CN102084780B - 一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体栽培方法，该方法采用反复多次筛选的优良蛹虫草菌株接种到最佳优化碳氮源比例的培养基上，通过在不同的生长阶段给予不同的温度、湿度、光照强度进行优化培养栽培，使用本发明方法种植收获的蛹虫草子实体，生物活性物质含量大幅度提高，本发明所指的生物活性物质其化学指标成分主要是指腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸、SOD等；使用本发明方法种植收获的蛹虫草子实体其药理、药效与天然冬虫夏草极为相似，生物活性物质腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸含量超过了天然冬虫夏草。

Description

一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体栽培方法

技术领域：

本发明属于新资源食品技术领域。具体涉及一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体工业化栽培方法。特别涉及蛹虫草子实体中的生物活性物质含量提高的工业化栽培方法。

背景技术：

天然野生冬虫夏草是在特殊的生态和极端的环境下形成的，它拥有特殊的基因及表达产物与性状，具有严格的多生性，并且要求特殊的高寒地区生态地理环境，因此，产量极少。2005年国家已禁止采挖野生虫草，所以现在供求矛盾十分突出。为了缓解供需矛盾，我国将野生冬虫夏草人工栽培列为重点科研项目。但是天然的冬虫夏草由于特殊的基因及表达产物与性状等复杂原因导致很难大规模工业化生产，我国科技工作中在长期的研究摸索中发现蛹虫草是天然冬虫草夏的良好替代品，蛹虫草又名北冬虫夏草是一种极为名贵珍稀的真菌类中药，是具有极高的医药、保健和经济价值的中药材。而且蛹虫草很适宜用工厂化人工培育，能规模化种植。人工培植的蛹虫草子实体具有催眠镇静、益肝肾、补虚损、防癌、抗癌、止血、化痰、平喘等多种功效。由于蛹虫草的药食价值2009年卫生部文件《卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告(2009年第3号)》将其列为新资源食品。

近几年，由于人们自我保健意识和消费支付能力有了很大的提高，对具有重要医疗保健功能的虫草需求快速增加，因此蛹虫草子实体的市场前景非常看好。一时间，国内生产蛹虫草子实体的厂家比比皆是，规模化、产业化生产呈现出广阔前景，市场上出现大量的蛹虫草子实体，特别是卫生部颁布蛹虫草子实体作为新资源食品以来，蛹虫草子实体产量猛增，但是，很少有人关注蛹虫草子实体的质量，其生物活性物质的含量到底如何，没有人作产品生物活性成分含量的检测，卫生部新资源食品公告上规定腺苷、虫草多糖含量都有最低限量，产品活性成分含量引起人们的高度重视。国内有不少技术专家注重蛹虫草子实体的虫草素的含量。例如申请号为03135295.2的发明专利《一种提高虫草菌素含量的方法》，申请号为200610117998.9的发明专利《一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法》，申请号为200810068949.X的发明专利《提高蛹虫草固体培养基中虫草菌素含量的方法》，申请号为01124109.8的发明专利《发酵培养生产虫草菌素的方法(液体培养)》，申请号为200810068734.的发明专利《红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法》，申请号为200310101650.7的发明专利《3′-脱氧腺苷在制备降血脂药物中的应用》等，然而，这些发明专利主要集中在蛹虫草子实体的产量和虫草素产量提高的方法研究上，没有涉及到蛹虫草子实体的整个生物活性物质产量及其含量提高的研究上。本发明主要针对高含量生物活性物质的蛹虫草子实体工业化栽培方法研究。特别涉及蛹虫草子实体中的生物活性物质含量提高的工业化栽培方法的研究。本发明所指的蛹虫草子实体中生物活性物质所含的物质有腺苷、虫草多糖、虫草素、虫草酸、SOD(双歧超氧化物酶)、甾醇、尿苷、嘌呤、嘧啶、生物碱、游离氨基酸、微量元素等，特别是指腺苷、虫草多糖、虫草素、虫草酸指标成分。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计高含量生物活性物质的蛹虫草子实体的工业化培养方法。本发明经过长期研究，首先筛选到能用于工业化生产制备高含量生物活性物质的蛹虫草菌株。其次以蛹虫草菌在液体培养中对氮、碳、无机盐、PH值的选择利用优选其液体培养方法，使可以培养液体菌种，也能用液体发酵获得代谢产物。再次，对蛹虫草菌在固体培养基中培养，通过不同培养基、温度、湿度、光照强度、光照时间试验通过动态监测生物活性物质的含量比较选择最佳的条件，确定其适宜的培养基、温度、湿度、光照强度、光照时间。最后对蛹虫草的出草培养，即长出子实体。对蛹虫草子实体生物活性物质含量的检测研究。按照上述配方和方法配制的生长基质用于蛹虫草的生产，经国家药检部门检测，各项指标均优于天然虫草，其中腺苷含量最高为天然虫草的6.7倍，虫草多糖的含量最高为天然虫草的3.5倍，虫草素的含量最高为天然虫草的40倍，尿苷含量最高为天然虫草的7.78倍，，嘌呤含量最高为天然虫草的40倍。

本发明方法包括下列步骤：

1、优良蛹虫草菌种制备：培养的蛹虫草子实体所使用的菌株为：《卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告(2009年第3号)》所规定的子囊菌亚纲、麦角菌科、虫草属菌种，蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris。将母种蛹虫草拟青霉，接入改良培养基中，16℃±2℃，避光培养3-5天，再转种到优化的液体培养基中进行培养，18℃±2℃，摇床培养3-5天，培养好蛹虫草菌液，将菌液接种到优选的固体大米培养基上，生长，在生长过程中检测生物活性物质的含量，选取生物活性物质含量高的蛹虫草子实体的孢子作为母种；重复以上生产过程3-5次，不断筛选新的母种，有效防止菌种的蜕化。在多次的筛选中选取最佳母种蛹虫草拟青霉，接入改良培养基中，16℃±2℃，避光培养3-5天，再转种到优化的液体培养基中进行培养，18℃±2℃，摇床培养3-5天，培养好的蛹虫草菌液放入冰箱，备用。

制作优良蛹虫草菌种筛选用到的“改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方”：

去皮土豆190-210g，葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，磷酸二氢钾0.025％，磷酸氢二钾0.025％，7个水分子的硫酸镁0.05％，20毫克维生素B1，加水补足1000毫升配成的水溶液。

制作优良蛹虫草菌种筛选用到的“原种培养基配方”：

去皮土豆190-210g，柠檬酸铵0.14％，葡萄糖3％，蚕蛹粉2.5％，磷酸二氢钾0.025％，磷酸氢二钾0.025％，7个水分子的硫酸镁0.05％，20毫克维生素B1，加水补足1000毫升配成的水溶液。

2、优良配方最佳优化碳氮源比例的培养基的制备：本发明是以如下技术方案实现的，其生长基质配方是，按最佳优化碳氮源比例的培养基中碳氮源比例大于10∶1，具体为每个培养瓶中加入粒度为14——18目之间大米24g作为培养基基质，葡萄糖3％，蛋白胨2.5％，磷酸二氢钾0.025％，磷酸氢二钾0.025％，7个水分子的硫酸镁0.05％，20毫克维生素B1，水1000毫升配成的水溶液，每个培养瓶中加此水溶液30毫升，混匀后上盖，灭菌；在121℃下，高压蒸汽灭菌30分钟。冷却后，取出待接种。

培植出的蛹虫草子实体中有效生物活性物质含量是否均衡与培养基内所含的碳氮元素的比值有直接关系，如培养基中碳含量过高易造成营养生长差，菌丝生长无力，使产量降低；而培养基中氮含量过高，会造成生长缓慢，阻碍子实体发育和生长，并使某些甾醇和核苷类营养成分显著降低，而氮含量过低，不利于菌丝的生长，子实体瘦小；其次，菌种在不同的生长阶段其所需碳氮含量是不完全相同的，如在营养生长阶段所需碳含量相对较低，而在子实体生长阶段，碳含量要求相对较高。培养基的组成物质比例相当的重要。

3、培养条件的优化筛选：将步骤(1)里培养好的原种液，按每个培养瓶中喷雾加入1.5ml的原种液进行接种；接好种的培养瓶，移至培养架中，此时菌种处于营养生长期，控制培养温度12℃-16℃±1℃，湿度在65％-70％，避光发菌3-5天，以后处于成长期，控制培养温度18℃-20℃±1℃，湿度在75％-85％，散射光培养10-15天，以后进入子实体的生长成熟期，控制培养温度18℃-25℃±1℃，湿度在85％-95％，每天光照9小时不超过15小时，光照强度为15001x-35001x，每天通风1小时以上。培养20-40天，待蛹虫草子实体成熟后(直径2mm，长8cm)，即可收获、干燥和包装成品。

在培植环境方面，环境温度(昼夜温差)是刺激生长的极为重要的外界因素之一，且在不同的生长阶段，环境温度(昼夜温差)、湿度和光照强度、光照时间都是变量。菌种在营养生长期环境温度保持在12℃-16℃，同时间隔预定时间给予避光和给予散射光照射，在后期生长阶段环境温度应保持在18℃-25℃，相对湿度为85％-95％。菌种在营养生长期环境温度低于12℃，菌丝生长缓慢，而高于25℃，则菌丝易出现早衰现象；而在子实体后期生长阶段环境温度低于12℃，同样造成子实体生长缓慢，高于25℃，子实体生长易发生枯萎。所述营养生长阶段环境最佳温度14℃-18℃，而在后期生长阶段环境最佳温度在18℃-25℃。子实体生长期，每天光照9小时不超过15小时，光照强度为25001x-35001x，每天通风1小时以上以保证子实体生长需要的一定用氧量。

具体实施方式：

实施例1：

在培养基的配制中，其各级份的重量份额为：选用粒度12目——20目的大米30克左右(占总分量的41％)，步骤2中配置的溶液30毫升。经计算，碳元素的含量为0.47％，氮含量为0.034％。将液体蛹虫草菌种在无菌条件下注入装有上述培养基的容器中，菌种在营养生长期环境温度保持在12℃±1℃，湿度在65％，，且在前五天内避光，后五天给予散射光照射；在后期生长阶段环境温度应保持在20℃左右，相对湿度为70％，同时用0.5％葡萄糖溶液对培养基表面喷洒，以补充碳源。以后进入子实体的生长成熟期，控制培养温度18℃-25℃±1℃，湿度在85％，每天光照9小时，光照强度为15001x，每天通风1小时以上。培养20-40天，待蛹虫草子实体成熟后(直径2mm，长8cm)，即可收获、干燥和包装成品。

实施例2：

在培养基的配制中，其各级份的重量份额为：选用粒度12目——20目的大米30克左右(占总分量的41％)，步骤2中配置的溶液30毫升。经计算，碳元素的含量为0.47％，氮含量为0.034％。将液体蛹虫草菌种在无菌条件下注入装有上述培养基的容器中，菌种在营养生长期环境温度保持在14℃±1℃，湿度在70％，，且在前五天内避光，后五天给予散射光照射；在后期生长阶段环境温度应保持在21℃左右，相对湿度为75％，同时用0.5％葡萄糖溶液对培养基表面喷洒，以补充碳源。以后进入子实体的生长成熟期，控制培养温度23℃±1℃，湿度在90％，每天光照12小时，光照强度为25001x，每天通风1小时以上。培养20-40天，待蛹虫草子实体成熟后(直径2mm，长8cm)，即可收获、干燥和包装成品。

实施例3：

在培养基的配制中，其各级份的重量份额为：选用粒度12目——20目的大米30克左右(占总分量的41％)，步骤2中配置的溶液30毫升。经计算，碳元素的含量为0.47％，氮含量为0.034％。将液体蛹虫草菌种在无菌条件下注入装有上述培养基的容器中，菌种在营养生长期环境温度保持在16℃±1℃，湿度在75％，，且在前五天内避光，后五天给予散射光照射；在后期生长阶段环境温度应保持在22℃左右，相对湿度为80％，同时用0.5％葡萄糖溶液对培养基表面喷洒，以补充碳源。以后进入子实体的生长成熟期，控制培养温度25℃±1℃，湿度在95％，每天光照15小时，光照强度为35001x，每天通风1小时以上。培养20-40天，待蛹虫草子实体成熟后(直径2mm，长8cm)，即可收获、干燥和包装成品。

实施例4：

蛹虫草子实体中生物活性物质腺苷、虫草多糖的含量测定方法

一、腺苷的含量测定

1.方法提要

试样经90％甲醇处理，溶出腺苷，用甲醇定容，以磷酸盐缓冲液(PH6.5)为流动相，在C₁₈柱上，对试样进行高效液相分离，并以腺苷对照品做外标，使用紫外检测器(260nm)测定试样中腺苷的含量。

2.试剂和溶液

流动相：磷酸盐缓冲液(PH6.5)：〔取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5ml与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5ml，混合(PH6.5)〕-甲醇(17∶3)；

甲醇：分析纯；

腺苷对照品：99.0％以上。

腺苷对照液：取腺苷对照品适量，加90％甲醇制成每1ml含20μg的溶液。

3.仪器

3.1高效液相色谱仪：带紫外检测器，记录仪或微处理机。

3.2色谱柱：150mm×4mm Nova-Pak C₁₈柱，4μm。

4.色谱条件

柱温：环境温度

流动相：磷酸盐缓冲液(PH6.5)：〔取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5ml与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5ml，混合(PH6.5)〕-甲醇(17∶3)

检测器波长：260nm       理论板数按腺苷峰计算应不低于2000。

流量：1ml/min           进样量：10μl

以上色谱操作条件，系典型操作系数。分析者可根据仪器情况，对上述参数作适当调整，以获最佳效果。

5.操作步骤

5.1对照品溶液和试样制备

对照品溶液的制备精密称取腺苷对照品适量，加90％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备  取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加90％甲醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.2测定

在选定的色谱条件下，待仪器稳定后，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.3计算

试样中腺苷含量X按以下公示计算：C1/C2＝X1/X2

二、虫草多糖的含量测定

1.方法：苯酚-硫酸法测定

2.仪器与试剂：722分光光度计多孔水浴锅等，浓硫酸为分析纯，80％苯酚溶液(80g重蒸苯酚加入20mL重蒸馏水)，分析纯葡萄糖等。

3.试验方法

3.1蛹虫草多糖的提取：取蛹虫草样品研成的粉末10g，用水提醇沉法提取，即加10倍量的水，100℃水浴煎煮1h，重复3次。提取液过滤，浓缩至I：1(g/ml)加3倍量的乙醇使其沉淀，倾出上清液，沉淀加水溶解，加稀乙醇使沉淀，离心，取出上清液，继续加乙醇放置，倾出上清液，沉淀依次用乙醇、无水乙醇冼涤，过滤，低温干燥，即得多糖粗品。将提取的多糖粗品，置于10mL量瓶中，加重蒸馏水溶解并稀释到刻度，摇匀备用。

3.2标准曲线的制作：吸取葡萄糖标准液(100ug/ml)0、0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1ml分别加入到各试管中，用重蒸馏水补足至每管2ml，使各管葡萄糖含量分别为0，10，20，30，40，60，80，100ug，各管加0.05mI80％苯酚溶液，再加入浓硫酸5ml(勿沿管壁加入，以便使样品与硫酸快速混匀)，静置10min，30℃水浴15min，在490nm波长处测各管的OD值，以糖浓度为横坐标，各管的OD值为纵坐标做标准曲线。其回归方程为Y＝0.0625X-0.0689，r＝0.9990，线性范围为：0ug/ml～50ug/ml。

3.3样品测定：取2ml稀释的待测样品(糖浓度控制在5ug/ml～50ug/ml之间)，加入试剂量和操作方法同制作标准曲线，测其OD值，在标准曲线上求得多糖相当的量，再计算出样品含糖量。

Claims (2)

1.一种高含量生物活性物质的蛹虫草子实体工业化栽培方法,其特征在于该栽培方法包括下列步骤：

(1)筛选高含量生物活性物质蛹虫草菌种：将蛹虫草拟青霉接入改良培养基中进行培养，在生长过程中检测生物活性物质的含量，选取生物活性物质含量高的蛹虫草子实体的孢子作为母种；重复以上生产过程3-5次得到高含量生物活性物质的蛹虫草菌种，选取最佳母种蛹虫草拟青霉，接入改良培养基中,16℃±2℃,避光培养3-5天,再转种到优化的液体培养基中进行培养,18℃±2℃,摇床培养3-5天,培养好的蛹虫草菌液放入冰箱，备用； 其中改良培养基配方如下：

去皮土豆190-210g，葡萄糖3%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾0.025%，磷酸氢二钾0.025%，7个水分子的硫酸镁0.05%，20毫克维生素B1，加水补足1000毫升配成的水溶液，其中优化的液体培养基配方如下：去皮土豆190-210g，柠檬酸铵0.14%，葡萄糖3%，蚕蛹粉2.5%，磷酸二氢钾0.025%，磷酸氢二钾0.025%，7个水分子的硫酸镁0.05%，20毫克维生素B1，加水补足1000毫升配成的水溶液；

(2)培养基的制备：粒度为14—18目之间大米24g作为培养基基质，加入葡萄糖3%，蛋白胨2.5%，磷酸二氢钾0.025%，磷酸氢二钾0.025%，7个水分子的硫酸镁0.05%，20毫克维生素B1，水1000毫升配成的水溶液，培养瓶中加此水溶液30毫升,混匀后上盖,灭菌；在121℃下,高压蒸汽灭菌30分钟，冷却后,取出待接种，其中培养基中碳氮源比例大于10:1；

(3) 接种、培养与收获：将步骤(1)里培养好的蛹虫草菌液接种到步骤（2）的培养基上，按每个培养瓶中加入1.5ml的原种液进行接种；接好种的蛹虫草培养瓶,移至培养架中, 通过在不同的生长阶段给予不同的温度、湿度、光照强度、一定的含氧量进行优化培养栽培,控制培养温度20℃±6℃,湿度控制在65％-95％,每天光照9-15小时,光照强度为1500lx-3500lx,每天通风1小时以上，培养45-60天,待蛹虫草子实体成熟后直径2mm,长8cm时,即可进行检验和包装成品。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，培养的蛹虫草子实体所使用的菌株为：《卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告2009年第3号》所规定的子囊菌亚纲、麦角菌科、虫草属菌种的蛹虫草拟青霉。