CN114292757A - 一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于冠突散囊菌培养领域，具体公开了一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用，所述培养基包含以下重量份的成分：葡萄糖6‑10g/L、蛋白胨2‑8g/L、磷酸二氢钾1‑3g/L、七水硫酸镁0.5‑1.5g/L、氯化钙0.5‑1.5g/L、氯化钠20‑40g/L，进一步的，制备成固体培养基，还包括10‑20g/L的琼脂和1‑2μg/ml氯霉素；本发明的培养基可用于冠突散囊菌分生孢子的纯化培养，茯砖生产过程中接种纯化后的分生孢子，不带其他杂菌，做出的茯砖茶口感更纯，同时由于分生孢子壁较厚，使用分生孢子纯化的菌落，其耐高温能力更强，有利于茯砖接种生产工艺中高温汽蒸时，冠突散囊菌能更好存活。
Description
技术领域
本发明属于冠突散囊菌培养领域，具体公开了一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用。
背景技术
茯砖茶，属黑茶、也称发酵茶始祖。茯砖茶压制要经过原料处理、渥堆发酵、高温汽蒸、压制定型、发花、干燥、成品包装等工序。因为茯砖特有的“发花”工序，除需要很多条件外，一个重要的条件是要求砖体松紧适度，便于微生物的繁殖活动。现代科学研究，并经权威专家通过动物实验、人体临床实验、毒理学研究、安全性评价、流行病学调查表明：茯砖茶“金花”的多种提取成分对PPARγ、PPARδ均有激活作用，“金花”内两种新的活性物质茯茶素A和茯茶素B，具有显著降低人体类脂肪化合物、血脂、血压、血糖、胆固醇等功效。现代科学研究发现“金花”即冠突散囊菌，因此冠突散囊菌的质量、数量决定了茯砖茶产品的品质。
冠突散囊菌属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌,由子囊果和菌丝组成,其从茶叶中获取营养物质,通过自身代谢,产生多种酶催化茶叶中各种物质发生转化,形成了茯砖茶特有的色、香、味品质,故其是评价茯砖茶品质的重要指标。
茯砖生产过程中接种冠突散囊菌的方式理论上是可以大量提升茯砖成品中冠突散囊菌的数量，因此大量科研工作者一直在寻求该技术的突破，但该技术一直是行业技术难题，主要和生产工艺以及冠突散囊菌不耐高温等因素有关，因此解决冠突散囊菌的高温耐受性是非常关键问题。
发明内容
针对上述缺点，本发明公开了一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用，分生孢子由于其结构特性，对高温耐受性较高，本发明利用纯化培养分生孢子获得冠突散囊菌菌落，其对高温耐受性也大大增强，有利于茯砖生产过程中接种冠突散囊菌的增殖。
本发明的技术方案如下：
一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，包含以下重量份的成分：葡萄糖6-10g/L、蛋白胨2-8g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-1.5g/L、氯化钙0.5-1.5g/L、氯化钠20-40g/L。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，还包含10-20g/L的琼脂。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，还包含氯霉素，所述氯霉素浓度为1-2μg/ml。
优选的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，包含以下重量份的成分：葡萄糖8g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氢钾2g/L、七水硫酸镁1g/L、氯化钙1g/L、氯化钠29g/L、琼脂16g/L、氯霉素浓度为1.25μg/ml。
需要指出，冠突散囊菌属于真菌，需要碳源、氮源、大量元素、微量元素，一般是C＞N＞P＞K＞Mg，少量氯化钙是激活冠突散囊菌中部分酶的活性同时对琼脂固定起到一定作用；0.5mol的NaCl溶液(氯化钠相对分子质量是58.5，此处使用29g/L)增加渗透压，促进冠突散囊菌的无性繁殖，同时高渗环境可以抑制冠突散囊菌黏性物质的代谢产生，有利于分散冠突散囊菌和分生孢子；氯霉素主要作用是抑制细菌产生，但氯霉素不能耐受60℃以上的高温，上述培养基能极大提升分生孢子纯化效率，同时也抑制了其他杂菌的生长。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，的制备方法，包括以下步骤：精确称取葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钙、氯化钠和琼脂，加入纯化水定容配置成指定浓度的培养基，灭菌后，降温至45-55℃加入氯霉素溶液，并调节pH为5.5-6.5。
优选的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，的制备方法，包括以下步骤：精确称取葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钙、氯化钠和琼脂，加入纯化水定容配置成指定浓度的培养基，灭菌后，降温至50℃，加入氯霉素溶液，并调节pH为6.0。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，所述应用为用于纯化培养冠突散囊菌分生孢子以提升茯砖成品中冠突散囊菌的数量。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，包含以下步骤：
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：选取黑茯砖茶，经紫外及酒精初步消毒包装表面，然后再无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中，将挑好的培养基放置在生化培养箱中，暗培养；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至权利要求1-3任一项所述的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中，在平板上划线，然后转移至培养箱中暗培养，以上纯化操作重复数次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可完成；
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，取纯化水冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部再收集分生孢子悬浮液，将收集好的分生孢子悬浮液离心，取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再测定分生孢子浓度，吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液置于PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀，将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，暗培养；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况，根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落用于茯砖生产过程中接种冠突散囊菌。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，所述暗培养条件为：27-30℃，培养3-4d。
优选的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，所述暗培养条件为：28.5℃，培养3-4d。
进一步的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，所述步骤3分生孢子悬浮液的制备与收集中，所述纯化水冲洗方法为：将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜，轻轻按压移液枪，使无菌水匀速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次。
进一步优选的，上述用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，包括以下步骤：
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：经紫外及75％酒精初步消毒包装表面。然后在无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中。将挑好的培养基放置在生化培养箱中，设置温度28.5℃，暗培养3-4d；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中(此培养基在本发明中也被命名为阳氏高渗固体培养基)，在平板上划线，然后转移至培养箱中，培养温度为28.5℃，暗培养3-4d。以上纯化操作重复3-5次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可；阳氏高渗固体培养基配方：葡萄糖8g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、七水硫酸镁1g、氯化钙1g、氯化钠29g、琼脂16g、12.5mg/mL氯霉素溶液100μL(固体培养基灭菌后，温度降至50℃左右加入氯霉素溶液)、纯化水1000mL，PH＝6。
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，用200μL的移液枪吸取纯化水，将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜45°，轻轻按压移液枪，使无菌水匀速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次，再收集分生孢子悬浮液。将收集好的分生孢子悬浮液装入1mL的EP管中，放置在离心机中，设置离心力2000g，常温离心3min，用移液枪取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，使用目镜10×，物镜100×,观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再用全自动菌落计数器QXC-30测定分生孢子浓度。吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液200μL，置PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀。将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，设置28.5℃，培养2-4d。；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况。根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落即可。
从上述技术方案可以得出，本发明公开的一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基及其制备方法和应用，具有如下有益效果:
1本发明公开的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，也称“阳氏高渗固体培养基”能极大提升分生孢子纯化效率，同时也抑制了其他杂菌的生长。
2.本发明所述的培养基中，少量氯化钙是激活冠突散囊菌中部分酶的活性同时对琼脂固定起到一定作用；高浓度的NaCl增加渗透压，促进冠突散囊菌的无性繁殖，同时高渗环境可以抑制冠突散囊菌粘着性物质的代谢产生，有利于分散冠突散囊菌和分生孢子。
3.采用发明公开的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基培养，其菌落大小φ3-5cm，生长速度能够达到0.58mm/d，均比对比例用普通PDA培养基培养的冠突散囊菌(菌落φ1-2cm，生长速度0.13mm/d)菌落大，并且生长速度更快，并且本发明培养的冠突散囊菌不黏着在培养基上，菌丝之间分散度高，有利于分生孢子的挑选，同时，使用摇瓶培养液体菌种时，其菌丝分散度高，有利于生产接种。
附图说明
附图1为经过本发明所述的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基筛选培养后得到的冠突散囊菌的照片，左侧为菌落照片，右侧为摇瓶培养的照片；
附图2为全程只采用普通PDA培养基培养的冠突散囊菌的照片，左侧为菌落照片，右侧为摇瓶培养的照片。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：经紫外及75％酒精初步消毒包装表面。然后在无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中。将挑好的培养基放置在生化培养箱中，设置温度27℃，暗培养3-4d；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中(此培养基在本发明中也被命名为阳氏高渗固体培养基)，在平板上划线，然后转移至培养箱中，培养温度为27℃，暗培养3-4d。以上纯化操作重复3-5次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可；阳氏高渗固体培养基配方：葡萄糖6g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钙0.5g、氯化钠20g、琼脂10g、12.5mg/mL氯霉素溶液100μL(固体培养基灭菌后，温度降至45℃加入氯霉素溶液)、纯化水1000mL，PH＝5.5；
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，用200μL的移液枪吸取纯化水，将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜45°，轻轻按压移液枪，使无菌水均速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次，再收集分生孢子悬浮液。将收集好的分生孢子悬浮液装入1mL的EP管中，放置在离心机中，设置离心力1000g，常温离心10min，用移液枪取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，使用目镜10×，物镜100×,观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再用全自动菌落计数器QXC-30测定分生孢子浓度。吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液200μL，置PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀。将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，设置27℃，培养2-4d；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况。根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落即可。
实施例2
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：经紫外及75％酒精初步消毒包装表面。然后在无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中。将挑好的培养基放置在生化培养箱中，设置温度28.5℃，暗培养3-4d；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中(此培养基在本发明中也被命名为阳氏高渗固体培养基)，在平板上划线，然后转移至培养箱中，培养温度为28.5℃，暗培养3-4d。以上纯化操作重复3-5次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可；阳氏高渗固体培养基配方：葡萄糖8g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、七水硫酸镁1g、氯化钙1g、氯化钠29g、琼脂16g、12.5mg/mL氯霉素溶液100μL(固体培养基灭菌后，温度降至50℃左右加入氯霉素溶液)、纯化水1000mL，PH＝6。
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，用200μL的移液枪吸取纯化水，将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜45°，轻轻按压移液枪，使无菌水均速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次，再收集分生孢子悬浮液。将收集好的分生孢子悬浮液装入1mL的EP管中，放置在离心机中，设置离心力2000g，常温离心3min，用移液枪取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，使用目镜10×，物镜100×,观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再用全自动菌落计数器QXC-30测定分生孢子浓度。吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液200μL，置PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀。将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，设置28.5℃，培养2-4d。；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况。根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落即可。结果如附图1所示，采用“阳氏高渗培养基”培养3d，其菌落φ3-5cm，生长速度0.58mm/d，不黏着在培养基上，同时菌丝之间分散度高，有利于分生孢子的挑选，同时摇瓶培养液体菌种其菌丝分散度高，有利于生产接种。
实施例3
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：经紫外及75％酒精初步消毒包装表面。然后在无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中。将挑好的培养基放置在生化培养箱中，设置温度30℃，暗培养3-4d；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中(此培养基在本发明中也被命名为阳氏高渗固体培养基)，在平板上划线，然后转移至培养箱中，培养温度为30℃，暗培养3-4d。以上纯化操作重复3-5次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可；阳氏高渗固体培养基配方：葡萄糖10g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾3g、七水硫酸镁1.5g、氯化钙1.5g、氯化钠40g、琼脂20g、12.5mg/mL氯霉素溶液100μL(固体培养基灭菌后，温度降至55℃加入氯霉素溶液)、纯化水1000mL，PH＝6.5；
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，用200μL的移液枪吸取纯化水，将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜45°，轻轻按压移液枪，使无菌水均速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次，再收集分生孢子悬浮液。将收集好的分生孢子悬浮液装入1mL的EP管中，放置在离心机中，设置离心力5000g，常温离心1min，用移液枪取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，使用目镜10×，物镜100×,观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再用全自动菌落计数器QXC-30测定分生孢子浓度。吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液200μL，置PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀。将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，设置30℃，培养2-4d；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况。根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落即可。
实施例4
对比例
本对比例基本操作同实施例2，只是步骤2不使用阳氏高渗固体培养基筛选，只选用普通PDA培养基；结果如附图2所示，培养的冠突散囊菌菌落颜色外圈偏白，内圈颜色浅黄，培养3d，菌落φ1-2cm，生长速度0.13mm/d，黏着在PDA培养基表面，不易分离，同时摇瓶培养的液体菌种其菌丝体缠绕成球，不利于生产接种。
综合以上实施例1-4可知，本发明公开的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，也称“阳氏高渗固体培养基”能极大提升分生孢子纯化效率，同时也抑制了其他杂菌的生长。并且本培养培养的冠突散囊菌不黏着在培养基上，菌丝之间分散度高，有利于分生孢子的挑选，同时，使用摇瓶培养液体菌种时，其菌丝分散度高，有利于生产接种。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，其特征在于，包含以下重量份的成分：葡萄糖6-10g/L、蛋白胨2-8g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、七水硫酸镁0.5-1.5g/L、氯化钙0.5-1.5g/L、氯化钠20-40g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，其特征在于，还包含10-20g/L的琼脂。
3.根据权利要求1所述的一种用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基，其特征在于，还包含氯霉素，所述氯霉素浓度为1-2μg/ml。
4.如权利要求1-3任一项所述的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的制备方法，包括以下步骤：精确称取葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钙、氯化钠和琼脂，加入纯化水定容配置成指定浓度的培养基，灭菌后，降温至45-55℃加入氯霉素溶液，并调节pH为5.5-6.5。
5.如权利要求1-3任一项所述的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养的培养基的应用，其特征在于，所述应用为用于纯化培养冠突散囊菌分生孢子以提升茯砖成品中冠突散囊菌的数量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包含以下步骤：
1)、初代冠突散囊菌的分离和培养：选取黑茯砖茶，经紫外及酒精初步消毒包装表面，然后在无菌条件下，用镊子从茯砖中挑取颜色金黄，菌落形态饱满，无杂色的冠突散囊菌菌落至PDA培养基中，将挑好的培养基放置在生化培养箱中，暗培养；
2)、冠突散囊菌纯化：无菌条件下，挑取无杂菌、颜色金黄的初代冠突散囊菌落至权利要求1-3任一项所述的用于冠突散囊菌分生孢子纯化培养基中，在平板上划线，然后转移至培养箱中暗培养，以上纯化操作重复数次，观察其子代冠突散囊菌菌落，颜色呈纯橙黄色，菌丝体健壮且呈茸状，背部菌落无杂色即可完成；
3)、分生孢子悬浮液的制备与收集：在无菌条件下，取纯化水冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部再收集分生孢子悬浮液，将收集好的分生孢子悬浮液离心，取上清液保存备用；
4)、分生孢子的培养：将上清液置于显微镜下，观察收集的上清液，确认收集到的是分生孢子且不带杂质，再测定分生孢子浓度，吸取分生孢子浓度大于1.0×103cfu/mL的分生孢子液置于PDA固体培养基中，用涂布棒涂布均匀，将涂布好的冠突散囊菌分生孢子放置在生化培养箱中，暗培养；
5)、分生孢子菌落的筛选：培养完成后，观察PDA培养基中的分生孢子菌落情况，根据菌株筛选色泽金黄，无杂菌，且生长速度大于0.4mm/d的分生孢子菌落用于茯砖生产过程中接种冠突散囊菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述暗培养条件为：27-30℃，培养3-4d。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤3分生孢子悬浮液的制备与收集中，所述纯化水冲洗方法为：将冠突散囊菌固体培养基平板倾斜，轻轻按压移液枪，使无菌水匀速冲洗冠突散囊菌菌丝体顶部1-2mm处，冲洗6-10次。
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