,所採用之嗜熱鏈球菌TCI633菌株代謝產物可以是透過在適於嗜熱鏈球菌TCI633菌株生長的環境下進行培養所產生者。例如:先以適當之培養液對嗜熱鏈球菌TCI633菌株進行培養,其後,視需要地去除前述培養液中之菌體等固體物,以獲得含有代謝產物之液體。
可選用任意合宜之培養液以進行嗜熱鏈球菌TCI633菌株之培養,以提供所欲之代謝產物,只要該培養液可提供嗜熱鏈球菌TCI633菌株生長、代謝所需養分(如酵母菌萃取物、蛋白質及葡萄糖)與條件(如酸鹼值)即可。此外,嗜熱鏈球菌TCI633菌株之培養時間亦無特殊限制,只要足以使嗜熱鏈球菌TCI633菌株完成至少一次代謝循環即可。舉例言之,於本發明一具體實施態樣中,係以MRS培養液對嗜熱鏈球菌TCI633菌株進行培養,歷時15小時,使菌株進行代謝作用並產生代謝產物。
於本發明中,係可直接使用經歷嗜熱鏈球菌TCI633菌株之代謝循環的含嗜熱鏈球菌TCI633菌株與代謝產物的培養液,或使用經移除嗜熱鏈球菌TCI633菌株等固體物之含代謝產物之液體。可採用任何合宜之操作以移除固體物,只要對培養後所產生的代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言,係採用物理手段以移除固體物,例如,可採用離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地,可重複或合併進行前述之操作,以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
根據本發明之應用所提供之藥劑係可呈現任何合宜的形式,並無特殊限制,端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之,但不以此為限,該藥劑可以適於口服之投藥方式施用至有需要之個體上,以預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼。其中,視所使用之形式及用途而定,可選用合宜之載劑以提供該藥劑,只要該載劑對嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。舉例言之,該載劑可為例如:賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等,但不以此為限。
以適於口服之劑型為例,該載劑的例子包括,但不限於,水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土(sugar bentonite)、及前述之組合。可利用任何合宜之方法,以適於口服投藥的劑型提供該藥劑,例如:粉劑(例如乾燥菌粉)、錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
視需要地,可於本發明之應用所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑,例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等,以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外,該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分(例如鈣質補充劑、維生素D、雙磷酸鹽等),或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用,以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度,只要該其他活性成分對嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物之效益沒有不利的影響即可。
根據本發明之應用所提供之藥劑係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用,端視投予個體之需求、年齡、體重、活動量、及健康況狀而異。舉例言之,當以口服方式施用至一個體以預防骨質疏鬆症及/或治療骨質疏鬆症時,以TCI633菌株計,其用量為每天至少8.06x108
CFU/公斤體重,較佳為每天8.06x108
CFU/公斤體重至8.06x1010
CFU/公斤體重,更佳為每天8.06x109
CFU/公斤體重至8.06x1010
CFU/公斤體重。
根據本發明之應用所提供之食品可以是保健食品、營養補充食品或特殊營養食品,且可以製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品,但不以此為限。較佳地,根據本發明之食品係以保健食品的形式提供。
根據本發明之應用所提供之保健食品、營養補充食品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用,端視投予個體之需求、年齡、體重、活動量、及健康狀況而異。亦可針對特定族群調整根據本發明所提供之保健食品、營養補充食品及特殊營養食品中嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物的含量,較佳為調整至每日應服用的量。
可於本發明保健食品、營養補充食品及/或特殊營養食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如孕婦、停經後婦女、骨質疏鬆症患者等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項,以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。
本發明亦提供一種用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼之至少一者的方法,其係包含對一有需要之個體投予一有效量之嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物。有關TCI633菌株及其代謝產物的投予途徑、投予形式、適用劑量及應用,均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[
實驗材料
]
實施例所用之材料、試劑、儀器來源如下: (1)MRS培養液:購自BD,產品編號288130。 (2)X-VIVO 10培養液:購自Lonza公司。 (3)TRIzol®
試劑:購自Invitrogen公司。 (4)NanoDrop 1000分光光度計:購自Thermo Fisher Scientific公司。 (5)人類全基因體晶片(Human Whole Genome)OneArray®
:購自Phalanx Biotech Group。 (6)DNA微陣列掃描儀:購自Agilent Technologies公司,型號G2505C。 (7)GenePix 4.1軟體:購自Molecular Device公司。 (8)Rosetta Resover System®
:購自Rosetta Biosoftware公司。 (9)Alpha-MEM培養液:購自Gibco公司,產品編號12000-022。 (10)FBS:購自Gibco公司。 (11)P/S(Penicillin/Streptomycin):購自Gibco公司。 (12)人RANKL:購自Peprotech公司,產品編號310-01。 (13)人M-CSF:購自Peprotech公司,產品編號300-25。 (14)Actin GreenTM
488 ReadyProbes®
試劑:購自Thermo公司,產品編號R37110。 (15)Hoechst 33342染劑:購自Thermo公司,產品編號62249。
[
製備實施例
]
A.
周邊血單核球細胞(
PBMC
)之獲取
PBMC係存在於周邊血中的免疫細胞。於本製備實施例中,係由健康捐贈者提供周邊血,並從中分離出PBMC。
B.
嗜熱鏈球菌
TCI633
菌株發酵上清液之製備
於37°C之環境下靜置培養,將嗜熱鏈球菌TCI633菌株培養於MRS培養液中15小時後,對該培養液進行離心(轉速:5000rmp/分鐘;時間:40分鐘)以去除大部分之菌體,再以0.2微米濾膜過濾以進一步去除菌體。接著,自前述經離心及濾膜過濾之培養液取出上清液,所得即為嗜熱鏈球菌TCI633菌株之發酵上清液。將該TCI633菌株發酵上清液冷凍保存於-20°C下,以供後續實驗使用。
實施例
1
:
嗜熱鏈球菌
TCI633
菌株及其代謝產物於抑制蝕骨細胞之活化及分化的效果
(
1-1
)抑制蝕骨細胞活
化及分化相關基因之表現
已知CTSK
、TRAP
、c-FOS
、MITF
、BLNK
、及SYK
等基因與蝕骨細胞之活化及分化相關。若可抑制上述基因的表現量,將可抑制蝕骨細胞的活化及分化,從而達到預防及/或治療骨質疏鬆症的功效。
為了解嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物是否具有抑制蝕骨細胞活化及分化之功效,取[製備實施例A]所獲得之PBMC細胞,將其分為四組,並於5%CO2
、37°C之條件下進行以下處理: (A) 「控制組」:將細胞培養於X-VIVO 10培養液(即,不含TCI633菌株發酵上清液的培養液)中,歷時24小時; (B) 「3小時組」:如「控制組」之操作,但於培養21小時之後,加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,繼續培養3小時; (C) 「6小時組」:如「控制組」之操作,但於培養18小時之後,加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,繼續培養6小時;以及 (D) 「24小時組」:如「控制組」之操作,但於培養液中加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,以進行培養。
接著,依照TRIzol®
試劑製造商的指示,收集上述各組細胞,以進行RNA萃取及純化,其後,使用NanoDrop 1000分光光度計測量所得RNA之OD260/280比值、及OD260/230比值,並進行以下處理: (1) 取1微克之RNA進行反轉錄作用,以合成第一股cDNA(first strand cDNA); (2)利用步驟1之第一股cDNA合成第二股cDNA,並純化出雙股cDNA; (3)對步驟2之雙股cDNA進行轉錄作用,以合成經胺基丙烯基修飾之aRNA(amino Allyl-modifies aRNA),並純化; (4) 以Cy5螢光染劑對經純化之aRNA進行染劑偶合反應(dye coupling reaction),並純化出經螢光標示之aRNA。 (5)使用Phalanx雜交緩衝液、及Phalanx雜交系統,將步驟4之經螢光標示之aRNA雜交至人類全基因體晶片(Human Whole Genome)OneArray®
; (6)在雜交16小時後,將非專一性結合之標的物清洗掉; (7)使用DNA微陣列掃描儀,掃描晶片; (8)使用GenePix 4.1軟體,分析各點之Cy5螢光強度;以及 (9)於再現性超過0.975的情況下,重複上述步驟5至8,各單一樣本皆至少重複二次,取螢光強度之平均值並填入Rosetta Resover System®
中。
其後,分別記錄各組(包括控制組、3小時組、6小時組、及24小時組)中與蝕骨細胞之活化及分化相關之基因(包括CTSK
、TRAP
、c-FOS
、MITF
、BLNK
、及SYK
)的表現量,並以控制組的基因表現量為基準以標準化各實驗組之基因表現量。結果示於圖1。
由圖1可知,相較於控制組,3小時組、6小時組、及24小時組之CTSK
、TRAP
、c-FOS
、MITF
、BLNK
、及SYK
等基因的表現量皆顯著下降。前述結果顯示,嗜熱鏈球菌TCI633菌株之發酵上清液具有抑制蝕骨細胞之活化及分化的效果,故可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
(
1-2
)肌動蛋白
之表現
已知未分化的PBMC體積較小,且肌動蛋白會表現在整個細胞內,此時若對肌動蛋白進行染色,會見到點狀螢光。PBMC受到蝕骨細胞分化因子刺激後,會彼此融合成體積較大且多核的蝕骨細胞,且肌動蛋白會在細胞邊緣形成明顯環狀構造,此時若對肌動蛋白進行染色則可觀察到環狀螢光。
取[製備實施例A]提供之細胞,將其分成四組,並於5%CO2
、37°C之條件下進行以下處理: (A) 控制組:將細胞培養於Alpha-MEM培養液中,歷時14天; (B) 分化組:如「控制組」之操作,但採用蝕骨細胞分化培養液(即,添加有10%FBS、1x P/S、人RANKL(40奈克/毫升)、及人M-CSF(25奈克/毫升)之Alpha-MEM培養基)以進行培養; (C) 空培液組:如「分化組」之操作,但所採用之蝕骨細胞分化培養液係添加有空培液(即,1% MRS培養液);以及 (D) 上清液組:如「分化組」之操作,但所採用之蝕骨細胞分化培養液係添加有1% [製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液。
接著,使用Actin GreenTM
488 ReadyProbes®
及Hoechst 33342染劑(1:20000稀釋)對上述各組細胞進行染色,歷時15分鐘。染色結果示於圖2,其中黃色螢光代表肌動蛋白,藍色螢光則代表細胞核。
由圖2可知,分化組中的肌動蛋白分布明顯呈環狀。相較於分化組及空培液組,上清液組中的肌動蛋白分布情形明顯較接近控制組。前述結果顯示,嗜熱鏈球菌TCI633菌株發酵上清液可有效抑制PBMC細胞分化為蝕骨細胞,再次說明嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
由上述實驗結果可知,本發明嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物確實可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,故可用於預防及/或治療骨質疏鬆症,達到減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼的效果。
圖1係顯示以RNA微陣列(microarray)分析以不同條件培養之周邊血單核球細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)之CTSK
(Cathepsin K
)、TRAP
(Tartrate-resistant acid phosphatase
)、c-FOS
、MITF
(Microphthalmia-associated transcription factor
)、BLNK
(B cell linker
)、及SYK
(Spleen tyrosine kinase
)的表現量,其中,「控制組」係培養於不含TCI633菌株發酵上清液的培養液中24小時,「3小時組」、「6小時組」、及「24小時組」則比照「控制組」之操作,但分別於培養終了前3小時、6小時、及24小時在培養液中添加TCI633菌株發酵上清液以續行培養;以及
圖2係顯示以免疫螢光染色(immuno-fluorescent staining)分析不同組別之周邊血單核球細胞分化成蝕骨細胞之程度的結果(黃色螢光代表肌動蛋白;藍色螢光代表細胞核;比例尺(Scar bar)為100微米),其中,「控制組」係培養於不含TCI633菌株發酵上清液的培養液中,「分化組」係培養於分化培養液中,「空培液組」係培養於添加有空培液(即,MRS培養液)的蝕骨細胞分化培養液中,「上清液組」則係培養於添加有TCI633菌株發酵上清液的蝕骨細胞分化培養液中。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2014/06/23 BCRC 910636。
DE德國 德國國家菌種保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 2013/12/02 DSM 28121。
Claims (9)
- 一種使用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一藥劑之用途,其中該藥劑係用於預防及/或治療骨質疏鬆症,且該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之活化。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之分化。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於預防骨質疏鬆症。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於治療骨質疏鬆症。
- 如請求項1至5任一項之用途,其中該藥劑係以口服之劑型提供。
- 一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一食品之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),且該食品係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。
- 如請求項7之用途,其中該食品係保健食品、營養補充食品或特殊營養食品。
- 如請求項8之用途,其中該食品係保健食品。
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