TWI625124B - 嗜熱鏈球菌tci633菌株及其代謝產物於預防及/或治療骨質疏鬆症之應用 - Google Patents
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- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
Abstract
一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一藥劑及/或食品之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),該藥劑係用於預防及/或治療骨質疏鬆症,該食品係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。
Description
本發明係關於嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物的應用,尤其是關於使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於預防及/或治療骨質疏鬆症的應用,包括抑制蝕骨細胞之活化及分化。其中,該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。
骨質疏鬆症為一種全身性骨骼疾病,其特徵為骨量減少、骨組織的結構變弱。由於骨質疏鬆症患者的骨量減少且骨組織結構變弱,故骨折風險較高,且常因骨折而產生其他併發症,例如:功能障礙、骨骼變形、疼痛、甚至死亡等。已知,骨質密度會隨著老化而降低,女性在停經後骨質密度更會急遽地下降;此外,其他例如甲狀腺疾病、糖尿病、服用類固醇、吸菸、酗酒、或腸道吸收不良等因素,亦可能促使鈣質流失。經研究發現,骨質密度降低的主要病理機制係蝕骨細胞(osteoclast)的活性高於成骨細胞(osteoblast),此使得鈣質由骨骼往血液移動,造成骨骼鈣質流失。
雖然適當的鈣質補充及運動係有助於維持骨質密度,但現代人多半缺乏運動,且單純的鈣質補充並無法有效降低鈣質流失的速度或減緩骨質疏
鬆症所引起的疼痛。因此,業界仍亟需可有效預防及/或治療骨質疏鬆症的方法及藥物。
本發明即針對上述問題之研發成果。本案發明人研究發現,嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物係可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,從而可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
本發明之一目的,在於提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一藥劑之用途,其中該藥劑係用於預防及/或治療骨質疏鬆症,且該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。較佳地,該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之活化及/或分化,且係以口服之劑型提供。
本發明之另一目的,在於提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一食品之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),且該食品係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。其中,該食品可以為保健食品、營養補充食品或特殊營養食品。較佳地,該食品係保健食品。
本發明之又一目的,在於提供一種用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼之至少一者的方法,其係包含對一有需要之個體投予一有效量之嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物。較佳地,該嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物係以口服之投藥方式施用。
圖1係顯示以RNA微陣列(microarray)分析以不同條件培養之周邊血單核球細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)之CTSK(Cathepsin K)、TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)、c-FOS、MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)、BLNK(B cell linker)、及SYK(Spleen tyrosine kinase)的表現量,其中,「控制組」係培養於不含TCI633菌株發酵上清液的培養液中24小時,「3小時組」、「6小時組」、及「24小時組」則比照「控制組」之操作,但分別於培養終了前3小時、6小時、及24小時在培養液中添加TCI633菌株發酵上清液以續行培養;以及
圖2係顯示以免疫螢光染色(immuno-fluorescent staining)分析不同組別之周邊血單核球細胞分化成蝕骨細胞之程度的結果(黃色螢光代表肌動蛋白;藍色螢光代表細胞核;比例尺(Scarbar)為100微米),其中,「控制組」係培養於不含TCI633菌株發酵上清液的培養液中,「分化組」係培養於分化培養液中,「空培液組」係培養於添加有空培液(即,MRS培養液)的蝕骨細胞分化培養液中,「上清液組」則係培養於添加有TCI633菌株發酵上清液的蝕骨細胞分化培養液中。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣;惟,在不背離本發明精神下,本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。
此外,除非文中有另外說明,於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式;所謂「治療」,不應被解釋為治療一個體直至完全恢復,而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質;所謂「預防」係指抑制或
防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性;所謂「有效量」,係指投予至個體時,可有效地至少部分改善懷疑個體之病情的物質數量;所謂「個體」係指哺乳動物,該哺乳動物可以為人類或非人動物;所謂「CFU/公斤體重」係指每公斤體重個體所須之投藥量。
骨質疏鬆症會對患者的生活造成許多不便,所導致的併發症甚至可能致命,目前業界仍需要可有效預防及/或治療骨質疏鬆症的手段。本案發明人研究發現,嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物係可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,故可用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼。
因此,本發明係提供一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼之應用。前述應用包括:使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一預防及/或治療骨質疏鬆症之藥劑;使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物於製造一減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼之食品;以及對有需要之個體投予嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物以預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼的方法。
根據本發明,所採用之嗜熱鏈球菌TCI633菌株代謝產物可以是透過在適於嗜熱鏈球菌TCI633菌株生長的環境下進行培養所產生者。例如:先以適當之培養液對嗜熱鏈球菌TCI633菌株進行培養,其後,視需要地去除前述培養液中之菌體等固體物,以獲得含有代謝產物之液體。
可選用任意合宜之培養液以進行嗜熱鏈球菌TCI633菌株之培養,以提供所欲之代謝產物,只要該培養液可提供嗜熱鏈球菌TCI633菌株生長、代謝所需養分(如酵母菌萃取物、蛋白質及葡萄糖)與條件(如酸鹼值)即可。
此外,嗜熱鏈球菌TCI633菌株之培養時間亦無特殊限制,只要足以使嗜熱鏈球菌TCI633菌株完成至少一次代謝循環即可。舉例言之,於本發明一具體實施態樣中,係以MRS培養液對嗜熱鏈球菌TCI633菌株進行培養,歷時15小時,使菌株進行代謝作用並產生代謝產物。
於本發明中,係可直接使用經歷嗜熱鏈球菌TCI633菌株之代謝循環的含嗜熱鏈球菌TCI633菌株與代謝產物的培養液,或使用經移除嗜熱鏈球菌TCI633菌株等固體物之含代謝產物之液體。可採用任何合宜之操作以移除固體物,只要對培養後所產生的代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言,係採用物理手段以移除固體物,例如,可採用離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地,可重複或合併進行前述之操作,以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
根據本發明之應用所提供之藥劑係可呈現任何合宜的形式,並無特殊限制,端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之,但不以此為限,該藥劑可以適於口服之投藥方式施用至有需要之個體上,以預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼。其中,視所使用之形式及用途而定,可選用合宜之載劑以提供該藥劑,只要該載劑對嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。舉例言之,該載劑可為例如:賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等,但不以此為限。
以適於口服之劑型為例,該載劑的例子包括,但不限於,水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土(sugar bentonite)、及前述之組合。可利用任何合宜之方法,以適於口服投
藥的劑型提供該藥劑,例如:粉劑(例如乾燥菌粉)、錠劑(例如糖衣錠)、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
視需要地,可於本發明之應用所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑,例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等,以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外,該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分(例如鈣質補充劑、維生素D、雙磷酸鹽等),或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用,以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度,只要該其他活性成分對嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物之效益沒有不利的影響即可。
根據本發明之應用所提供之藥劑係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用,端視投予個體之需求、年齡、體重、活動量、及健康況狀而異。舉例言之,當以口服方式施用至一個體以預防骨質疏鬆症及/或治療骨質疏鬆症時,以TCI633菌株計,其用量為每天至少8.06x108 CFU/公斤體重,較佳為每天8.06x108 CFU/公斤體重至8.06x1010 CFU/公斤體重,更佳為每天8.06x109 CFU/公斤體重至8.06x1010 CFU/公斤體重。
根據本發明之應用所提供之食品可以是保健食品、營養補充食品或特殊營養食品,且可以製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品,但不以此為限。較佳地,根據本發明之食品係以保健食品的形式提供。
根據本發明之應用所提供之保健食品、營養補充食品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用,端視投予個體之需求、年齡、體重、活動量、及健康狀況而異。亦可針對特定族群調整根
據本發明所提供之保健食品、營養補充食品及特殊營養食品中嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物的含量,較佳為調整至每日應服用的量。
可於本發明保健食品、營養補充食品及/或特殊營養食品之外包裝標示建議使用量、特定族群(例如孕婦、停經後婦女、骨質疏鬆症患者等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項,以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。
本發明亦提供一種用於預防骨質疏鬆症、治療骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼之至少一者的方法,其係包含對一有需要之個體投予一有效量之嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物。有關TCI633菌株及其代謝產物的投予途徑、投予形式、適用劑量及應用,均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明,而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[實驗材料]
實施例所用之材料、試劑、儀器來源如下:
(1)MRS培養液:購自BD,產品編號288130。
(2)X-VIVO 10培養液:購自Lonza公司。
(3)TRIzol®試劑:購自Invitrogen公司。
(4)NanoDrop 1000分光光度計:購自Thermo Fisher Scientific公司。
(5)人類全基因體晶片(Human Whole Genome)OneArray®:購自Phalanx Biotech Group。
(6)DNA微陣列掃描儀:購自Agilent Technologies公司,型號G2505C。
(7)GenePix 4.1軟體:購自Molecular Device公司。
(8)Rosetta Resover System®:購自Rosetta Biosoftware公司。
(9)Alpha-MEM培養液:購自Gibco公司,產品編號12000-022。
(10)FBS:購自Gibco公司。
(11)P/S(Penicillin/Streptomycin):購自Gibco公司。
(12)人RANKL:購自Peprotech公司,產品編號310-01。
(13)人M-CSF:購自Peprotech公司,產品編號300-25。
(14)Actin GreenTM 488 ReadyProbes®試劑:購自Thermo公司,產品編號R37110。
(15)Hoechst 33342染劑:購自Thermo公司,產品編號62249。
[製備實施例]
A.周邊血單核球細胞(PBMC)之獲取
PBMC係存在於周邊血中的免疫細胞。於本製備實施例中,係由健康捐贈者提供周邊血,並從中分離出PBMC。
B.嗜熱鏈球菌TCI633菌株發酵上清液之製備
於37℃之環境下靜置培養,將嗜熱鏈球菌TCI633菌株培養於MRS培養液中15小時後,對該培養液進行離心(轉速:5000rmp/分鐘;時間:40分鐘)以去除大部分之菌體,再以0.2微米濾膜過濾以進一步去除菌體。接著,自前述經離心及濾膜過濾之培養液取出上清液,所得即為嗜熱鏈球菌TCI633菌株之發酵上清液。將該TCI633菌株發酵上清液冷凍保存於-20℃下,以供後續實驗使用。
實施例1:嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物於抑制蝕骨細胞之活化及分化的效果
(1-1)抑制蝕骨細胞活化及分化相關基因之表現
已知CTSK、TRAP、c-FOS、MITF、BLNK、及SYK等基因與蝕骨細胞之活化及分化相關。若可抑制上述基因的表現量,將可抑制蝕骨細胞的活化及分化,從而達到預防及/或治療骨質疏鬆症的功效。
為了解嗜熱鏈球菌TCI633菌株及/或其代謝產物是否具有抑制蝕骨細胞活化及分化之功效,取[製備實施例A]所獲得之PBMC細胞,將其分為四組,並於5%CO2、37℃之條件下進行以下處理:(A)「控制組」:將細胞培養於X-VIVO 10培養液(即,不含TCI633菌株發酵上清液的培養液)中,歷時24小時;(B)「3小時組」:如「控制組」之操作,但於培養21小時之後,加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,繼續培養3小時;(C)「6小時組」:如「控制組」之操作,但於培養18小時之後,加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,繼續培養6小時;以及(D)「24小時組」:如「控制組」之操作,但於培養液中加入[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液,使其於培養液中的最終濃度為2%,以進行培養。
接著,依照TRIzol®試劑製造商的指示,收集上述各組細胞,以進行RNA萃取及純化,其後,使用NanoDrop 1000分光光度計測量所得RNA之OD260/280比值、及OD260/230比值,並進行以下處理:
(1)取1微克之RNA進行反轉錄作用,以合成第一股cDNA(first strand cDNA);
(2)利用步驟1之第一股cDNA合成第二股cDNA,並純化出雙股cDNA;
(3)對步驟2之雙股cDNA進行轉錄作用,以合成經胺基丙烯基修飾之aRNA
(amino Allyl-modifies aRNA),並純化;
(4)以Cy5螢光染劑對經純化之aRNA進行染劑偶合反應(dye coupling reaction),並純化出經螢光標示之aRNA。
(5)使用Phalanx雜交緩衝液、及Phalanx雜交系統,將步驟4之經螢光標示之aRNA雜交至人類全基因體晶片(Human Whole Genome)OneArray®;
(6)在雜交16小時後,將非專一性結合之標的物清洗掉;
(7)使用DNA微陣列掃描儀,掃描晶片;
(8)使用GenePix 4.1軟體,分析各點之Cy5螢光強度;以及
(9)於再現性超過0.975的情況下,重複上述步驟5至8,各單一樣本皆至少重複二次,取螢光強度之平均值並填入Rosetta Resover System®中。
其後,分別記錄各組(包括控制組、3小時組、6小時組、及24小時組)中與蝕骨細胞之活化及分化相關之基因(包括CTSK、TRAP、c-FOS、MITF、BLNK、及SYK)的表現量,並以控制組的基因表現量為基準以標準化各實驗組之基因表現量。結果示於圖1。
由圖1可知,相較於控制組,3小時組、6小時組、及24小時組之CTSK、TRAP、c-FOS、MITF、BLNK、及SYK等基因的表現量皆顯著下降。前述結果顯示,嗜熱鏈球菌TCI633菌株之發酵上清液具有抑制蝕骨細胞之活化及分化的效果,故可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
(1-2)肌動蛋白之表現
已知未分化的PBMC體積較小,且肌動蛋白會表現在整個細胞內,此時若對肌動蛋白進行染色,會見到點狀螢光。PBMC受到蝕骨細胞分化因子刺激後,會彼此融合成體積較大且多核的蝕骨細胞,且肌動蛋白會在細胞邊緣形成明顯環狀構造,此時若對肌動蛋白進行染色則可觀察到環狀螢光。
取[製備實施例A]提供之細胞,將其分成四組,並於5%CO2、37°C之條件下進行以下處理:(A)控制組:將細胞培養於Alpha-MEM培養液中,歷時14天;(B)分化組:如「控制組」之操作,但採用蝕骨細胞分化培養液(即,添加有10%FBS、1xP/S、人RANKL(40奈克/毫升)、及人M-CSF(25奈克/毫升)之Alpha-MEM培養基)以進行培養;(C)空培液組:如「分化組」之操作,但所採用之蝕骨細胞分化培養液係添加有空培液(即,1% MRS培養液);以及(D)上清液組:如「分化組」之操作,但所採用之蝕骨細胞分化培養液係添加有1%[製備實施例B]提供之TCI633菌株發酵上清液。
接著,使用Actin GreenTM 488 ReadyProbes®及Hoechst 33342染劑(1:20000稀釋)對上述各組細胞進行染色,歷時15分鐘。染色結果示於圖2,其中黃色螢光代表肌動蛋白,藍色螢光則代表細胞核。
由圖2可知,分化組中的肌動蛋白分布明顯呈環狀。相較於分化組及空培液組,上清液組中的肌動蛋白分布情形明顯較接近控制組。前述結果顯示,嗜熱鏈球菌TCI633菌株發酵上清液可有效抑制PBMC細胞分化為蝕骨細胞,再次說明嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物可用於預防及/或治療骨質疏鬆症。
由上述實驗結果可知,本發明嗜熱鏈球菌TCI633菌株及其代謝產物確實可有效抑制蝕骨細胞之活化及分化,故可用於預防及/或治療骨質疏鬆症,達到減緩骨質流失、加強骨密度、及/或強化骨骼的效果。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2014/06/23 BCRC 910636。
DE德國 德國國家菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 2013/12/02 DSM 28121。
Claims (5)
- 一種使用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)TCI633菌株發酵上清液於製造一藥劑之用途,其中該藥劑係用於治療骨質疏鬆症,且該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121)。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之活化。
- 如請求項1之用途,其中該藥劑係用於抑制蝕骨細胞之分化。
- 如請求項1至3任一項之用途,其中該藥劑係以口服之劑型提供。
- 一種使用嗜熱鏈球菌TCI633菌株發酵上清液於製造一組成物之用途,其中該嗜熱鏈球菌TCI633菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910636)及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM 28121),且該組成物係用於以下之至少一者:減緩骨質流失、加強骨密度、及強化骨骼。
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Crittenden RG et al., Int J Food Microbiol. 2003 Feb 15;80(3):217-22. |
Probiotics In The Improvement of Bone Density, August 30, 2013 by Lara Swanson.(網址: http://probiotics101.probacto.com/probiotics-in-the-improvement-of-bone-density/) |
Probiotics In The Improvement of Bone Density, August 30, 2013 by Lara Swanson.(網址: http://probiotics101.probacto.com/probiotics-in-the-improvement-of-bone-density/) Crittenden RG et al., Int J Food Microbiol. 2003 Feb 15;80(3):217-22. * |
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