CN102742454B - 一种人工培养长座虫草子实体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工培养长座虫草子实体的方法。所用菌种为长座虫草无性型-长座被毛孢（Hirsutellalongissima），其具体培养步骤如下：A.斜面试管菌种活化培养；B.液体摇瓶种子培养；C.菌丝阶段培养；D.子实体培养。人工培养的长座虫草子实体子座棒状，单生或分枝，肉桂色，长度1～7cm，直径1～3mm，子实体培养后期在子座顶端或侧面会生出大量白色孢梗束，致密。本发明为首创，利用该方法可以大规模地进行长座虫草子实体的培养，不仅解决了野生长座虫草资源的匮乏，而且为将来长座虫草药食用价值的综合开发和工厂化生产奠定基础和提供技术保障。本发明生产工艺简单、成本低、原料来源广泛、无毒、无污染，可大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于药用真菌的人工培养方法技术领域，具体涉及用长座被毛孢（Hirsutellalongissima）菌种进行培养形成长座虫草子实体。
背景技术
泛义的虫草是一大类昆虫病原真菌，它包含了四个属，这些真菌主要寄生于昆虫、蜘蛛和某些大团囊菌的某些地下种类的子实体上，利用寄主的营养完成其生活史的虫菌复合体。它是一类复型真菌，在其生活史中有产生分生孢子的无性阶段和产生子囊孢子的有性阶段。虫草类真菌含有多种生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗病原、抗氧化、抗辐射、杀虫、钙离子拮抗及增强人体免疫功能等功能，它们在医药、农业、食品工业及现代生物技术的应用中皆有十分重要的意义。冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis、蝉花Paecilomyces cicadae、大团囊虫草Elaphocordyceps ophioglossoides、蛹虫草Cordycepsmilitaris和古尼虫草C.gunnii是其中几种著名的虫草类真菌，具有较高的食药用价值。
研究虫草子实体的人工培养，不仅对于确定虫草无性型和有性型的对应关系以及在人为控制条件下研究虫草的分化具有重要的理论意义，而且为人工驯化并开发冬虫夏草、蝉花等药用价值真菌提供了宝贵的资源，因此受到广泛关注。然而目前有关成功培养虫草子实体的报道并不多，尤其是能进行大规模生产并申请专利的虫草只局限于少数几种，如蛹虫草、蝉花、台湾虫草等。
长座虫草Ophiocordyceps longissima(Kobayasi)是寄生于同翅目蝉若虫上的一类重要的虫生真菌，主要分布于中国、日本和韩国。长座虫草于1963年首次在日本被发现并命名。1999年，李春如等在我国安徽省霍山县首次采到此长座虫草，经鉴定，其无性型为长座被毛孢Hirsutella longissima Li et al.新种，并在人工培养基上培养出了近成熟的子座和孢梗束。野生长座虫草在野外经常有被动物啃食的现象，推测其可能具有食用价值。目前，关于长座虫草的研究报道很少。本实验室在其成分、药理、毒理方面做了一系列研究，研究结果会陆续报道。长座虫草可能作为一种潜在的食药用真菌进行开发。
目前，国内外还没有关于长座虫草子实体培养方法的报道与专利，加之野生长座虫草资源也较少，所以人工培养其子实体是解决开发利用该资源这一问题的有效途径之一。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种人工培养长座虫草子实体的方法，具体来说是利用其无性型-长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌株，经过液体培养和固体基质培养诱导出子实体，为将来大规模培养和开发利用长座虫草提供了技术参数并奠定了良好的基础。
实现上述目的具体技术解决方案如下：
本发明所用的长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年03月 02日，保藏编号CGMCC No.5826。
人工培养长座虫草子实体的具体操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌种点接于斜面试管培养基，温度25℃培养10～15d，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料和重量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1000ml，自然pH；
B、液体摇瓶种子培养
在250ml容器中装入100ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养10d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子扩大培养：在500ml容器中装入200ml液体摇瓶种子培养基，高温高压灭菌，待自然冷却至室温，用高速匀浆器将所述液体摇瓶种子打散，接种到500ml容器的液体摇瓶种子培养基中，每瓶接种量为20ml，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养9d，得到扩大培养的液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基的原料和重量为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至1000ml，自然pH；
C、菌丝培养
在400ml容器中加入20g小麦片，按料液比1:2的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃高温灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；用高速分散器将扩大培养的液体摇瓶种子打散，作为种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量为9ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，温度25℃，培养10～15d，菌丝培养阶段，需保持黑暗条件，使菌丝铺满固体培养基表面；子实体栽培营养液的原料和重量为：马铃薯200g、黄粉虫粉100g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 280mg·L-1、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml，pH6；
D、子实体培养
将菌丝铺满固体培养基表面的容器置于温度为25±1℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段保证连续的光照，光照强度为1～200lux，光照时间24h；在子实体基本长满罐头培养瓶，几乎不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的长座虫草子实体；人工培养的长座虫草的子实体有时混有大量白色孢梗束，子实体致密，子座棒状，单生或分枝，肉桂色，高约1～7cm，直径1～3mm；孢梗束丛生，致密，白色或白色略带微红色；在子实体培养后期，子座顶部或侧面也会生出大量白色孢梗束。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明首创了人工培养长座虫草子实体的方法，利用该方法可以大规模地进行长座虫草子实体的培养，不仅解决了野生长座虫草资源的匮乏，而且为将来长座虫草的药食用价值探索、综合开发利用奠定了坚实的基础；
2.本发明采用长座虫草的无性型-长座被毛孢（Hirsutella longissima）作为子实体栽培菌株，可以有效保留优良菌株的特性；采用对数生长期的液体摇瓶种子接种，子实体生长快、产量高；用无毒的罐头瓶和耐高温聚丙烯膜生产保证其安全性；
3.本发明生产工艺简单、成本低、原料来源广泛、无毒、无污染，可大规模生产，为将来长座虫草药食用价值的开发利用提供了宝贵的资源；
4.本发明的子实体可以根据市场需求制成各种形态的产品，既可以将子实体制成有效成分易溶的颗粒体，又可经过处理制成胶囊，便于商品化销售。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例：
长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌种的获得可以通过野外采集成熟的长座虫草，收集弹射的子囊孢子，转移至无菌的培养基上分离纯化而得，也可以将野生长座虫草内菌核、子座柄部或可孕部分经表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得。本发明所用的长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.5826。
长座虫草子实体的具体培养操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌种点接于斜面试管培养基，25℃培养10～15d，得到斜面菌种。斜面试管培养基的原料和重量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1000ml，自然pH；
B、液体摇瓶种子培养
在250ml三角瓶中装入100ml液体摇瓶种子培养基，在121℃高温、1×105Pa高压下灭菌20min，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养10d，得到液体摇瓶种子。液体摇瓶种子扩大培养：在500ml三角瓶中装入200ml液体摇瓶种子培养基，在121℃高温、1×105Pa高压下灭菌20min，待自然冷却至室温，用高速匀浆器将所述液体摇瓶种子打散，用移液枪接种到500ml三角瓶的液体摇瓶种子培养基中，每瓶接种量为20ml，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养9d，得到扩大培养的液体摇瓶种子。液体摇瓶种子培养基的原料和重量为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至1000ml，自然pH；
C、菌丝培养
在400ml干净的罐头培养瓶中加入20g小麦片，按料液比1:2的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，用耐高温聚丙烯封口膜覆盖，并用皮筋扎紧封口，浸泡2小时，温度121℃高温灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；用高速分散器将扩大培养的液体摇瓶种子打散，将扩大培养的液体摇瓶种子接种到固体培养基上，每瓶接种量为9ml；紧密封口，外面用黑色塑料袋包裹，置于25℃的人工气候箱中，温度25℃，培养10～15d，菌丝培养阶段，需保持黑暗条件，使菌丝铺满固体培养基表面；子实体栽培营养液的原料和重量为：马铃薯200g、黄粉虫粉100g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 280mg·L-1、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml，pH6；
D、子实体培养
将菌丝铺满固体培养基表面的罐头培养瓶置于温度为25±1℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段打开培养室光源，撤去黑色塑料袋，保证连续的光照，光照强度为1～200lux，光照时间24h；在子实体基本长满罐头培养瓶，几乎不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的长座虫草子实体。人工培养的长座虫草的子实体有时混有大量白色孢梗束，子实体致密，子座棒状，单生或分枝，肉桂色，高约1～7cm，直径1～3mm；孢梗束丛生，致密，白色或白色略带微红色；在子实体培养后期，子座顶部或侧面也会生出大量白色孢梗束。
Claims (1)
1.一种人工培养长座虫草子实体的方法，其特征在于：使用的长座被毛孢（Hirsutellalongissima）菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.5826；具体培养操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将长座被毛孢（Hirsutella longissima）菌种点接于斜面试管培养基，温度25℃培养10～15d，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料和重量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1000ml，自然pH；
B、液体摇瓶种子培养
在250ml容器中装入100ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养10d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子扩大培养：在500ml容器中装入200ml液体摇瓶种子培养基，高温高压灭菌，待自然冷却至室温，用高速匀浆器将所述液体摇瓶种子打散，接种到500ml容器的液体摇瓶种子培养基中，每瓶接种量为20ml，在温度25±1℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温振荡培养9d，得到扩大培养的液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基的原料和重量为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至1000ml，自然pH；
C、菌丝培养
在400ml干净的罐头培养瓶中加入20g小麦片，按料液比1:2的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃高温灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；用高速分散器将扩大培养的液体摇瓶种子打散，作为种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量为9ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，温度25℃，培养10～15d，菌丝培养阶段，需保持黑暗条件，使菌丝铺满固体培养基表面；
子实体栽培营养液的原料和重量为：马铃薯200g、黄粉虫粉100g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B280mg·L-1、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml，pH6；
D、子实体培养
将菌丝铺满固体培养基表面的罐头培养瓶置于温度为25±1℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段保证连续的光照，光照强度为1～200lux，光照时间24h；在子实体基本长满罐头培养瓶，几乎不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的长座虫草子实体；人工培养的长座虫草的子实体有时混有大量白色孢梗束，子实体致密，子座棒状，单生或分枝，肉桂色，高1～7cm，直径1～3mm；孢梗束丛生，致密，白色或白色略带微红色；在子实体培养后期，子座顶部或侧面也会生出大量白色孢梗束。
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