CN101659578A - 一种九州虫草子实体的人工培养方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种九州虫草子实体的人工培养方法及其培养基，它是将九州虫草菌种保存在试管PDA培养基斜面上；将瓶装活化培养基灭菌冷却后，接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种20－30℃培养7－20天；将诱导培养基灭菌冷却至室温，在无菌条件下，接种培养好的九州虫草菌种；将接好种的九州虫草放入恒温箱、散射光照培养；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥制得。本发明操作简单，培养周期短，转化率高，成本低，无污染无废弃物，可以连续、批量生产，选材正确，配方具有科学性和创新性，价格便宜，适于利于推广。

Description

一种九州虫草子实体的人工培养方法及其培养基

技术领域：

本发明属于生药学技术领域，涉及一种诱导九州虫草子实体形成的方法及培养基，并涉及在人工培养条件下诱导九州虫草子实体分化的诱导物。

背景技术：

九州虫草(Cordyceps kyushuensis Kobayasi)是一种药用真菌，因为在山东省蒙山多有发现，又叫蒙山虫草，是隶属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌纲(Ascomycetes)、麦角菌目(Clavicipitales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)真菌。九州虫草的寄主为豆天蛾(Clanisbilineata Walker)幼虫，其无性型为九州轮枝菌(SkyushuensisVerficillium Kyushue)，是目前国内发现的唯一以豆天蛾幼虫为寄主的虫草。

经研究发现，九州虫草具有止咳化痰、滋补强壮、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功能，民间用于治疗气管、支气管炎，肺部肿瘤等疾患。此外，在中国专利号为00110494.2的《九州虫草菌的人工培养方法及其子实体的应用》专利文献中记载，九州虫草具有对荷瘤动物的扶正(促进调节免疫功能)、驱邪(抑制肿瘤生长提高生命延长率)、减毒(减轻化疗副损伤促进造血机能)等药理作用，能明显抑制癌细胞生长，恢复疲劳，进一步提高人体免疫功能。因人工培养的九州虫草子实体的有效营养成分含量高，故用量少，可在确保疗效的情况下，降低制药成本。正因为如此，人工培养的九州虫草可用于新药的开发，也可以作为药膳和保健品，所以其开发应用前景广阔。

2003年第38卷第9期《药学学报》发表的“九州虫草的核苷类成分及不同部位两种活性成分含量的分布”报道了蒙山九州虫草中含有至少8种核苷或碱基，其中抗肿瘤活性成分虫草素的含量远高于冬虫夏草和蛹虫草，且人工栽培九州虫草中虫草素的含量又显著高于野生九州虫草。2004年第25卷第4期《中国生化药物杂志》发表的“3种虫草抗氧化活性的研究”通过对九州虫草与冬虫夏草的化学成分监测、生物药效、体外抑瘤试验研究及抗氧化性能研究表明，九州虫草具有较高的药用价值，有望替代价格昂贵的冬虫夏草应用于临床，有着良好的应用前景。

目前国内外关于九州虫草子实体培养方法报道较少。此外，由于野生九州虫草资源很少，实现人工规模化培养子实体是开发该资源首先要解决的问题。在中国专利号为00110494.2的《九州虫草菌的人工培养方法及其子实体的应用》专利文献中，公开了九州虫草的人工栽培方法，是利用无菌回接活体豆天蛾幼虫的培养方法来得到子实体。尽管该方法得到的虫草具有很高的营养价值和药用成分，但由于其原料豆天蛾培养周期较长，操作过程繁琐、导致其价格较高，而且从在农作物安全因素方面考虑，豆天蛾幼虫俗名豆丹，是大豆的主要害虫之一，大量培养会有潜在农业危险性。所以现有九州虫草的培养方法限制了九州虫草的规模化生产。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种操作简单，培养周期短，转化率高，成本低，无污染无废弃物，可以连续、批量生产的九州虫草子实体的人工培养方法及其培养基。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：甘油或甘露醇0.5～20％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量，pH自然。

为了进一步实现本发明的目的，其配方重量比组分为：甘油或甘露醇2～8％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量，pH自然。

为了进一步实现本发明的目的，其配方重量比组分为：甘油或甘露醇2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量，pH自然。

一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇0.5～10％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量，pH自然。

为了进一步实现本发明的目的，其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇1.3～7％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量，pH自然。

为了进一步实现本发明的目的，其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇2.7～4％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量，pH自然。

一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

(2)菌种活化：

将瓶装活化培养基灭菌冷却后，接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种20-30℃培养7-20天；

(3)接种：

将诱导培养基灭菌冷却至室温，在无菌条件下，接种培养好的九州虫草菌种；

(4)培养采收：

将接好种的九州虫草放入恒温箱、散射光照培养；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

为了进一步实现本发明的目的，一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

(2)菌种活化：

500ml锥形瓶装培养基200ml，培养基配方(g/L)如下：蔗糖20～40，蛋白胨5～10，酵母膏5～10，硫酸镁0.5～1.0，磷酸二氢钾0.5～1.0，琼脂粉15～20，水余量，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至45℃～55℃，倒入已灭菌的平板中，带平板冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(0.2-0.5cm大小)于平板中央，包上封口膜，20-30℃培养7-20天；

(3)接种：

诱导培养基，其配方重量比组分为：甘油0.5～20％或甘露醇0.5～20％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量，pH自然；

将诱导培养基121℃灭菌30min，冷却至45-55℃，倒入已灭菌的平板中，冷却至室温，取直径0.7cm的无菌打孔器，从活化的九州虫草平板菌落边缘上打孔取块，接种在诱导培养基的平板中央，包上封口膜；

(4)培养采收：

将平板放入恒温箱、散射光照培养，11天后即开始出现子实体原基；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

为了进一步实现本发明的目的，一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

(2)菌种活化：

500ml锥形瓶装液体种子培养基200ml，液体种子培养基配方(g/L)如下：蔗糖20～40g，蛋白胨5～10g，酵母浸粉5～10g，水余量，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(0.2-0.5cm大小)，旋转式摇床上转速150rpm、20-30℃培养7-20天，成为九州虫草液体菌种；

(3)接种：

诱导培养基，其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇0.5～10％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量，pH自然；

将配制好的诱导培养基分装于500ml锥形瓶中，棉塞封口，外包两层报纸，在121℃条件下灭菌30分钟；灭菌完成后取出培养基，自然冷却至室温，在无菌条件下，每瓶接入5～10ml培养好的九州虫草液体菌种；

(4)培养采收：

将接好种的九州虫草置于恒温培养箱里，20～30℃培养8～12天，菌丝充分生长后，转移到16～18℃、相对湿度85～95％、每天11～13小时散射光条件下培养45～80天；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明是经过深入细致的研究，发现几种小分子碳源可以高效诱导九州虫草原基和子实体的形成，通过对培养基配方的反复筛选，添加甘油或者甘露醇为诱导物，诱发子实体大量生成，获得了用于九州虫草子实体形成的新方法。在此基础上对子实体培养工艺进行了改进，克服了九州虫草需要天然昆虫作为培养基质才能诱发子实体形成的困难，而且生长周期大大缩短，节约能源消耗，提高经济效益，本发明可以在人工控制的条件下，稳定的培养产生九州虫草子实体其具有如下优点：

1、培养所需要的原料便宜易得，来源广泛，成本低。解决了原技术用昆虫成本高、来源少的难题。

2、九州虫草子实体原基的分化时间短，11天即可进行分化；

3、子实体培养周期短，萌发早，转化率高，两个月内即可采收；

4、此生产工艺简单成本低；

5、下脚料菌坯可以全部综合利用，无污染无废弃物，具有较好的综合效益及生态效益。

具体实施方式：

实施例1：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

2.菌种活化：

取蔗糖20g，蛋白胨5g，酵母膏5g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，琼脂粉15g，水余量配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml。121℃灭菌30min，冷却至45℃，倒入已灭菌的平板中，带平板冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)于平板中央，包上封口膜，20℃培养20天；

3.接种：

配置诱导培养基：甘油5g，蛋白胨25g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水949g，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至45℃，倒入已灭菌的平板中，冷却至室温，取直径0.7cm的无菌打孔器，从活化的九州虫草平板菌落边缘上打孔取块，接种在诱导培养基的平板中央，包上封口膜；

(4)培养采收：

将平板放入25℃恒温箱、散射光照培养，11天时即开始出现子子实体原基；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

实施例2：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

2.菌种活化：

取蔗糖40g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1g，琼脂粉20g，水余量配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml。121℃灭菌30min，冷却至55℃，倒入已灭菌的平板中，带平板冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)于平板中央，包上封口膜，30℃培养7天；

3.接种：

配置诱导培养基：甘油200g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.3g，琼脂15g，水768.7g，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至45℃，倒入已灭菌的平板中，冷却至室温，取直径0.7cm的无菌打孔器，从活化的九州虫草平板菌落边缘上打孔取块，接种在诱导培养基的平板中央，包上封口膜；

(4)培养采收：

将平板放入25℃恒温箱、散射光照培养，11天时即开始出现子子实体原基；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

实施例3：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。

2.菌种活化：

取蔗糖30g，蛋白胨7g，酵母膏8g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.8g，琼脂粉17g，水余量配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml。121℃灭菌30min，冷却至50℃，倒入已灭菌的平板中，带平板冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)于平板中央，包上封口膜，25℃培养14天；

3.接种：

配置诱导培养基：甘露醇80g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.4g，琼脂18g，水881g，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至50℃，倒入已灭菌的平板中，冷却至室温，取直径0.7cm的无菌打孔器，从活化的九州虫草平板菌落边缘上打孔取块，接种在诱导培养基的平板中央，包上封口膜；

(4)培养采收：

将平板放入25℃恒温箱、散射光照培养，11天时即开始出现子子实体原基；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

实施例4：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。；

2.菌种活化：

取蔗糖40g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，水余量，配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml，121℃灭菌30min，冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)，旋转式摇床上转速150rpm、20℃培养20天，成为九州虫草液体菌种；

3.接种：

配制诱导培养基，大米60g，甘露醇15g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.375g，水74.025g，pH自然；将配制好的诱导培养基分装于500ml锥形瓶中，棉塞封口，外包两层报纸，在121℃条件下灭菌30分钟；灭菌完成后取出培养基，自然冷却至室温，在无菌条件下，每瓶接入5～10ml培养好的九州虫草液体菌种；

4.培养采收：

将接好种的九州虫草置于恒温培养箱里，20～30℃培养8～12天，菌丝充分生长后，转移到16～18℃、相对湿度85～95％、每天11～13小时散射光条件下培养45～80天；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

实施例5：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。；

2.菌种活化：

取蔗糖20g，蛋白胨5g，酵母浸粉10g，水余量，配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml，121℃灭菌30min，冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)，旋转式摇床上转速150rpm、30℃培养7天，成为九州虫草液体菌种；

3.接种：

配制诱导培养基，大米75g，甘露醇1.25g，磷酸二氢钾0.75g，硫酸镁0.375g，水172.625g，pH自然；将配制好的诱导培养基分装于500ml锥形瓶中，棉塞封口，外包两层报纸，在121℃条件下灭菌30分钟；灭菌完成后取出培养基，自然冷却至室温，在无菌条件下，每瓶接入5～10ml培养好的九州虫草液体菌种；

4.培养采收：

将接好种的九州虫草置于恒温培养箱里，20～30℃培养8～12天，菌丝充分生长后，转移到16～18℃、相对湿度85～95％、每天11～13小时散射光条件下培养45～80天；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

实施例6：

1.菌种：九州虫草菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保存在试管PDA培养基斜面上。；

2.菌种活化：

取蔗糖30g，蛋白胨7g，酵母浸粉8g，水余量，配制培养基1L，pH自然，500ml锥形瓶装培养基200ml，121℃灭菌30min，冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种一块(黄豆粒大小)，旋转式摇床上转速150rpm、25℃培养15天，成为九州虫草液体菌种；

3.接种：

配制诱导培养基，大米70g，甘油10g，磷酸二氢钾0.7g，硫酸镁0.4g，水118.9g，pH自然；将配制好的诱导培养基分装于500ml锥形瓶中，棉塞封口，外包两层报纸，在121℃条件下灭菌30分钟；灭菌完成后取出培养基，自然冷却至室温，在无菌条件下，每瓶接入5～10ml培养好的九州虫草液体菌种；

4.培养采收：

将接好种的九州虫草置于恒温培养箱里，20～30℃培养8～12天，菌丝充分生长后，转移到16～18℃、相对湿度85～95％、每天11～13小时散射光条件下培养45～80天；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

Claims (9)

1、一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：甘油或甘露醇0.5～20％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量。

2、根据权利要求1所述的一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：甘油或甘露醇2～8％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量。

3、根据权利要求1所述的一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：甘油或甘露醇2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量。

4、一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇0.5～10％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量。

5、根据权利要求4所述的一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇1.3～7％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量。

6、根据权利要求4所述的一种用于培养九州虫草子实体的培养基，其特征在于其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇2.7～4％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量。

7、一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：将九州虫草菌种保存在试管PDA培养基斜面上；

(2)菌种活化：

将瓶装活化培养基灭菌冷却后，接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种20-30℃培养7-20天；

(3)接种：

将诱导培养基灭菌冷却至室温，在无菌条件下，接种培养好的九州虫草菌种；

(4)培养采收：

将接好种的九州虫草放入恒温箱、散射光照培养；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

8、根据权利要求7所述的一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：将九州虫草菌种保存在试管PDA培养基斜面上；

(2)菌种活化：

500ml锥形瓶装培养基200ml，培养基配方(g/L)如下：蔗糖20～40，蛋白胨5～10，酵母膏5～10，硫酸镁0.5～1.0，磷酸二氢钾0.5～1.0，琼脂粉15～20，水余量，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至45℃～55℃，倒入已灭菌的平板中，带平板冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种于平板中央，包上封口膜，20-30℃培养7-20天；

(3)接种：

诱导培养基，其配方重量比组分为：甘油0.5～20％或甘露醇0.5～20％，蛋白胨1.5～2.5％，磷酸二氢钾0.05～0.1％，硫酸镁0.03～0.05％，琼脂1.5～2％，水余量，pH自然；

将诱导培养基121℃灭菌30min，冷却至45-55℃，倒入已灭菌的平板中，冷却至室温，取直径0.7cm的无菌打孔器，从活化的九州虫草平板菌落边缘上打孔取块，接种在诱导培养基的平板中央，包上封口膜；

(4)培养采收：

将平板放入恒温箱、散射光照培养，11天后即开始出现子实体原基；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。

9、根据权利要求7所述的一种九州虫草子实体的人工培养方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)菌种：将九州虫草菌种保存在试管PDA培养基斜面上；

(2)菌种活化：

500ml锥形瓶装液体种子培养基200ml，液体种子培养基配方(g/L)如下：蔗糖20～40g，蛋白胨5～10g，酵母浸粉5～10g，水余量，pH自然；121℃灭菌30min，冷却至室温后接种保存在PDA培养基斜面上的九州虫草菌种，旋转式摇床上转速150rpm、20-30℃培养7-20天，成为九州虫草液体菌种；

(3)接种：

诱导培养基，其配方重量比组分为：大米30～40％，甘油或甘露醇0.5～10％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，硫酸镁0.15～0.25％，水余量，pH自然；

将配制好的诱导培养基分装于500ml锥形瓶中，棉塞封口，外包两层报纸，在121℃条件下灭菌30分钟；灭菌完成后取出培养基，自然冷却至室温，在无菌条件下，每瓶接入5～10ml培养好的九州虫草液体菌种；

(4)培养采收：

将接好种的九州虫草置于恒温培养箱里，20～30℃培养8～12天，菌丝充分生长后，转移到16～18℃、相对湿度85～95％、每天11～13小时散射光条件下培养45～80天；采收子实体后，于40～60℃条件下通风干燥。