CN102138437A - 一种人工培养台湾虫草子实体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人工培养台湾虫草子实体的方法。所用菌种为黄山被毛孢Hirsutellahuangshanensis，具体培养操作步骤如下：A、斜面试管菌种活化培养，B、液体摇瓶种子培养，C、菌丝培养，D、子实体培养，得到人工培养的台湾虫草子实体，人工培养的台湾虫草子实体呈棒状，橙黄色或橙红色，长度和大小与野生台湾虫草类似。本发明为首创，利用该方法可以顺利地进行台湾虫草子实体的培养，解决了野生台湾虫草资源的匮乏，为台湾虫草的综合开发、工厂化生产、药用、食用和进一步的活性成分分析与提取分离开辟广阔前景。本发明生产工艺简单、成本低，原料来源广泛，无污染，可大规模生产。

Description

一种人工培养台湾虫草子实体的方法
技术领域
本发明属于药用真菌的人工培养方法技术领域，具体涉及用黄山被毛孢菌种（Hirsutella huangshanensis）进行斜面培养、摇瓶培养和固体培养形成台湾虫草子实体。
背景技术
虫草属真菌是一大类重要的昆虫病原真菌，本属真菌主要寄生于昆虫、蜘蛛和某些大团囊菌属Elaphomyces Nees & Fr.的某些地下种类的子实体上。绝大多数能感染昆虫，并从其头部或体表长出子座体而构成虫、菌复合体即虫草。虫草属真菌感染寄主昆虫使其僵化，在适宜的条件下从感染僵虫上长出子座，从而形成具有虫（僵虫）草（真菌子座）复合体这一特定形态的子实体结构。
虫草属真菌具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗病原、抗氧化、抗辐射、杀虫、钙离子拮抗及增强人体免疫功能等功能，它们在医药、农业、食品工业及现代生物技术的应用中皆有十分重要的意义。其中冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）、蝉花（Cordyceps cicadae）、古尼虫草（Cordyceps gunnii）、高雄山虫草（Cordyceps takaomontana）是其中几种著名的虫草。
台湾虫草(Cordyceps formosana Kobayasi & Shimizu)于1981年首次在台湾被发现，中国大陆也有报道。隶属于真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属真菌。台湾虫草的寄主为一种鞘翅目昆虫的幼虫。李春如等在安徽省黄山风景区采集到台湾虫草(C. formosana)，多批次收集弹射的子囊孢子分离得到其无性型，经鉴定为一种被毛孢。命名为黄山被毛孢(Hirsutella huangshanensis)。经初步研究发现，台湾虫草具有清除自由基、具有较强抗肿瘤CHO细胞活性、较强的免疫活性。此外子实体提取物中含有甘露醇、醌茜素、油酸、麦角醇等生物活性成分。鉴于此，人工培养的台湾虫草子实体可能用于新药的开发，也可用于药膳和保健品，故有较大的开发应用前景。
虫草是子囊菌中一大类寄生在昆虫和少数其他真菌子实体上的真菌。其中一些种生活史中可以在天然有机体和人工培养基上营腐生生活，因此可用适当的方法进行人工培养。人工培养虫草的研究已有多年的历史，随着对虫草应用研究的不断深入和虫草食用与药用价值不断提高，对人工培养虫草的研究越来越多，但目前有关对虫草子实体的人工培养成功的报道不多，在固体培养基和液体培养基或寄主昆虫上培育出十几种虫草，其中有关冬虫夏草和蛹虫草的报道最多。目前只有蛹虫草能进行大规模人工培养，如中国CN20061007、ZL99124200.9都是关于蛹虫草的发明专利。
目前国内外还没有有关台湾虫草子实体培养方法的报道与专利，此外，野生台湾虫草资源也较少，所以实现人工培养其子实体是开发利用该资源首要并迫切需要解决的问题。
如今，由于人类对自然环境的破坏和对野生虫草的滥采滥挖，导致野生资源越来越少，采集野生台湾虫草比较困难，因此人工培养其子实体成为保护这种资源的迫切愿望。人工培育虫草子实体可得到药材或保健食品的原料，进而分离其有效活性成分。在学术上也有重要意义，可依此判断无性型分离是否正确，在分类、遗传育种等领域具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种人工培养台湾虫草子实体的方法，具体来说是选用黄山被毛孢（Hirsutella huangshanensis）菌种，进行菌种培养和固体基质培养生长出子实体，为大规模人工培养台湾虫草创造新前景。
实现上述目的具体技术解决方案如下：
一种人工培养台湾虫草子实体的方法包括菌种的获得，黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种的获得可以通过野外采集成熟的台湾虫草，收集弹射的子囊孢子，转移至无菌的培养基上分离纯化而得，或将子座部分经表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得菌种。
台湾虫草子实体的具体培养操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种接种于斜面试管培养基，温度25℃培养10d，待菌丝长满试管并产孢，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5；
B、液体摇瓶种子培养
在500ml三角瓶中装入200ml摇瓶种子培养基，在121℃高温高压（1 × 105Pa）下灭菌30min，待自然冷却至室温时，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、120r/min条件下恒温振荡培养，培养时间为10～15d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基原料的重量配比为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 4片·L-1（70mg/片）、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克；
C、菌丝培养
在350ml干净的罐头瓶中加入20g大米，按料水比1:1.8～1:2.0的比例加入罐头瓶固体菌丝培养液，pH值为4～6，搅拌均匀，用耐高温聚丙烯封口膜覆盖，外边用报纸包扎好，浸泡2小时，在121℃高温灭菌30min，自然冷却，得到大米培养基；在无菌条件下，用高速分散器将液体摇瓶种子打散，将液体摇瓶种子接种到大米培养基上，每瓶大米培养基中的接种量为10ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，菌丝培养阶段，需保持黑暗条件；温度25℃，相对湿度在50％～60％，培养30～40d，使菌丝铺满罐头培养瓶；
罐头瓶固体菌丝培养液为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 4片·L-1（70mg/片）、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克；
D、子实体培养
将罐头培养瓶置于湿度70％～80％、温度25±1℃条件下的人工气候箱中培养；在子实体培养阶段打开培养箱光源，保证有充足的光照，光照强度为1500lux，光照时间12h光照12h或黑暗交替进行；在子实体基本长满瓶，不再生长时并保持健壮的时候即得到人工培养的台湾虫草子实体，人工培养的台湾虫草子实体呈棒状，橙黄色或橙红色，长度和大小与野生台湾虫草类似。
本发明所用的黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种，已于2010年9月13日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No 4147。
本发明首创了人工培养台湾虫草子实体的方法，利用该方法可以顺利地进行台湾虫草子实体的培养，解决了野生台湾虫草资源的匮乏，为台湾虫草的综合开发、工厂化生产、药用、食用和进一步的活性成分分析与提取分离开辟广阔前景。
本发明采用台湾虫草的真正无性型黄山被毛孢，可以有效保留优良菌株的特性，用液体种子接种罐头瓶，培养的子实体生长快，产量高。用无毒的罐头瓶生产保证其安全性。
本发明生产工艺简单、成本低，原料来源广泛，无污染，可大规模生产，为大众提供健康优质的药用和食用资源。
本发明的子实体可以根据市场需求制成各种形态的产品，既将子实体可以制成有效成分易溶的颗粒体，又可经过处理制成胶囊，便于商品化销售。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1：
黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种的获得可以通过野外采集成熟的台湾虫草，收集弹射的子囊孢子，转移至无菌的培养基质上分离纯化而得，或将子座部分经表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得菌种。本发明所用的黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 4147。
人工培养台湾虫草子实体方法的具体生产操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种接种于斜面试管培养基，温度25℃培培养10d，待菌丝长满试管并产孢，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5。
B、液体摇瓶种子培养
在500ml三角瓶中装入200ml摇瓶种子培养基，在121℃高温高压（1 × 105Pa）下灭菌30分钟，待冷却至室温时，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、120r/min条件下恒温振荡培养，培养时间为10～15d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基原料的重量配比为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g ，复合维生素B 4片（70mg/片），柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克。
C、菌丝培养
在350ml干净的罐头瓶中加入20g优质大米，按料水比1:2.0的比例在罐头瓶中加入固体菌丝营养培养液，pH值为6，搅拌均匀，用耐高温聚丙烯封口膜覆盖，外边再用报纸包扎好，浸泡2h后，在121℃高温灭菌30min，自然冷却，得到大米培养基；在无菌条件下，用高速分散器将液体摇瓶种子打散，将液体摇瓶种子接种到大米培养基上，每瓶大米培养基中的接种量为10ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，在菌丝培养阶段，需保持黑暗条件；温度25℃，相对湿度在50％～60％，培养30～40d，使菌丝铺满罐头培养瓶；
罐头瓶固体菌丝培养液为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g ，复合维生素B 4片（70mg/片），柠檬酸三胺0.4g；加水至1000mL；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克。
D、子实体培养
将罐头培养瓶置于湿度在70％～80％、温度在25±1℃条件下培养；在子实体培养阶段打开培养箱光源保证有充足的光照，光照强度为1000lux，光照时间12h，光照12h或黑暗交替进行。在子实体基本长满瓶，不再生长时并保持架健壮的时候即得到人工培养的台湾虫草子实体；人工培养的台湾虫草子实体呈棒状，橙黄色或橙红色，长度和大小与野生台湾虫草类似。当子实体不再生长，并保持架健壮的时候进行采收，于50℃条件下通风干燥，得到干品。
实施例2：
黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种的获得可以通过野外采集成熟的台湾虫草，收集弹射的子囊孢子，转移至无菌的培养基质上分离纯化而得，或将子座部分经表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得菌种。本发明所用的黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 4147。
人工培养台湾虫草子实体方法的具体生产操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种接种于斜面试管培养基，温度25℃培培养10d，待菌丝长满试管并产孢，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5。
B、液体摇瓶种子培养
在500ml三角瓶中装入200ml摇瓶种子培养基，在121℃高温1 × 105 Pa压力下灭菌30min，待冷却至室温时，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、120r/min条件下恒温振荡培养，培养时间为10～15d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基原料的重量配比为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g ，复合维生素B 4片（70mg/片），柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克。
C、菌丝培养
在350ml干净的罐头瓶中加入20g优质大米，按料水比1:1.8的比例在罐头瓶中加入固体菌丝营养培养液，pH值为4，搅拌均匀，用耐高温聚丙烯封口膜覆盖，外边用报纸包扎好，浸泡2小时后，在121℃高温灭菌30min，自然冷却，得到大米培养基；在无菌条件下，用高速分散器将液体摇瓶种子打散，将液体摇瓶种子接种到大米培养基上，每瓶大米培养基中的接种量为10ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，在菌丝培养阶段，需保持安全黑暗条件；温度在25℃，相对湿度在50％～60％，培养30～40d，使菌丝铺满罐头培养瓶；
罐头瓶固体菌丝培养液为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁（MgSO4 ）1.5g，磷酸二氢钾（KH2PO4 ）3g ，复合维生素B 4片（70mg/片），柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克。
D、子实体培养
将罐头培养瓶置于湿度在70％～80％、温度在25±1℃条件下培养；在子实体培养阶段打开培养箱光源保证有充足的光照，光照强度为1000lux，光照时间12h，光照12h或黑暗交替进行。在子实体基本长满瓶，不再生长时并保持健壮的时候即得到人工培养的台湾虫草子实体；人工培养的台湾虫草子实体呈棒状，橙黄色或橙红色，长度和大小与野生台湾虫草类似。
当子实体不再生长，并保持健壮的时候进行采收，于50℃条件下通风干燥，得到干品。

Claims (1)

1.一种人工培养台湾虫草子实体的方法，包括菌种的获得，黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种的获得可以通过野外采集成熟的台湾虫草，收集弹射的子囊孢子，转移至无菌的培养基上分离纯化而得，或将子座部分经表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得菌种，其特征在于台湾虫草子实体的具体培养操作步骤如下：
A、斜面试管菌种活化培养
将黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis菌种接种于斜面试管培养基，温度25℃培养10d，待菌丝长满试管并产孢，得到斜面菌种；
斜面试管培养基的原料重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，pH6.5；
B、液体摇瓶种子培养
在500ml三角瓶中装入200ml摇瓶种子培养基，在121℃高温高压（1 × 105Pa）下灭菌30min，待自然冷却至室温时，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基上，在温度25±1℃、120r/min条件下恒温振荡培养，培养时间为10～15d，得到液体摇瓶种子；
液体摇瓶种子培养基原料的重量配比为：马铃薯200g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，蛋白胨10g，硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 4片·L-1（70mg/片）、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；                   
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克；
C、菌丝培养
在350ml干净的罐头瓶中加入20g大米，按料水比1:1.8～1:2.0的比例加入罐头瓶固体菌丝培养液，pH值为4～6，搅拌均匀，用耐高温聚丙烯封口膜覆盖，外边用报纸包扎好，浸泡2小时，在121℃高温灭菌30min，自然冷却，得到大米培养基；在无菌条件下，用高速分散器将液体摇瓶种子打散，将液体摇瓶种子接种到大米培养基上，每瓶大米培养基中的接种量为10ml；紧密封口，置于25℃的人工气候箱中，菌丝培养阶段，需保持黑暗条件；温度25℃，相对湿度在50％～60％，培养30～40d，使菌丝铺满罐头培养瓶；
罐头瓶固体菌丝培养液为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、复合维生素B 4片·L-1（70mg/片）、柠檬酸三胺0.4g，加水至1000ml；
每片复合维生素B含维生素B1 3毫克、维生素B2 1.5毫克、维生素B6 0.2毫克、烟酰胺10毫克；
D、子实体培养
将罐头培养瓶置于湿度70％～80％、温度25±1℃条件下的人工气候箱中培养；在子实体培养阶段打开培养箱光源，保证有充足的光照，光照强度为1500lux，光照时间12h光照12h或黑暗交替进行；在子实体基本长满瓶，不再生长时并保持健壮的时候即得到人工培养的台湾虫草子实体，人工培养的台湾虫草子实体呈棒状，橙黄色或橙红色，长度和大小与野生台湾虫草类似。
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