CN110819545A - 一种中国被毛孢的液体培养基及其制作方法 - Google Patents

一种中国被毛孢的液体培养基及其制作方法 Download PDF

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杨小兵
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Abstract

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种中国被毛孢的液体培养基及其制作方法，液体培养基，每1000mL培养基包括：土豆180‑220g、蚕蛹粉25‑35g、蛋白胨8‑12g、酵母浸出粉8‑12g、葡萄糖18‑22g、硫酸镁(MgSO4)0.8‑1.2g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4‑0.6g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.4‑1.6g、硫酸锰(MnSO4)0.2‑0.4g、维生素B杂0.04‑0.06g，其余为水。本发明的液体培养基，原料易得，成本低，制作方法简便，制作方法要求低，更重要的是，培养效率高。

Description

一种中国被毛孢的液体培养基及其制作方法
技术领域
本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种中国被毛孢的液体培养基及其制作方法。
背景技术
中国被毛孢(Hirsutella sinensis)证实是我国传统名贵药用真菌冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)的无性体之一。它的主要活性成分与冬虫夏草相仿，并且可以在人工制作的培养基中存活和生长。在我国原卫生部颁布的文件《可用于保健食品的真菌菌种名单》中指出，蝙蝠蛾被毛孢(中国被毛孢的同物异名)可用作保健食品的原料。可见，中国被毛孢的开发利用，具有较好的活性物质基础，以及较低的政策风险。
中国被毛孢作为无性体的培养，实质上是对其菌丝体进行培养。和大多数食药用菌培养方式相似，中国被毛孢可使用固体或液体培养基进行培养。在固体培养基上，中国被毛孢形成圆形菌落，菌落中心处隆起，或伴有皱褶。将菌落切除，清除干净培养基后，会发现菌落呈一层皱褶表皮状菌皮，即菌丝体未能深入固体培养基生长。而在液体培养中，中国被毛孢浸泡在培养基中，在液体培养基晃动的作用力下，逐渐生长为实心球状菌丝团。因此可以预料，在相同体积的培养基中，采用液体培养基能获得更多的中国被毛孢菌丝体，有利于解决深入研究和开发时对原料量要求的问题。
因此，需要研发一种适用于液体培养的中国被毛孢的专用液体培养基。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种中国被毛孢的专用液体培养基，调整培养基碳氮源的选择和配比，提高中国被毛孢在液体培养基中的生长效率，并且制作原料廉价易得，一般菌种培养设备的实验室均可实现制作。
本发明通过以下方案达到上述目的：
研究表明，中国被毛孢生长需要较丰富的氮源物质，但经预实验表明，并非氮源种类越丰富，中国被毛孢生长越快，适用于其生长的固体培养基配方，不但不能在液体培养状态促进其生长，反而抑制了生长。
在第一方面，提供一种中国被毛孢的液体培养基，每1000mL培养基包括：土豆180-220g、蚕蛹粉25-35g、蛋白胨8-12g、酵母浸出粉8-12g、葡萄糖18-22g、硫酸镁(MgSO4)0.8-1.2g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4-0.6g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.4-1.6g、硫酸锰(MnSO4)0.2-0.4g、维生素B杂0.04-0.06g，其余为水。
本发明的液体培养基，不同于固体培养基，采用土豆与蚕蛹粉的组合，并且通过蚕蛹粉用量的选择，使得菌丝体生长时间短而菌丝球的密度大，并且采用磷酸二氢钾磷酸氢二钾的配对实现不需要pH调节剂的加入，简化成分和制作方法。
优选的，一种中国被毛孢的液体培养基，每1000mL培养基包括：土豆200g、蚕蛹粉30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、葡萄糖20g、硫酸镁(MgSO4)1g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g、硫酸锰(MnSO4)0.3g、维生素B杂0.05g，其余为水。
优选的，所述水为纯化水。
上述液体培养基无需调节pH值。
在第二方面，提供一种上述液体培养基的制作方法，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL水，超声处理，100℃水浴60min，以滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)过滤步骤(3)的溶液，然后用水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL水中，过滤灭菌；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
在上述制作方法中，特别是蚕蛹粉的水浴温度和时间，对培养基的菌丝生长速度和生长量等效果有显著影响。
优选的，一种上述液体培养基的制作方法，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL水，40KHz、300W超声处理10min，100℃水浴60min，以滤布过滤滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以滤布过滤滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)过滤步骤(3)的溶液，然后用水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL水中，纤维素滤膜过滤灭菌；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
优选的，所述水为纯化水。
优选的，所述步骤(1)的超声处理为40KHz、300W超声处理10min。
优选的，所述步骤(1)的滤布为200目滤布。
优选的，所述步骤(2)的滤布为200目滤布。
优选的，所述步骤(2)的切成块状为切成1cm3左右块状。
优选的，所述步骤(4)使用5-6mm脱脂棉薄层垫于漏斗中过滤步骤(3)的溶液。
优选的，所述步骤(4)的湿热灭菌为121℃、0.1MPa灭菌。
优选的，所述步骤(5)的过滤灭菌为采用0.22μm孔径的纤维素滤膜过滤灭菌。
在一个优选的实施例中，一种上述液体培养基的制作方法，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL纯化水，40KHz、300W超声处理10min，100℃水浴1h，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成1cm3左右块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)使用5-6mm脱脂棉薄层垫于漏斗中，过滤步骤(3)的溶液，然后用纯化水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌(121℃、0.1MPa)；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL纯化水中，过滤灭菌(纤维素滤膜，0.22μm孔径)；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
上述得到的液体培养基，按一定装量分装入无菌容器中，既可以用于液体接种培养。
本发明的液体培养基，原料易得，成本低，制作方法简便，制作方法要求低，更重要的是，培养效率高。
附图说明
图1为试验例1的菌株号为Z3的中国被毛孢接种本发明实施例1的液体培养基后的培养效果。
图2为试验例1的菌株号为Z4的中国被毛孢接种本发明实施例1的液体培养基后的培养效果。
图3为试验例1的菌株号为XG的中国被毛孢接种本发明实施例1的液体培养基后的培养效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
中国被毛孢的液体培养基，配方如下：
土豆200g、蚕蛹粉30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、葡萄糖20g、硫酸镁(MgSO4)1g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g、硫酸锰(MnSO4)0.3g、维生素B杂0.05g、纯化水1000mL、无需调节pH值。
上述液体培养基的制作方法：
(1)称取蚕蛹粉30g，加入900mL纯化水，40KHz、300W超声处理10min，100℃水浴1h，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆200g，切成约1cm3左右块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(3)往步骤(2)的滤液中加入蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、葡萄糖20g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸锰0.3g，充分溶解；
(4)使用5-6mm脱脂棉薄层垫于漏斗中，过滤步骤(3)的溶液，然后用纯化水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌(121℃、0.1MPa)；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL纯化水中，0.22μm孔径纤维素滤膜过滤灭菌；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)的溶液，得到液体培养基。
试验例1
取实施例1制备的100mL液体培养基加入250mL无菌锥形瓶中，取三个不同菌株号的中国被毛孢平板培养基菌种，切碎1.50cm×1.50cm大小的菌落，加入液体培养基中，在18℃培养箱中避光静置48h后，按120rpm，18℃，避光摇瓶培养。
培养40天后，培养效果如图1-图3所示。
从图1-图3可以看出，三个不同来源的中国被毛孢菌株使用该培养基培养40天后，菌丝体生长旺盛，充盈于培养基中，菌丝球密度大。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种中国被毛孢的液体培养基，其特征在于，每1000mL培养基包括：土豆180-220g、蚕蛹粉25-35g、蛋白胨8-12g、酵母浸出粉8-12g、葡萄糖18-22g、硫酸镁(MgSO4)0.8-1.2g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4-0.6g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.4-1.6g、硫酸锰(MnSO4)0.2-0.4g、维生素B杂0.04-0.06g，其余为水。
2.根据权利要求1所述的一种中国被毛孢的液体培养基，其特征在于，每1000mL培养基包括：土豆200g、蚕蛹粉30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、葡萄糖20g、硫酸镁(MgSO4)1g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.5g、硫酸锰(MnSO4)0.3g、维生素B杂0.05g，其余为水。
3.根据权利要求1所述的一种中国被毛孢的液体培养基，其特征在于，所述水为纯化水。
4.一种制作权利要求1-3中任一所述的液体培养基的方法，其特征在于，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL水，超声处理，100℃水浴60min，以滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)过滤步骤(3)的溶液，然后用水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL水中，过滤灭菌；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL水，40KHz、300W超声处理10min，100℃水浴60min，以滤布过滤滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以滤布过滤滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)过滤步骤(3)的溶液，然后用水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL水中，纤维素滤膜过滤灭菌；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的超声处理为40KHz、300W超声处理10min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的滤布为200目滤布；和/或，所述步骤(2)的滤布为200目滤布。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的切成块状为切成1cm3左右块状；和/或，所述步骤(4)使用5-6mm脱脂棉薄层垫于漏斗中过滤步骤(3)的溶液。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的湿热灭菌为121℃、0.1MPa灭菌；和/或，所述步骤(5)的过滤灭菌为采用0.22μm孔径的纤维素滤膜过滤灭菌。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：
(1)称取蚕蛹粉，加入900mL纯化水，40KHz、300W超声处理10min，100℃水浴1h，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(2)称取土豆，切成1cm3左右块状，加入步骤(1)的滤液，煮沸20min，以200目滤布滤去残渣，收集滤液；
(3)向步骤(2)的滤液中加入蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰，充分溶解；
(4)使用5-6mm脱脂棉薄层垫于漏斗中，过滤步骤(3)的溶液，然后用纯化水补足体积至990mL，充分混匀，然后湿热灭菌(121℃、0.1MPa)；
(5)取维生素B杂，溶解在10mL纯化水中，过滤灭菌(纤维素滤膜，0.22μm孔径)；
(6)混合过滤灭菌后的维生素B杂溶液与灭菌后的步骤(4)溶液，得到液体培养基。
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