CN106318877A - 一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法 - Google Patents

一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，包括以下步骤：(1)制备平板固态培养基；(2)接种；(3)将接种后的平板固态培养基置于培养箱中进行培养；(4)转接至按步骤(1)新做的平板固态培养基上；(5)重复步骤(3)、(4)两至四次，直到得到冠突散囊菌纯菌落，则得到纯化后的冠突散囊菌；(8)待需要时将步骤(7)所得菌种置于温度为25‑30℃的培养箱中培养4‑7天。本发明在人为干预下突破冠突散囊菌原本的地域及环境生长限制，实现不分地域、不分环境的人工大量培养，为将冠突散囊菌接种到其它茶叶或产品上进行发酵生产其它类型产品提供了技术支持，也为单纯培养冠突散囊菌以获取其中有益成分提供了方法。

Description

一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法
技术领域
本发明属于冠突散囊菌培养领域，涉及一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法。
背景技术
当今社会，经济飞速发展，而主导经济发展的工业给人们赖以生存的环境冠突散囊菌作为一种散囊菌属的真菌，又称“金花”菌，因其主要在茯茶发酵过程产生大量金黄色的闭囊壳而得名。
长期以来，茯砖茶生产主要依靠自然发酵，以最终得到成品，对生产环境、产地等有严格的要求，因此茯砖茶的生产受到极大的限制，通过人工接种冠突散囊菌至茯砖茶及控制发酵条件可以有效突破传统茯砖茶生产的限制。
申请号为201010598201.8的发明专利提供了一种冠突散囊菌的快速分离方法，首先将成品茯砖茶粉碎，然后配成悬浮液后涂布平板，这种方法操作不够简便，且茶渣与冠突散囊菌闭囊壳混合物制得的悬浮液，染杂菌风险较高。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，提供一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法。
本发明通过下述方案实现：
一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，包括以下步骤：
(1)制备平板固态培养基；
(2)接种：用接种环或其它灭过菌的细签挑取茯砖茶中的“金花”生长茂盛的区域“金花”接种至步骤(1)中所得到的平板固态培养基；
(3)将接种后的平板固态培养基置于温度为25-30℃的培养箱中进行培养；
(4)待7-12天后平板固态培养基表面的冠突散囊菌菌落可辨时，在无菌环境中用接种环挑取用点接法或划线法转接至按步骤(1)新做的平板固态培养基上；
(5)重复步骤(3)、(4)两至四次，直到得到冠突散囊菌纯菌落，则得到纯化后的冠突散囊菌；
(6)将步骤(1)制备的平板固态培养基加热至60-80℃将其含有的琼脂熔化，分装到试管中，装量约试管体积的1/3处，灭菌之后将试管斜放待其冷却制成斜面培养基；
(7)将步骤(5)中所得纯化后的冠突散囊菌的菌落转接至斜面培养基中，在25-30℃培养箱中培养4-7天，每天观察，生长出菌落后置于冰箱中4℃保存，备用；
(8)待需要时将步骤(7)所得菌种置于温度为25-30℃的培养箱中培养4-7天，每天观察生长情况，待菌落生长良好时接种到平板固态培养基中扩大培养，备用；
(9)配制液态的察氏培养基，初始pH调节至5.8左右，将所述液态的察氏培养基分装至锥形瓶并灭菌，灭菌完成后冷却；
(10)每天观察步骤(8)平板固态培养基中菌落生长情况，待长势良好时用接种环挑取接种至步骤(9)所得液态的察氏培养基中；
(11)将步骤(10)已接种的液态的察氏培养基置于摇床中振摇培养，温度为25-32℃，转速100-150r/min；培养10-20天；
(12)继续培养至液态的察氏培养基逐渐变得浑浊，在液态的察氏培养基变为黄色之后，变得浑浊之前，在无菌环境中用多层纱布或60-120目滤布过滤，取滤液转接至步骤(9)所得的新的液态的察氏培养基中；
(13)将步骤(12)已接种的液态的察氏培养基系置于摇床中继续振摇培养，温度25-32℃，转速100-150r/min；培养2-5天，有大量细小白色菌丝团生长出，培养5-10天液态的察氏培养基开始变成黄色，继续培养，液态的察氏培养基颜色变深，向橙色转变，则液态扩大培养成功。
在所述步骤(1)中，所述平板固态培养基是将察氏培养基灭菌、分装于培养皿中、平放于水平台面、冷却固化后制得。
在所述步骤(12)中，所述所取的滤液与液态的察氏培养基的体积比1∶5-20。
本发明方法的有益效果为：
本发明是一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法在人为干预下突破冠突散囊菌原本的地域及环境生长限制，实现不分地域、不分环境的人工大量培养，为将冠突散囊菌接种到其它茶叶或产品上进行发酵生产其它类型产品提供了技术支持，也为单纯培养冠突散囊菌以获取其中有益成分提供了方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，包括以下步骤：
(1)制备平板固态培养基；
(2)接种：用接种环或其它灭过菌的细签挑取茯砖茶中的“金花”生长茂盛的区域“金花”接种至步骤(1)中所得到的平板固态培养基；在实际使用中可以用75％酒精消毒的牙签挑取陕西产茯砖茶中生长茂盛区域“金花”接种。
(3)将接种后的平板固态培养基置于温度为25-30℃的培养箱中进行培养；
(4)待7-12天后平板固态培养基表面的冠突散囊菌菌落可辨时，在无菌环境中用接种环挑取用点接法或划线法转接至按步骤(1)新做的平板固态培养基上；
(5)重复步骤(3)、(4)两至四次，直到得到冠突散囊菌纯菌落，则得到纯化后的冠突散囊菌；
(6)将步骤(1)制备的平板固态培养基加热至60-80℃将其含有的琼脂熔化，分装到试管中，装量约试管体积的1/3处，灭菌之后将试管斜放待其冷却制成斜面培养基；
(7)将步骤(5)中所得纯化后的冠突散囊菌的菌落转接至斜面培养基中，在25-30℃培养箱中培养4-7天，每天观察，生长出菌落(肉眼可见)后置于冰箱中4℃保存，备用；
(8)待需要时将步骤(7)所得菌种置于温度为25-30℃的培养箱中培养4-7天，每天观察生长情况，待菌落生长良好时接种到平板固态培养基中扩大培养，备用；
(9)配制液态的察氏培养基，初始pH调节至5.8左右，将所述液态的察氏培养基分装至锥形瓶并灭菌，灭菌完成后冷却；
(10)每天观察步骤(8)平板固态培养基中菌落生长情况，待长势良好时用接种环挑取接种至步骤(9)所得液态的察氏培养基中；
(11)将步骤(10)已接种的液态的察氏培养基置于摇床中振摇培养，温度为25-32℃，转速100-150r/min；培养10-20天；
(12)继续培养至液态的察氏培养基逐渐变得浑浊，在液态的察氏培养基变为黄色之后，变得浑浊之前，在无菌环境中用多层纱布或60-120目滤布过滤，取滤液转接至步骤(9)所得的新的液态的察氏培养基中；
(13)将步骤(12)已接种的液态的察氏培养基系置于摇床中继续振摇培养，温度25-32℃，转速100-150r/min；培养2-5天，有大量细小白色菌丝团生长出，培养5-10天液态的察氏培养基开始变成黄色，继续培养，液态的察氏培养基颜色变深，向橙色转变，则液态扩大培养成功。培养2-5天，每天观察，可发现有大量细小白色菌丝团生长出，培养5-10天培养液开始变成黄色，再之后，颜色变深，向橙色转变，则液态扩大培养成功。
在所述步骤(1)中，所述平板固态培养基是将察氏培养基灭菌、分装于培养皿中、平放于水平台面、冷却固化后制得。
在所述步骤(12)中，所述所取的滤液与液态的察氏培养基的体积比1∶5-20。
本发明中的液态的察氏培养基包括蒸馏水水，将NaNO3、K2HPO3、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4、蔗糖、琼脂等，其具体的组成和配置方法为现有公知技术，在此不再赘述。本发明中的“金花”即为茯砖茶中的冠突散囊菌菌群。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备平板固态培养基；
(2)接种：用接种环或其它灭过菌的细签挑取茯砖茶中的“金花”生长茂盛的区域“金花”接种至步骤(1)中所得到的平板固态培养基；
(3)将接种后的平板固态培养基置于温度为25-30℃的培养箱中进行培养；
(4)待7-12天后平板固态培养基表面的冠突散囊菌菌落可辨时，在无菌环境中用接种环挑取用点接法或划线法转接至按步骤(1)新做的平板固态培养基上；
(5)重复步骤(3)、(4)两至四次，直到得到冠突散囊菌纯菌落，则得到纯化后的冠突散囊菌；
(6)将步骤(1)制备的平板固态培养基加热至60-80℃将其含有的琼脂熔化，分装到试管中，装量约试管体积的1/3处，灭菌之后将试管斜放待其冷却制成斜面培养基；
(7)将步骤(5)中所得纯化后的冠突散囊菌的菌落转接至斜面培养基中，在25-30℃培养箱中培养4-7天，每天观察，生长出菌落后置于冰箱中4℃保存，备用；
(8)待需要时将步骤(7)所得菌种置于温度为25-30℃的培养箱中培养4-7天，每天观察生长情况，待菌落生长良好时接种到平板固态培养基中扩大培养，备用；
(9)配制液态的察氏培养基，初始pH调节至5.8左右，将所述液态的察氏培养基分装至锥形瓶并灭菌，灭菌完成后冷却；
(10)每天观察步骤(8)平板固态培养基中菌落生长情况，待长势良好时用接种环挑取接种至步骤(9)所得液态的察氏培养基中；
(11)将步骤(10)已接种的液态的察氏培养基置于摇床中振摇培养，温度为25-32℃，转速100-150r/min；培养10-20天；
(12)继续培养至液态的察氏培养基逐渐变得浑浊，在液态的察氏培养基变为黄色之后，变得浑浊之前，在无菌环境中用多层纱布或60-120目滤布过滤，取滤液转接至步骤(9)所得的新的液态的察氏培养基中；
(13)将步骤(12)已接种的液态的察氏培养基系置于摇床中继续振摇培养，温度25-32℃，转速100-150r/min；培养2-5天，有大量细小白色菌丝团生长出，培养5-10天液态的察氏培养基开始变成黄色，继续培养，液态的察氏培养基颜色变深，向橙色转变，则液态扩大培养成功。
2.根据权利要求1所述的一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述平板固态培养基是将察氏培养基灭菌、分装于培养皿中、平放于水平台面、冷却固化后制得。
3.根据权利要求1所述的一种从茯砖茶中分离、纯化冠突散囊菌及其液态培养方法，其特征在于：在所述步骤(12)中，所述所取的滤液与液态的察氏培养基的体积比1∶5-20。
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