CN102342218B - 固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，包括如下步骤：A、制备冬虫夏草一级斜面种子；B、制备冬虫夏草二级三角瓶液态种子；C、真菌培养袋固态培养；D、收集冬虫夏草菌丝。本发明优点是：生产周期短，效率高，成本低，质量好，且在真菌培养袋中培养，操作简单，利用农副产品培养冬虫夏草，便于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
冬虫夏草属于子囊菌纲，麦角菌科(Clavicipitaceue),虫草属（Cordyceps）真菌寄生在蝙蝠蛾科幼虫上的结合体，是一种珍贵的药用真菌。近年来，经医学研究证明，冬虫夏草具有调节人体新陈代谢和免疫系统功能的作用，能用于许多人体系统的疾病，对肾功能衰竭，久咳虚喘，阳痿遗精等都有很好的疗效。冬虫夏草内含多种有效成分，如多糖、核苷、虫草素、甾醇、多肽类等。
由于生长地理的特殊要求 ,以及严格的寄生性 ,造成其资源极其稀少 ,兼之采收的不易以及野生环境不断遭到破坏，更因需求的扩大及连年的滥采滥挖 ,冬虫夏草现已处于极度濒危的境地 ,极大的限制了他们的应用，而人工培养可弥补现已存在的问题。
目前，冬虫夏草的人工培养方式，主要为固体栽培和液体深层发酵，然而，有关通过固体发酵培养的人工培养方式却鲜有报道。自上世纪70年代开始，已有很多研究机构开展冬虫夏草人工栽培的研究，然而，40多年过去了，冬虫夏草人工栽培技术仍停留在实验室阶段，至今未能实现大规模商品化。中国专利CN201010214791.X（冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法）中公开了一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法，该固体栽培技术生长周期长、受环境条件影响大，规模化生产难度大。液体深层发酵具有生产效率高，劳动强度小等优点，有些企业已经把深层发酵模式生产冬虫夏草发展为规模化，但是，液体深层发酵设备投资大，技术难控制，菌丝产率低，相对成本很高。
固体发酵培养所需要的培养基单纯，生产成本低，基质前处理较液体发酵少，对生产设备要求不高，操作简单；固体发酵能用较小的反应器进行发酵，单位体积的产量高于液体发酵，生产效率高；另外，固体发酵后的培养基处理简单。因此，采用固态发酵的方式为虫草菌种的培养以及冬虫夏草生理活性物质的生成开辟了一条新途径。
通过专利数据库检索，极少涉及固体发酵培养冬虫夏草的专利，其中CN02111379.3（一种冬虫夏草菌粉及其生产工艺）采用了固体发酵的方法，但是，其生产冬虫夏草菌粉所使用的培养基基质及发酵方法明显存在不足。CN1650686采用固体培养方式，是在玻璃瓶中培养北冬虫夏草，规模化生产受到影响 。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术存在的不足，提供一种生产周期短，效率高，成本低，质量好，且在真菌培养袋中培养，操作简单，便于规模化生产的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法。
本发明的技术方案是：固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，包括如下步骤：
A、制备冬虫夏草一级斜面种子：先配好的斜面PDA培养基，经灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在一定温度下静置培养，获得一级斜面种子；
B、制备冬虫夏草二级三角瓶液态种子：先配好摇瓶液态种子培养基，混合后灭菌，冷却后接入A步骤一级斜面种子，摇床培养一定时间，获得二级三角瓶液态种子；
C、真菌培养袋固态培养：固态培养基以麦麸为主基质，先按上述B步骤中的液态种子培养基配方，将蔗糖、酵母浸粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在水中溶解，再添加麦麸，然后混匀；再将B步骤的二级液态种子接种到装有已灭菌干麦麸的真菌培养袋中，混匀，最后将培养袋置于一定温度的培养箱中培养若干天；
D、收集冬虫夏草菌丝：将发酵好的物品直接置于烘箱中烘干，然后用搅拌机粉碎，经筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝。
在上述技术方案基础上进一步的技术方案是：
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁 15～25%，蔗糖 15～25 g/L，琼脂 1.5～2.3% (w/v)，pH=5.8～6.5；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22～30 ℃下静置培养110～130 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁 20%，蔗糖 20 g/L，琼脂 1.8% (w/v)，pH=6；灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在25 ℃下静置培养120 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁 15%，蔗糖 15 g/L，琼脂 1.5% (w/v)，pH=5.8；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22 ℃下静置培养110 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁25%，蔗糖25 g/L，琼脂2.3% (w/v)，pH=6.5；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在30 ℃下静置培养130 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其摇瓶液态种子培养基配方包括： 蔗糖 1～5%， 酵母浸粉 1～3 %， 磷酸二氢钾0.11～ 0.18 %，七水硫酸镁0.11～ 0.18 %，维生素B10.0005～0.002 % ，水200～300 Ml；灭菌温度为110～120 ℃，灭菌时间为25～35分钟；所述摇床培养时间为96～125 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其摇瓶液态种子培养基配方包括：蔗糖 4%，酵母浸粉 2%，磷酸二氢钾 0.15%，七水硫酸镁0.15%，维生素B10.001% ，水250 Ml；灭菌温度为115 ℃，灭菌时间为30分钟；所述摇床培养时间为115 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其摇瓶液态种子培养基配方包括：蔗糖 5%，酵母浸粉 3%，磷酸二氢钾 0.18%，七水硫酸镁0.18%，维生素B10.002% ，水300 Ml；灭菌温度为120 ℃，灭菌时间为35分钟；所述摇床培养时间为125 h。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其真菌培养袋固态培养，是将二级液态种子接种到已灭菌干麸皮的真菌培养袋中，在22～28 ℃的培养箱中培养 12～14天。
所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其收集冬虫夏草菌丝步骤，是将发酵好的样品直接置于40～60 ℃的烘箱中烘干，然后将烘干的冬虫夏草固态培养基用搅拌机粉碎，经40～60目筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝。
本发明的主要优点如下：
（1）本发明采用以麦麸为主要原料生产冬虫夏草菌丝，相对于液体深层培养的方法，价格更低廉，且单位体积的产量高于液体发酵，具有生产成本低。
（2）本发明采用真菌培养袋，固态发酵的方式，相对于利用玻璃瓶、罐头瓶培养冬虫夏草，操作更简单，更容易控制，且对设备要求低，可以有效的用于规模化生产、应用，这也是其他研究者没有用过的。
（3）本发明生产冬虫夏草基质前处理简单，培养过程中需要控制的因素少，操作简单，因水份少，可以有效减少杂菌污染。
（4）本发明生产冬虫夏草的周期短，整个固体发酵培养过程只需要半个月左右，大大缩短了培养周期。
（5）本发明生产冬虫夏草后培养基经粉碎等简单处理后，可以作为饲料添加剂再利用。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步说明如下：
实施例1：固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，包括如下步骤：
A、制备冬虫夏草一级斜面种子：先配好的斜面PDA培养基，经灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在一定温度下静置培养，获得一级斜面种子；
B、制备冬虫夏草二级三角瓶液态种子：先配好摇瓶液态种子培养基，混合后灭菌，冷却后接入A步骤一级斜面种子，摇床培养一定时间，获得二级三角瓶液态种子；
C、真菌培养袋固态培养：固态培养基以麦麸为主基质，先按上述B步骤中的液态种子培养基配方，将蔗糖、酵母浸粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在水中溶解，再添加麦麸，然后混匀；再将B步骤的二级液态种子接种到装有已灭菌干麦麸的真菌培养袋中，混匀，最后将培养袋置于一定温度的培养箱中培养若干天；
D、收集冬虫夏草菌丝：将发酵好的物品直接置于烘箱中烘干，然后用搅拌机粉碎，经筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝。
所述的斜面PDA培养基的配方选值范围为：土豆浸汁 15～25%，蔗糖 15～25 g/L，琼脂 1.5～2.3% (w/v)，pH=5.8～6.5；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22～30 ℃下静置培养110～130 h。所述的摇瓶液态种子培养基配方选值范围为： 蔗糖 1～5%， 酵母浸粉 1～3 %， 磷酸二氢钾0.11～ 0.18 %，七水硫酸镁0.11～ 0.18 %，维生素B10.0005～0.002 % ，水200～300 Ml；灭菌温度为110～120 ℃，灭菌时间为25～35分钟；所述摇床培养时间为96～125 h。本实施例：所述的斜面PDA培养基的配方：土豆浸汁 20%，蔗糖 20 g/L，琼脂 1.8% (w/v)，pH=6；灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在25 ℃下静置培养120 h。所述的摇瓶液态种子培养基配方：蔗糖 4%，酵母浸粉 2%，磷酸二氢钾 0.15%，七水硫酸镁0.15%，维生素B10.001% ，水250 Ml；灭菌温度为115 ℃，灭菌时间为30分钟；所述摇床培养时间为115 h。所述的真菌培养袋固态培养，是将二级液态种子接种到已灭菌干麸皮的真菌培养袋中，在25℃，还可以选择22～28 ℃的培养箱中培养 12～14天。所述的收集冬虫夏草菌丝步骤，是将发酵好的样品直接置于45℃，还可以选择40～60 ℃的烘箱中烘干，然后将烘干的冬虫夏草固态培养基用搅拌机粉碎，经40～60目筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝。
实施例2：与实施例1不同的是，所述的斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁 15%，蔗糖 15 g/L，琼脂 1.5% (w/v)，pH=5.8；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22 ℃下静置培养110 h。
实施例3：与实施例1不同的是，所述的斜面PDA培养基的配方包括：土豆浸汁25%，蔗糖25 g/L，琼脂2.3% (w/v)，pH=6.5；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在30 ℃下静置培养130 h。
实施例4：与实施例1不同的是，所述的摇瓶液态种子培养基配方包括：蔗糖 5%，酵母浸粉 3%，磷酸二氢钾 0.18%，七水硫酸镁0.18%，维生素B10.002% ，水300 Ml；灭菌温度为120 ℃，灭菌时间为35分钟；所述摇床培养时间为125 h。
本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。
Claims (8)
1.固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、制备冬虫夏草一级斜面种子：先配好的斜面PDA培养基，经灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在一定温度下静置培养，获得一级斜面种子；
B、制备冬虫夏草二级三角瓶液态种子：先配好摇瓶液态种子培养基，混合后灭菌，冷却后接入A步骤一级斜面种子，摇床培养一定时间，获得二级三角瓶液态种子；
C、真菌培养袋固态培养：固态培养基以麦麸为主基质，先按上述B步骤中的液态种子培养基配方，将蔗糖、酵母浸粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在水中溶解，再添加麦麸，然后混匀；再将B步骤的二级液态种子接种到装有已灭菌干麦麸的真菌培养袋中，混匀，最后将培养袋置于一定温度的培养箱中培养若干天；
D、收集冬虫夏草菌丝：将发酵好的物品直接置于烘箱中烘干，然后用搅拌机粉碎，经筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝；
所述的斜面PDA培养基配方包括：土豆浸汁 15～25%，蔗糖 15～25 g/L，琼脂 1.5～2.3% (w/v)，pH=5.8～6.5；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22～30 ℃下静置培养110～130 h；
所述的摇瓶液态种子培养基配方包括： 蔗糖 1～5%， 酵母浸粉 1～3 %， 磷酸二氢钾0.11～ 0.18 %，七水硫酸镁0.11～ 0.18 %，维生素B10.0005～0.002 % ，水200～300 mL；灭菌温度为110～120 ℃，灭菌时间为25～35分钟；所述摇床培养时间为96～125 h。
2.如权利要求1所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，斜面PDA培养基配方包括：土豆浸汁 20%，蔗糖 20 g/L，琼脂 1.8% (w/v)，pH=6；灭菌后再将菌种接种到PDA固体斜面中，在25 ℃下静置培养120 h。
3.如权利要求1所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，斜面PDA培养基配方包括：土豆浸汁 15%，蔗糖 15 g/L，琼脂 1.5% (w/v)，pH=5.8；灭菌后，再将菌种接种到PDA固体斜面中，在22 ℃下静置培养110 h。
4.如权利要求1所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，斜面PDA培养基配方包括：土豆浸汁25%，蔗糖25 g/L，琼脂2.3% (w/v)，pH=6.5； 灭菌后， 再将菌种接种到PDA固体斜面中，在30 ℃下静置培养130 h。
5.如权利要求1至4任一权利要求所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，摇瓶液态种子培养基配方包括：蔗糖 4%，酵母浸粉 2%，磷酸二氢钾 0.15%，七水硫酸镁0.15%，维生素B10.001% ，水250 mL；灭菌温度为115 ℃，灭菌时间为30分钟；所述摇床培养时间为115 h。
6.如权利要求1至4任一权利要求所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，摇瓶液态种子培养基配方包括：蔗糖 5%，酵母浸粉 3%，磷酸二氢钾 0.18%，七水硫酸镁0.18%，维生素B10.002% ，水300 Ml；灭菌温度为120 ℃，灭菌时间为35分钟；所述摇床培养时间为125 h。
7.如权利要求1中所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，所述真菌培养袋固态培养，是将二级液态种子接种到已灭菌干麸皮的真菌培养袋中，在22～28 ℃的培养箱中培养 12～14天。
8.如权利要求1所述的固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法，其特征在于，所述收集冬虫夏草菌丝步骤，是将发酵好的样品直接置于40～60 ℃的烘箱中烘干，然后将烘干的冬虫夏草固态培养基用搅拌机粉碎，经40～60目筛子分离去除培养基，获得冬虫夏草菌丝。
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