CN106867916A - 冬虫夏草菌丝体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬虫夏草菌丝体培养方法，在工业生产前期，将冬虫夏草菌种转接到传统的PDA斜面上培养5天，然后转接到适应性斜面培养基进行适应性育种，最后生产出生产用菌种；另将配制好的发酵培养基分装入玻璃瓶中经高温灭菌、放冷、无菌接种、培养等工序即得充满白色致密菌丝体的絮状物，所述适应性斜面培养基和发酵培养基中均以蝇蛆冻干粉作为氮源。本发明的发酵培养基几乎100%转变成白色致密菌丝体的絮状物，整个生产过程中不需要进行菌丝体与培养基的分离，工艺简单易行，质量易于掌控，获得的冬虫夏草菌丝体所含的药用营养成分远远高于野生冬虫夏草。

Description

冬虫夏草菌丝体培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种冬虫夏草菌丝体培养方法。

背景技术

冬虫夏草是生长在青藏高原及其边缘地带海拔3000—6000m的高寒草甸地区的麦角菌科真菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾幼虫体内而生长的一类真菌类中药材，属中国名贵传统的滋补强壮药材。冬虫夏草这种真菌生长具有极其苛刻的寄生性和特殊的生态环境，天然资源原本就十分稀少，加之近年来生态环境的破坏、青藏高原温度上升，使冬虫夏草资源锐减，现已处濒临灭绝边缘，根本无法满足人们保健和用药的要求。所以国内外众多研究机构就冬虫夏草的人工栽培、冬虫夏草菌丝体生产、成分、药理等方面都进行了大量的研究开发工作。本发明人也是自1993年开始至今仍在开展冬虫夏草领域的研究开发工作。下列专利文献如《人工培养冬虫夏草菌粉入药的方法，公开号CN 1275403A》；《提高冬虫夏草菌丝体发酵收率的培养基及其制备方法，公开号CN 1670181A》；《一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基，公开号CN 101096641A》；《冬虫夏草菌丝体与子实体的栽培方法，公开号CN101843196A》等都对人工培养冬虫夏草菌丝体方法、工艺及其应用进行了研究。综上所有专利文献看，无论是固体发酵还是液体发酵的培养基组合中给虫草菌丝体生长提供氮源的成分不外乎是骨蛋白粉、蚕蛹粉、牛奶粉、蛋白胨等。

发明内容

本发明的目的是提供一种冬虫夏草菌丝体培养方法，采用人工饲养的无菌家蝇的活体幼虫——蝇蛆经冻干、粉碎技术制成的蝇蛆冻干粉作为发酵虫草菌丝体的氮源，大大提高了冬虫夏草菌丝体的收率及冬虫夏草菌丝体的药用营养成分含量。

本发明所采用的技术方案为：

冬虫夏草菌丝体培养方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

工业生产前期：

将冬虫夏草菌种转接到传统的PDA斜面上，在24-25℃下培养5天；

然后挑取完整的白色致密絮状菌丝转接到适应性斜面培养基进行适应性育种，在24-25℃下培养5天；

然后再挑取完整的白色致密絮状菌丝再转接到适应性斜面培养基进行适应性育种；

如此重复适应性育种三次，最后生产出适应于发酵培养基生产用的菌种；

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15-20g、玉米粉0-2g、蝇蛆冻干粉1-10g、蛋白胨1-10g、硫酸镁0.5-2g、磷酸二氢钾0.5-2g、维生素B₁ 0.1-1.5g、琼脂粉15-20g，煮沸，补水定容于1000ml；蝇蛆冻干粉用量自1g开始，每代增加1-5g，直至适应性斜面培养基中蝇蛆冻干粉用量达3-10g；

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45-50%，玉米粉2%，土豆汁15-20%，蝇蛆冻干粉20-35%，硫酸镁0.01-0.03%、磷酸二氢钾0.01-0.03%，维生素B₁ 0.003-0.005%，其余为水；

所述土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，补水定容于1000ml后得到的；

工业化生产中：

将发酵培养基装入玻璃发酵瓶中，在121℃下灭活40分钟，放冷，采用无菌接种技术将生产菌种接入，置18-25℃下培养30-45天，即得充满白色致密菌丝体的絮状物。

本发明具有以下优点：

1、本发明中，发酵培养基的生物利用率达95%以上：发酵培养基几乎是100%转变成白色致密菌丝体的絮状物。

2、工艺简单易行，整个生产过程中不需要进行菌丝体与培养基的分离，这一点与传统的菌丝体发酵工艺大大的不同，使本发明提供的工艺简单易行，质量易于掌控。

3、本发明提供的发酵培养基培养获得的冬虫夏草菌丝体所含的药用营养成分远远高于野生冬虫夏草。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及到一种从冬虫夏草上分离的菌种——蝙蝠娥拟青霉的新型培养基，采用人工饲养的无菌家蝇的活体幼虫——蝇蛆经冻干、粉碎技术制成的蝇蛆冻干粉作为发酵生产虫草菌丝体的氮源，即首次使用了人工饲养的家蝇幼虫作为氮源。本发明涉及到一种中国冬虫夏草菌（拉丁学名为Cordyceps sinensis）的无性型——蝙蝠娥拟青霉（拉丁学名为Paecilomyces hepiali Chen & Dai,）采用固体发酵工艺生产冬虫夏草菌丝体的生产方法，具体说是涉及生产过程中一种新型的培养基配方。

蝇蛆的中医药名称：蛆、五谷虫、谷虫、水仙子。蛆出于（集韵）、五谷子出于（滇南本草）、水仙子出于（药性资料汇编），有资料记载，我国春秋战国时就有用五谷虫治病的实例；而民间用五谷虫治病一直延续至今。蝇蛆冻干粉富含活性抗菌蛋白、几丁质、外源性凝集素以及抑制癌细胞的壳聚糖等成分，这些成分都是人类梦寐以求的抗病菌、抗病毒、抗肿瘤的珍贵生物医药资源。这些年来国内外众多的专家学者都对蝇蛆做过多方面的研究，以下不完整的罗列一些关于蝇蛆方面的研究论文以示其应用研究的进展。如：《蝇蛆的营养价值及开发利用，吴莉敏，吉林农业2012年第04期》；《无菌蝇蛆的营养分析，斯琴高娃，内蒙古农业大学，现代农业科技2008年第2期》；《蝇蛆蛋白粉对小鼠免疫功能的影响，覃容贵等，贵阳医学院 ，中药材.第30卷第6期2007年6月》；《家蝇幼虫蛋白提取物的抗病毒、抗氧化及护肝作用研究，王芙蓉，华中农业大学博士学位论文，2007年12月》；《家蝇蛆粉的安全性评价，黎运西，广东药学院硕士学位论文2010年5月》；《不同方法干燥的蝇蛆粉营养价值评价及其对小鼠免疫的影响，陈红雷，中山大学硕士论文，2010年5月》；《家蝇蛆粉抗高血脂与动脉粥样硬化的研究，褚夫江，广东药学院硕士学位论文2009年5月》；《蝇蛆干粉营养素含量及蝇蛆壳聚糖对实验性糖尿病大鼠抗氧化损伤能力影响的研究，陈林军，医学研究杂志2011年4月第40卷第4期》；《家蝇抗菌肽的研究与应用，罗金香等，南京农业大学，昆虫知识2005 42(3)》；《家蝇幼虫作为人类潜在食物蛋白质资源的探索，张泽生，天律轻工业学院食品工程系，食品工业科技，1997．No．6》。

本发明使用的蝇蛆冻干粉经检测蛋白质含量为57.13%，氨基酸总量为50.89，氨基酸种类齐全，且富含人体所需的8种必需氨基酸（另法测定色氨酸为2.86%）以及组氨酸（组氨酸对成人为非必需氨酸，但对幼儿却为必需氨基酸），其必需氨基酸含量占氨基酸总量的42.14%，完全超过了FAO/WHO建议的优良蛋白质必需氨基酸应占氨基酸总量40%的标准。这里还要特别强调的是蝇蛆冻干粉的氨基酸组成比例最符合人体日常对氨基酸的需求，从营养角度看其不存在限制性氨基酸。蝇蛆蛋白与其它优质动物蛋白相比较毫不逊色，其营养价值甚至要远高于其它的动物蛋白（参见下表），因此它是一种优质的蛋白资源。

汉瑞宝牌蝇蛆冻干粉氨基酸含量及与猪肉（里脊）氨基酸(%)对照

本发明提供一种用于固体发酵生产冬虫夏草菌丝体的斜面培养方法以保障发酵产品质量；同时也提供一种原材料来源丰富、价格低廉、生产容易控制、大大提高培养基的生物利用率、从而能培养出高质量的可用于多种医学用途的冬虫夏草（蝙蝠娥拟青霉）菌丝体的培养基。

所述冬虫夏草菌丝体培养方法，具体由以下步骤实现：

工业生产前期：

将冬虫夏草菌种转接到传统的PDA斜面上，在24-25℃下培养5天；

然后挑取完整的白色致密絮状菌丝转接到适应性斜面培养基进行适应性育种，在24-25℃下培养5天；

然后再挑取完整的白色致密絮状菌丝再转接到适应性斜面培养基进行适应性育种；

如此重复适应性育种三次，最后生产出适应于下面叙述的发酵培养基生产用的菌种；

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15-20g、玉米粉0-2g、蝇蛆冻干粉1-10g、蛋白胨1-10g、硫酸镁0.5-2g、磷酸二氢钾0.5-2g、维生素B₁ 0.1-1.5g、琼脂粉15-20g，煮沸，补水定容于1000ml；适应性育种斜面培养基中的蝇蛆冻干粉用量可从1g开始，每代增加1-5g，直至斜面培养基中蝇蛆冻干粉用量达3-10g。

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45-50%，玉米粉2%，土豆汁15-20%，蝇蛆冻干粉20-35%，硫酸镁0.01-0.03%、磷酸二氢钾0.01-0.03%，维生素B₁ 0.003-0.005%，其余为水。

上述的土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，补水定容于1000ml后所得。

上述发酵培养基，按重量比(%)计，碳源25-65 %，氮源 10-40%,无机盐 0.01-2%,维生素 0-0.01%，其余为水。优选：碳源30-55 %，氮源 20-35%,无机盐 0.01-1%,维生素0.001-0.005%，其余为水。其中所述碳源可以选自大米、玉米粉、土豆汁中的几种；氮源选自蝇蛆冻干粉；无机盐选自硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙中的几种；维生素选自维生素B₁。

工业化生产中：

将发酵培养基装入玻璃发酵瓶中，在121℃下灭活40分钟，放冷，采用无菌接种技术将生产菌种接入，置18-25℃下培养30-45天，即得充满白色致密菌丝体的絮状物。培养基几乎是100%转变成白色致密菌丝体的絮状物。

实施例1：

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蝇蛆冻干粉3g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2g、维生素B₁ 0.1g、琼脂粉20g，煮沸，补水定容于1000ml。

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45%，玉米粉2%，土豆汁20%，蝇蛆冻干粉25%，硫酸镁0.01%、磷酸二氢钾0.03%，维生素B₁ 0.003%，其余为水。

上述的土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，加水定容于1000ml。

实施例2：

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蝇蛆冻干粉8g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2g、维生素B₁ 0.1g、琼脂粉20g，煮沸，补水定容于1000ml。

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45%，玉米粉1%，土豆汁10%，蝇蛆冻干粉35%，硫酸镁0.02%、磷酸二氢钾0.02%，维生素B₁ 0.003%，其余为水。

上述的土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，补水定容于1000ml。

实施例3：

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15g、玉米粉2g、蝇蛆冻干粉5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2g、维生素B₁ 0.1g、琼脂粉20g，煮沸，补水定容于1000ml。

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45%，玉米粉1%，土豆汁15%，蝇蛆冻干粉30%，硫酸镁0.02%、磷酸二氢钾0.03%，维生素B₁ 0.003%，其余为水。

上述的土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，补水定容于1000ml。

下面是将上述实施例得到的白色菌丝体取出、经切片、摊薄在不锈钢网上用低于60℃的热风干燥至水分在5%以下，即得冬虫夏草（蝙蝠娥拟青霉）菌丝体片。然后再根据应用需要可将此菌丝体片进行冷冻细胞破壁成微粉状。菌丝体微粉的检测结果如下。

发酵冬虫夏草（蝙蝠娥拟青霉）菌丝体微粉与野生冬虫夏草营养药用成分对照表

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (1)

1.冬虫夏草菌丝体培养方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

工业生产前期：

将冬虫夏草菌种转接到传统的PDA斜面上，在24-25℃下培养5天；

然后挑取完整的白色致密絮状菌丝转接到适应性斜面培养基进行适应性育种，在24-25℃下培养5天；

然后再挑取完整的白色致密絮状菌丝再转接到适应性斜面培养基进行适应性育种；

如此重复适应性育种三次，最后生产出适应于发酵培养基生产用的菌种；

所述适应性斜面培养基为：在土豆汁1000ml中，加入葡萄糖15-20g、玉米粉0-2g、蝇蛆冻干粉1-10g、蛋白胨1-10g、硫酸镁0.5-2g、磷酸二氢钾0.5-2g、维生素B₁ 0.1-1.5g、琼脂粉15-20g，煮沸，补水定容于1000ml；蝇蛆冻干粉用量自1g开始，每代增加1-5g，直至适应性斜面培养基中蝇蛆冻干粉用量达3-10g；

所述发酵培养基的配方为：以质量百分比计，大米45-50%，玉米粉2%，土豆汁15-20%，蝇蛆冻干粉20-35%，硫酸镁0.01-0.03%、磷酸二氢钾0.01-0.03%，维生素B₁ 0.003-0.005%，其余为水；

所述土豆汁是将经削皮挖眼切片后的100-200克土豆用1000ml水煮烂，取其滤液，补水定容于1000ml后得到的；

工业化生产中：

将发酵培养基装入玻璃发酵瓶中，在121℃下灭活40分钟，放冷，采用无菌接种技术将生产菌种接入，置18-25℃下培养30-45天，即得充满白色致密菌丝体的絮状物。