CN101280286A - 第22颗返回式卫星的太空高效微生物菌种及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及空间诱变优良微生物菌种，具体说是一种空间诱变优良微生物菌种及其制备方法与应用。早在十九世纪人们就发现被溶血性链球菌感染的癌症患者肿块自然消退的现象，且发现溶血性链球菌及其制剂有一定的药理活性。本发明利用太空特殊环境，通过搭载第22颗返回式科学与技术试验卫星，将菌株送入太空，遨游一定时间后安全返回，淘汰负向变异菌株，选出性质优良的正向变异菌株进行复筛，最终得到生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、多肽含量高、遗传性质稳定、生产适应性强、具有空间累加效应的优良微生物菌种。应用于工业化生产的生产菌种，具有产量高、用途广、成本低、有效成份含量高等特点。

Description

第22颗返回式卫星的太空高效微生物菌种及制备与应用

技术领域

本发明涉及空间诱变优良微生物菌种，具体说是一种空间诱变优良微生物菌种及其制备方法与应用。

背景技术

微生物是与人类关系密切的一类微小生物体，具有种类的多样性和功能的复杂性。在药物的研发中某些微生物发挥了十分重要的作用，微生物药物的研发主要环节包括菌种的选育，发酵工艺优化，提取与精制工艺的研究等。

早在十九世纪人们就发现被溶血性链球菌感染的癌症患者肿块自然消退的现象，人们先后发现溶血性链球菌及其制剂有一定的药理活性。

浩瀚的太空疆域无垠，有着地面上难以想像的环境条件，在太空环境里，生物的变异与进化要比地面快成千上万倍。因此，太空为发展新物种、新医药等提供了理想的实验场所和生产基地。微生物空间诱变育种是制药工业培育新菌种的一种有效方法。一个优良的菌种可以在不增加或很少增加成本情况下大幅度提高产品的产量和质量。长期以来，我国采取自然选择和理化因素进行微生物育种，得到的育种方法远远不能满足制药工业生产的需要，目前与国际上同类高产菌种相比，其生产效价有很大的差距。该菌种生产周期及发酵周期长，用于工业化生产的产量低，价格昂贵，使用范围小，有效成份含量低。运用空间技术进行微生物诱变育种是培育新生物菌种的一种有效方法，其原理是通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，引起菌种DNA分子的变异和重组，菌种遗传性状发生改变，从而获得生命力旺盛、生长速度快、代谢产物得率高、品质优良并可稳定遗传的高产高效菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一种空间诱变优良微生物菌种及其制备方法与应用，它利用太空特殊环境，通过搭载第22颗返回式科学与技术试验卫星，将菌株送入太空，遨游一定时间后安全返回，淘汰负向变异菌株，选出性质优良的正向变异菌株进行复筛，最终得到生命力旺盛、生长速度快、发酵单位高、发酵周期短、多肽含量高、遗传性质稳定、生产适应性强、具有空间累加效应的优良微生物菌种。应用于工业化生产的生产菌种，具有产量高、用途广、成本低、有效成份含量高等特点。

本发明的技术方案是设计一种空间搭载用于工业生产的优良菌种，其特征是：它将α-溶血链球菌菌种搭载第22颗返回式科学与技术试验卫星，运用空间技术进行微生物诱变育种方法，通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，导致α-溶血链球菌菌种遗传性质发生变异，引起菌种DNA分子的变异和重组，从而获得生命力旺盛、生长速度快、品质优良的菌种，优选出其中的正变异、遗传性质稳定的菌种作为生产菌种，该菌种已于2006年1月18日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1590。

一、ST-22号菌种的筛选

在太空育种中心对搭载菌种进行了反复的培养和筛选，优选出极少量遗传稳定的正变异菌株，进行地面研究：

1.返地后对菌株进行培养和筛选：菌株经过分离培养长出单菌落后进行存活率的计算，有目的地将其编号保存，按照革兰氏染色、菌落形态、色素、菌膜及光泽度等进行形态特征上的对比分析，进一步通过试验，优选出发酵周期缩短24小时的正向突变高产菌株。

2.培养特征的研究：通过培养，研究了太空菌株ST-22号培养基在碳氮比、营养成分、pH、温度、氧需求、发酵周期等方面的适应情况变化，并根据变化及时进行相关生长参数的调整。确定太空菌株培养基成分、运行参数、pH、发酵周期等。

3.生理生化反应：对经航天搭载、太空诱变、地面筛选出的菌株进行细胞形态特征观察及其与地面对照菌株相关生理生化指标的对比观察。生产菌株通过太空搭载，细胞的活性物质增加，细胞生长丰茂饱满，利用糖产酸现象比地面对照菌株有所改变，而地面对照菌株在某些糖的发酵中已失去产酸的能力。

4.代谢产物的测定：用化学法和仪器测试它的主要化学组分及结构有无变化。通过实验检测：发现太空菌株ST-22号仅发酵周期大大缩短，而且其发酵产物比对照组产物含量平均高出三倍以上。

5.遗传性状及蛋白表达的研究：DNA是决定遗传的主要物质，基因是遗传的基本单位。由于基因突变会致使蛋白质的结构改变，最后导致个体性状的差异。因此，我们进行了①α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)16S-23S rDNA间区对比检测，检测结果发现D33和ST22菌株有如下基因位点的差异：

②α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)基因组限制性内切酶酶切差异对比检测，结果通过上述DNA酶切多态性分析，各样品全基因组单酶切差异较大，说明各样品间基因组有多个位点发生基因突变。③α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)全细胞蛋白SDS-PAGE电泳差异对比检测[其中Line1：D33(24h)；Line5：ST22(24h)；Line6：D33(48h)；Line10：ST22(48h)；Line11：D33(72h)；Line15：ST22(72h)]，结果存在明显差异：与同时间D33菌种全细胞电泳比较，ST-22菌株的Line5和Line10在28KD左右有-条明显的条带；而在22KD左右条带缺失。表明经过太空搭载后ST22号菌株与地面株D33号相比，在蛋白表达水平存在较大差异。

6.对选出的高产高效突变菌株ST-22号进行稳定性分析：连续传代试验，发现该菌株发酵周期缩短及发酵产物含量提高两项指标稳定，是可稳定遗传的变异。

7.在培养的基础上，进行小试和中试：在统计的十批实验测定中，实验组ST-22号对数生长期大都提前至24小时左右，而对照菌的对数生长期则仍在48小时左右。发酵产物含量比对照组高出3-5倍(表1)。

表1 ST-22号菌株发酵周期及糖肽肽含量情况

10	102/29	200ml	-	1.9ml	2.6ml	3.9ml	3.8ml	3.4ml
									11	103/30	200ml	-	1.8ml	2.9ml	4.2ml	3.8ml	3.5ml
12	104/31	200ml	-	1.8ml	2.8ml	3.7ml	3.6ml	3.4ml

筛选出的太空菌ST-22号与地面菌的对比特征是：

(一)形态特征、培养特性、生理生化特征的对比

(1)形态特征差异：ST-22菌株细胞呈圆球形或卵圆形，细胞大小为0.7-2.0μm。在液体培养基中以成对或链状出现，无鞭毛，不生芽孢，无荚膜。细胞壁清晰，易着色，细胞生长饱满丰茂，细胞质充足饱满。

D33菌株细胞呈球形或卵圆形，细胞大小为0.6-0.7μm×1.6-1.8μm，细胞生长中度，有的细胞不太饱满。

(2)培养特征的差异：ST-22菌株在血平板或有机物平板上生长饱满丰茂，菌落圆形，较大，有明显突起，表面光滑，杏仁黄色，有光泽，略有粘性，半透明。菌膜生长有厚度，无色素产生。

D33菌株在血平板或有机物平板上菌落圆形，呈现小颗粒状，有突起，光泽略暗，有粘性，半透明，生长中度，菌膜较薄，乳脂色，无色素产生。

(3)生理生化特征差异：(差异较大)

特征                ST-22号          对照菌

60℃生长            +                -

抗60℃30分钟生长    +                -

抗60℃60分钟生长    +                -

2％NaCl生长         +(丰茂)          +(中度)

4％NaCl生长         +(丰茂)          w(微弱)

6.5％NaCl生长       +                -

牛奶胨化            +                -

硝酸盐还原          +                -

10％胆盐生长        +                -

40％胆盐生长        +                -

0.1次甲基蓝生长     +                -

吲哚反应            +                -

利用糖类产酸：

甘露醇              +            -

果糖                +            -

鼠李糖              +            -

棉子糖              +            -

密二糖              +            -

葡萄糖              +            -

阿拉伯糖            +            -

核糖                +            -

菊糖                pH7.5        pH6.7

结果表明：通过返回式科学与技术试验卫星搭载的菌株ST-22号与地面对照菌株的形态特征、生理生化特征等均有明显差异。搭载的菌株细胞的活力增强，细胞的活性物质提高，细胞生长丰茂饱满，生理生化特征的活性比地面对照菌敏感。利用糖，醇产酸现象比地面对照菌丰富。

(二)进行①α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)16S-23S rDNA间区对比检测，检测结果发现D33和ST22菌株有如下基因位点的差异：

②α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)基因组限制性内切酶酶切差异对比检测，结果通过上述DNA酶切多态性分析，各样品全基因组单酶切差异较大，说明各样品间基因组有多个位点发生基因突变。③α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)全细胞蛋白SDS-PAGE电泳差异对比检测[其中Line1：D33(24h)；Line5：ST22(24h)；Line6：D33(48h)；Line10：ST22(48h)；Line11：D33(72h)；Line15：ST22(72h)]，结果存在明显差异：与同时间D33菌种全细胞电泳比较，ST-22菌株的Line5和Line10在28KD左右有一条明显的条带；而在22KD左右条带缺失。表明经过太空搭载后ST22号菌株与地面株D 33号相比，在蛋白表达水平存在较大差异。

结果表明：空间诱变及地面筛选出的ST-22号菌株其基因有变异。

普通α-溶血链球菌菌株经太空搭载诱变，地面上的筛选、分离和纯化后，选育出发酵单位更高、产量更高的高产、优质菌株ST-22号。该突变菌株在遗传上稳定，有较强的生产适应性，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。

二、ST-22号菌株的发酵制备工艺

(一)发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。

1.一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

2.二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐。

(二)提纯过程：

1.发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液。

2.浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。

3.浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空菌ST-22号生产的发酵物。

所述的经太空诱变α-溶血链球菌菌种是α-溶血链球菌ST-22号菌株。

所述的发酵液的制备方法是：优选普通α-溶血链球菌进行太空搭载，经过空间诱变精心筛选培育出α-溶血链球菌ST-22号菌株作为生产菌种；经一级发酵和二级发酵，将发酵液提纯得到的。

所述的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、缓解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、缓解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。

本发明的特点是：将普通α-溶血链球菌菌株搭载第22颗返回式科学与技术试验卫星，利用航天器的工艺余量及它在太空中处于微重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷、剧烈温差、超洁净等太空独有的特殊环境的综合作用，使菌株的DNA双链结构断裂，基因组发生重排，其变异幅度较大，有益变异增多，并可以获得在地面诱变中较难得到的有效的微生物培育。返回地面后，对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中的正变异、遗传特性稳定的菌种，并形成规模化生产。

该菌种由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏单位：西安亨通光华制药有限公司；保藏日期：2006年1月18日，保藏编号为CGMCCNo.1590；

附件材料1：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书原件；

附件材料2：a-溶血链球菌经“第22颗返回式科学与技术试验卫星”航天搭载公证书复印件；

附件材料3：a-溶血链球菌经“第22颗返回式科学与技术试验卫星”搭载菌株与地面对照菌的检测鉴定报告书复印件。

                具体实施方案

空间搭载菌株的准备及搭载

本项目的研究人员采用滤纸条、浸入介质、砂土管等方法，将α-溶血链球菌进行了封装，该菌种装入代号为DZ25的包装袋中，包装袋粘贴有北京市公证处封条，并盖有证据保全印章。二00五年八月二十九日上述菌种被密封装入第22颗返回式科学与技术试验卫星的返回舱内，二00五年八月二十九日十六时四十五分在中国酒泉卫星发射中心由长征二号丁运载火箭发射升空，经过十八天的轨道运行，第22颗返回式科学与技术试验卫星返回舱于二00五年九月十六日十一时二十八分在四川中部地区回收着陆，返回舱于二00五年九月十七日二十时四十分运至中国空间技术研究院。并于二00五年九月十七日二十时四十分在中国空间技术研究院开舱。为使菌种安全顺利、万无一失的运回西安亨通光华制药有限公司，陕西省公安厅出动专门的警车、警员前往北京将搭载菌种直接押运回该公司位于杨凌的特殊太空育种中心。

在太空育种中心对搭载菌种进行了反复的培养和筛选，优选出极少量的正变异菌株。为使这种正向变异更加稳定的遗传，并且能够出现累加优化效应。我们紧接着连续搭载神舟系列飞船及返回式科学与技术实验卫星。在外层空间飞行的菌株被置于一个与地球上生态环境完全不同的特殊环境中(微重力、高真空、高辐射、交变磁场等)，诱发菌株发生变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达等均发生明显的变化。

菌种选育

在太空育种中心对搭载菌种进行了反复的培养和筛选，优选出极少量遗传稳定的正变异菌株，进行地面研究：

(1)返地后对菌株进行培养和筛选：菌株经过分离培养长出单菌落后进行存活率的计算，有目的地将其编号保存，按照革兰氏染色、菌落形态、色素、菌膜及光泽度等进行形态特征上的对比分析，进一步通过试验，优选出发酵周期缩短24小时的正向突变高产菌株ST-22号。

(2)培养特征的研究：通过培养，研究了新菌株ST-22号对培养基在碳氮比、营养成分、pH、温度、氧需求、发酵周期等方面的适应情况变化，并根据变化及时进行相关生长参数的调整。确定ST-22号培养基成分、运行参数、pH、发酵周期等。

(3)生理生化反应：对经航天搭载、太空诱变、地面筛选出的菌株进行细胞形态特征观察及其与地面对照菌株相关生理生化指标的对比观察。生产菌株通过太空搭载，细胞的活性物质增加，细胞生长丰茂饱满，具有α-溶血现象，利用糖产酸现象比地面对照菌株有所改变，而地面对照菌株在某些糖的发酵中已失去产酸的能力及溶血现象。

(4)代谢产物的测定：用化学法和仪器测试它的主要化学组分及结构有无变化。通过实验检测：发现突变菌株ST-22号不仅发酵周期大大缩短，而且其发酵产物比对照组产物含量平均高出3.5倍以上。

(5)遗传性状及蛋白表达的研究：DNA是决定遗传的主要物质，基因是遗传的基本单位。由于基因突变会致使蛋白质的结构改变，最后导致个体性状的差异。因此，我们进行了①α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)16S-23S rDNA间区对比检测，检测结果发现D33和ST22菌株有如下基因位点的差异：

②α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)基因组限制性内切酶酶切差异对比检测，结果通过上述DNA酶切多态性分析，各样品全基因组单酶切差异较大，说明各样品间基因组有多个位点发生基因突变。③α-溶血链球菌(地面株标号为D33号菌株)和太空搭载后筛选菌株(ST22菌株)全细胞蛋白SDS-PAGE电泳差异对比检测[其中Line1：D33(24h)；Line5：ST22(24h)；Line6：D33(48h)；Line10：ST22(48h)；Line11：D33(72h)；Line 15：ST22(72h)]，结果存在明显差异：与同时间D33菌种全细胞电泳比较，ST-22菌株的Line5和Line10在28KD左右有一条明显的条带；而在22KD左右条带缺失。表明经过太空搭载后ST22号菌株与地面株D33号相比，在蛋白表达水平存在较大差异。

(6)对选出的高产高效突变菌株ST-22号进行稳定性分析：连续传代试验，发现该菌株发酵周期缩短及多肽含量提高两项指标稳定，是可稳定遗传的变异。

(7)在培养的基础上，进行小试和中试：在统计的十批实验测定中，实验组ST-22号对数生长期大都提前至24小时左右，而对照菌的对数生长期则仍在48小时左右。发酵产物含量比对照组高出3-5倍。

具体制备工艺

一、太空菌种制备：

以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌ST-22号作为生产菌种。

1.斜面种子制备：

按配比配制斜面培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％；pH 7.0-7.4；斜面培养基经在温度105-125℃，时间20-30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；启封菌种冷冻管，在无菌条件下接入血斜面，接种后置25-40℃恒温培养24-30小时。

2.摇瓶种子液制备：

按配比配制摇瓶培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；摇瓶培养基经在温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后待用；将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入摇瓶种子培养基内，25-40℃恒温培养10-30小时。

二、发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。

1.一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

2.二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐。

三、提纯过程：

1.发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液。

2.浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。

3.浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的发酵物。

上述方法得到的发酵物的检验：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vI E)，比旋度为+70℃至+80℃。

[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后。加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红亚硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0-5.0。

2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D第二法)测定。按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

5、干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIII L)。

6、重金属取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H)含重金属不得过百万分之二十。

7、异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XI C)。按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

发酵物中有效成分含量测定

1.对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50ug。

2.供试品溶液备

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。

3.标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。

4.测定法

精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

免疫原性测定法(补体结合法)；

1、试液

A.酸盐缓冲液(pH7.2)

取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

B.1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。

1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

C.溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液。取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃.30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体：取对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭活)。

抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓中液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

2、免疫原性测定法

取对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml。摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表对照品的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

Claims (3)

1、第22颗返回式卫星的太空高效微生物菌种，其特征在于：将α-溶血链球菌菌种搭载第22颗返回式科学与技术试验卫星，运用空间技术进行微生物诱变育种方法，通过外层空间特殊的物理化学环境，即微重力、强辐射、高能粒子、交变磁场及高真空的环境中，导致α-溶血链球菌菌种遗传性质发生变异，引起菌种DNA分子的变异和重组，从而获得生命力旺盛、生长速度快、品质优良的菌种，优选出其中的正变异、遗传性质稳定的菌种作为生产菌种，该菌种已于2006年1月18日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1590。

2、第22颗返回式卫星的太空高效微生物菌种的制备方法，其特征在于：其制备方法包括筛选、发酵工艺：

一、经太空诱变α-溶血链球菌菌种是α-溶血链球菌ST-22号菌株，以下为ST-22号菌株的筛选：

在太空育种中心对搭载菌种进行的培养和筛选，优选出极少量遗传稳定的正变异菌株，进行地面研究：

返地后对菌株进行培养和筛选：菌株经过分离培养长出单菌落后进行存活率的计算，有目的地将其编号保存，按照革兰氏染色、菌落形态、色素、菌膜及光泽度等进行形态特征上的对比分析，进一步通过试验，优选出发酵周期缩短24小时的正向突变高产菌株。

筛选出的太空菌ST-22号与地面菌、菌株标号为D33号菌株的对比特征是：

(一)形态特征、培养特性、生理生化特征的对比

(1)形态特征差异：ST-22菌株细胞呈圆球形或卵圆形，细胞大小为0.7-2.0μm。在液体培养基中以成对或链状出现，无鞭毛，不生芽孢，无荚膜。细胞壁清晰，易着色，细胞生长饱满丰茂，细胞质充足饱满。

D33菌株细胞呈球形或卵圆形，细胞大小为0.6-0.7μm×1.6-1.8μm，细胞生长中度，有的细胞不太饱满。

(2)培养特征的差异：ST-22菌株在血平板或有机物平板上生长饱满丰茂，菌落圆形，较大，有明显突起，表面光滑，杏仁黄色，有光泽，略有粘性，半透明。菌膜生长有厚度，无色素产生。

D33菌株在血平板或有机物平板上菌落圆形，呈现小颗粒状，有突起，光泽略暗，有粘性，半透明，生长中度，菌膜较薄，乳脂色，无色素产生。

(3)生理生化特征差异较大：

结果表明：通过返回式科学与技术试验卫星搭载的菌株ST-22号与地面对照菌株的形态特征、生理生化特征等均有明显差异。搭载的菌株细胞的活力增强，细胞的活性物质提高，细胞生长丰茂饱满，生理生化特征的活性比地面对照菌敏感。利用糖，醇产酸现象比地面对照菌丰富。

二、ST-22号菌株的发酵制备工艺

(一)发酵过程：

所述发酵过程的发酵培养基是：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；经灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.13Mpa灭菌后备用。

(1).一级发酵罐：

将优良的摇瓶菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入灭菌后的一级发酵罐。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌，在25-40℃恒温培养10-50小时；

(2).二级发酵罐：

将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入灭菌后的二级发酵罐，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；在25-35℃恒温培养50-100小时。灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置后放罐。

(二)提纯过程：

(1).发酵液浓缩：将发酵后的发酵液用浓缩器进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-25，控制pH 7.0-7.4制成发酵浓缩液。

(2).浓缩液的精制提纯：浓缩液按珍珠岩1-2.0％及活性炭2-4.0％加入进行精制提纯，搅拌10-20分钟，过滤后再抽滤提纯，制成发酵精制液。

(3).浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物真空干燥3-8小时，即得到太空菌ST-22号生产的发酵物。

3、第22颗返回式卫星的太空高效微生物菌种的应用，其特征在于：

根据太空菌ST-22号生产的发酵液具有调节免疫力功能、抗肿瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干细胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善记忆功能、缓解视疲劳功能、促进排铅功能、清咽功能、降血压功能、改善睡眠功能、促进泌乳功能、缓解体力疲劳功能、提高缺氧耐受力功能、对辐射危害有保护功能、减肥功能、改善生长发育功能、增加骨密度功能、改善营养性贫血功能、对化学性肝损伤有保护功能、祛痤疮功能、祛黄褐斑功能、改善皮肤水分功能、改善皮肤油份功能、调节肠道菌群功能、促进消化功能、通便功能、对胃粘膜损伤有保护功能等多方面的作用。