CN105802888A - 一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NFB7，其保藏号为CGMCC NO.11927。本发明还提供一种复合菌剂，其有效成分是保藏编号CGMCC NO.11927的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NFB7、保藏编号CGMCC NO.11141的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCB4和保藏编号CGMCC NO.11140的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)BCB2。该复合菌剂加入堆肥后，提高堆肥中速效氮、速效磷、速效钾含量，使用所产堆肥进行种植，产量和千粒重比常规化肥方式分别提高8.14％、5.57％。

Description

一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，特别涉及一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
菌渣是食用菌栽培过程中收获产品剩下的培养基废料。随着食用菌产业的发展，每年有大量的菌渣随之产生。特别是一些大型生产基地，每天数以吨计的菌渣需要处理。大量的菌渣和废棒就地堆置或随意丢弃，不仅造成环境污染和资源浪费，而且影响食用菌生产，给企业和生产者带来一定负担。菌渣堆肥是有效处理食用菌菌渣的主要途径，经堆肥处理的菌渣可做草腐菌(双孢蘑菇、草菇、鸡腿菇等)的栽培原料，亦可进一步发酵作为农作物优质有机肥。纤维素是食用菌菌渣中主要成份，也是制约菌渣降解的主要因素之一。
目前对纤维素的处理方法主要有物理、化学处理法和生物降解法，物理化学方法是通过酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法来处理，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本高等问题。而利用添加纤维素高效降解菌的方法最为经济有效，已成为当前的研究热点和重要手段。
申请人从发酵的食用菌菌渣中分离出一株高效纤维素降解菌，并进一步明确了菌株的降解能力，为菌渣堆肥发酵及相关菌剂开发提供优良菌株。
发明内容
本发明针对菌渣发酵过程纤维素降解缓慢的问题，提供一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用。
本发明提供一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7，其保藏号为CGMCCNO.11927，于2015年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述保藏号为CGMCCNO.11927的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7，是从自然堆放的食用菌菌渣中采集样品，经富集与分离培养得到，经16SrDNA基因序列分析鉴定为产淀粉酶的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。该菌株在液体产酶培养基中培养4d，NFB7的滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)分别为22.81U·mL-1、314.50U·mL-1、2.78U·mL-1、188.09U·mL-1。该菌株具有较高的纤维素降解酶活性，单独或与其它菌株复合应用于菌渣堆肥，可提高菌渣堆肥发酵速度和发酵质量。
本发明提供所述NFB7菌株的菌丝体液体培养方法，具体步骤如下：挑取纯培养的NFB7接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，摇床震荡(200r/min)培养18h，即可得到NFB7培养液。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilissubspecies.subtilis)NFB7及其菌剂在食用菌菌渣降解中的应用。具体为在食用菌菌渣中接种后进行降解。
本发明还提供含有NFB7的菌剂。
本发明还提供含有NFB7的菌剂的制备方法：将NFB7接种到种子培养基中，37℃摇床震荡(200r/min)培养1d，即可获得含有NFB7的菌剂。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7菌剂在堆肥中的应用。具体为在堆肥中接种该菌剂后进行发酵。
本发明还提供一种复合菌剂，其有效成分是保藏编号CGMCCNO.11927的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilissubspecies.subtilis)NFB7、保藏编号CGMCCNO.11141的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCB4和保藏编号CGMCCNO.11140的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)BCB2。
所述保藏号为保藏编号CGMCCNO.11141的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCB4，于2015年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述保藏号为保藏编号CGMCCNO.11140的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)BCB2，于2015年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供所述复合菌剂的制备方法：将NFB7、BCB4和BCB2分别接种到种子培养基中，37℃摇床震荡(200r/min)培养1d，然后各取1mL接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中混合培养即得到液体复合菌剂。
本发明还提供所述复合菌剂在堆肥中的应用。具体为在堆肥中接种该复合菌剂后进行发酵。
本发明提供的NFB7单独或与其它菌种复合应用于菌渣堆肥，可提高菌渣堆肥发酵速度。
附图说明
图1为本发明实施例1中的葡萄糖标准曲线图。
图2为本发明实施例1中NFB7在LB固体培养基上的菌落形态照片。
图3为本发明实施例1中NFB7培养48小时菌体形态的显微镜照片。
图4为本发明实施例1中16SrDNA的PCR电泳图。
图5为本发明实施例1中基于16SrDNA序列同源性构建的系统发育树。
图6为本发明实施例2中堆肥过程中温度变化曲线图。
图7为本发明实施例2中不同处理堆肥过程pH变化曲线图。
图8为本发明实施例3中白灵菇菌渣堆肥过程中温度变化曲线图。
图9为本发明实施例3中白灵菇菌渣堆肥过程中电导率变化曲线图。
图10为本发明实施例3中白灵菇菌渣堆肥过程中pH变化曲线图。
图11为本发明实施例3中堆肥过程中速效氮含量变化曲线图。
图12为本发明实施例3中不同菌渣堆肥对玉米产量的影响柱状图。
图13为本发明实施例3中不同菌渣堆肥对玉米千粒重的影响柱状图。
图14为本发明实施例3中不同菌渣堆肥对玉米千粒重的影响柱状图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)NFB7(保藏编号:CGMCCNO.11927)的分离、培养、鉴定及降解特性
1.材料与方法
1.1供试材料
食用菌菌渣，采自北京通州永乐店自然堆放的杏鲍菇菌渣。
1.2培养基类型
①富集培养基配方：蛋白胨10.0g，K2HPO41.0g，Na2CO35.0g，MgSO4·7H2O0.1g，FeSO4·7H2O0.015g，MnSO40.05g，酵母膏10g，蒸馏水1000mL，pH6.0。
②LB固体培养基配方：酵母提取物5g，NaCl10g，蛋白胨10g，水1000mL，琼脂18g，pH值7.0。
③羧甲基纤维素钠培养基(CMC-Na培养基)配方：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15.0g，酵母1.0g，NH4PO31.0g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.0g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。
④液体种子培养基配方：葡萄糖20g·L-1、蛋白胨1g·L-1、Mandels营养盐浓缩液100mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液1.0mL·L-1、lmol·L-1柠檬酸缓冲液50mL·L-1。
其中，Mandels营养盐浓缩液配方为：KH2PO420g·L-1、(NH4)2SO414g·L-1、(NH2)2CO3g·L-1、CaCl2·2H2O4g·L-1、MgSO4·7H2O0.2g·L-1。
Mandels微量元素浓缩液配方为：FeSO4·7H2O5g·L-1、ZnSO4·7H2O1.4g·L-1、CoCl2·6H2O3.7g·L-1、MnSO4·H2O1.6g·L-1。
柠檬酸缓冲液配方为：210g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，750mLH2O，加78gNaOH，冷却后测pH约为4.2，加水至l000mL，测pH约为4.5即可。
⑤产酶培养基配方：(NH4)2SO42.0g，KH2PO43.0g，CaCl20.5g，MgSO40.5g，CoCl23.0mg，FeSO4·7H2O7.5mg，ZnSO4·7H2O2.0mg，MnSO4·H2O2.5mg，3％(W/V)菌渣粉，加水至1000mL，pH自然。
1.3纤维素降解菌的富集与分离培养
取10g样品加入90mL已灭菌的富集培养基中，在37℃下，150r/min摇床震荡培养3d，移5mL富集培养液到新的富集培养基中继续培养3d。
吸取富集后的培养液10mL，加入到90mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，用移液枪取吸取10-4、10-5、10-63个梯度稀释液各100μl涂布在CMC-NA培养基平板上，每一稀释度重复3次。在取样温度下培养24h，从培养基上挑取单菌落于CMC-NA培养基平板上划线分离、纯化培养，将纯化所得的一个纤维束降解菌菌株记为NFB7。该菌株在富集培养基上生长状态如下：在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱。
1.4菌种形态观察
NFB7菌株
将保存于牛肉膏蛋白胨斜面培养基的NFB7转接到牛肉膏蛋白胨固体培养基充分活化，挑取纯培养单菌落NFB7菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h，革兰氏染色后在光学显微镜下观察记录该菌株形态特征。经染色镜检，观察菌体形状。
1.516SrDNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建
NFB7菌株采用16SrDNA基因序列分析的方法鉴定。使用天根的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)对筛选出的纤维素降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。
以下列PCR引物对进行扩增：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
PCR反应体系(50μL)：27F、1492R各1μL，Taq酶(2U·μL- 1)0.5μL，10×PCRbuffer5μL，dNTP4μL，模板DNA1μL，ddH2O37.5μL。
反应条件：94℃预变性4min；94℃变性50sec；52℃退火1min；72℃延伸1min30sec，共35个循环；然后72℃延伸14min，最后4℃保存。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物送华大科技有限公司测序，降解菌的16SrDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，选取序列相似性较高的菌株，采用MEGA6.0的Neighbor-joining法构建系统进化树。
1.6降解菌纤维素酶活测定
将活化后的降解菌接种于种子培养基中，37℃，150r/min培养24h(该菌株如在液体种子培养基中静止培养，其生长状态为：表面形成白色菌膜)。
按1％的接种量接种到100mL产酶培养基中，摇床37℃，150r/min培养4d(该菌株如在产酶培养基中静止培养，其生长状态为：表面形成白色菌膜)。发酵液4000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液。测定降解菌的纤维素酶活性。
(1)全酶活(FPA)的测定
取4支20mL刻度的试管编号，各加50mg无淀粉滤纸，再加1.5mL0.2MpH4.8醋酸缓冲液。向1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5-10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温lh。
(2)外切酶活(C1)的测定
取4支20mL刻度的试管编号，各加50mg脱脂棉，再加1.5mL0.1MpH5.0柠檬酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5-10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温24h。
(3)内切酶活(Cx)活力的测定
取4支20mL刻度的试管编号，各加1.5mL0.51％CMCpH4.8柠檬酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5-10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min。
(4)葡萄糖苷酶活力的测定
取4支20mL刻度的试管编号，各加1.5mL1％水杨苷pH4.8醋酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5-10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min。
上述反应时间结束后，立即取出并向2、3、4号试管中各加入2mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。用对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的OD值，在葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖量，根据葡萄糖量计算出酶活力。
1.7葡萄糖标准曲线测定
取8支20mL刻度的试管，分别加入1mg/mL的葡萄糖标准溶液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，补加蒸馏水至总体积为2mL，配制成浓度梯度的葡萄糖溶液。向各试管中加入2mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，立即取出冷却，用蒸馏水定容至20mL。在540nm下，以1号试管溶液作为对照调零点，测定其它各管溶液的OD值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，见图1。
2结果与讨论
2.1菌株的形态特征
2.1.1菌株的菌落形态
在LB固体培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生，具体见图2。
2.1.2NFB7菌株的显微镜观察
NFB7培养48小时菌体形态的显微镜照片见图3(倍数10×100)该菌为革兰氏阳性，单个细胞0.7-0.8×2-3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
2.2NFB7菌株的16SrDNA鉴定
2.2.116SrDNA的PCR扩增
NFB716SrDNA的PCR电泳图见图4。
2.2.2系统发育树分析
将得到的16S序列与GenBank数据库中的序列进行比对，序列比对结果表明，NFB7的16srDNA与枯草芽孢杆菌(Bacillus_subtilis)的16SrDNA序列相似度为100％，其系统发育树如图5所示。
2.4降解菌纤维素酶活的测定
发酵培养基培养4d后测定筛选菌株的纤维素酶活性，NFB7的滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)分别为22.81U·mL-1、314.50U·mL-1、2.78U·mL-1、188.09U·mL-1。上述结果说明NFB7菌株能够利用菌渣中的纤维素为唯一碳源和能源的培养基中生长并产生高活性的纤维素酶。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7，其保藏号为CGMCCNO.11927，于2015年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
该菌株制成菌剂为将NFB7接种到种子培养基中，37℃摇床震荡(200r/min)培养1d，即可获得，可直接加入菌渣堆肥中，有明显的增效作用，发酵期间堆体温度较不使用菌剂(对照)提高2-3℃，停止酵测定堆肥中含N量比对照提高9.29％。
实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7菌株对菌渣栽培双孢蘑菇的堆肥效应
1材料与方法
1.1实验材料
菌剂：(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂，其由NFB7(保藏编号:CGMCCNO.11927)、BCB4(保藏编号:CGMCCNO.11141)和BCB2(保藏编号:CGMCCNO.11140)组成。
所述保藏号为保藏编号CGMCCNO.11141的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCB4，于2015年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述保藏号为保藏编号CGMCCNO.11140的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)BCB2，于2015年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
菌渣：来自福建省龙海市角美镇杏鲍菇工厂，总碳质量分数为45.8％、全氮质量分数为1.44％(见表1)。
牛粪：购自福建省漳州市，总碳质量分数为34.8％、全氮质量分数为1.72％(见表1)。
商业有机发酵菌剂：所用菌剂由北京市京圃园生物工程有限公司提供的“有机肥发酵菌曲”。
双孢蘑菇菌种：福建农科院192菌种。
表1堆肥原料理化成分
原料 含氮量(％) 含碳量(％) C/N 水分(％) pH
杏鲍菇菌渣 1.44 45.8 31.8 66.4 5.87
牛粪 1.72 34.8 20.3 18.3 8.73
1.2实验方法
1.2.1培养料堆肥方法
参见表2，取菌渣3t，加水预湿1d，使其水分达到50％-60％，然后加30％牛粪，铺于菌渣上加水预湿1d，调节含水量达到75％左右。第3d翻堆加入1.5％的过磷酸钙，1％的盐，翻堆后原料分为3个处理，每个处理堆体的基部直径2m，堆体高lm。之后每2d翻一次堆，每次翻堆调节含水量达到75％左右。3次翻堆后，一次发酵结束。将培养料移入室内栽培架上，通入蒸汽，待料温上升到65℃左右，维持24h左右，通风使料温维持不超过58℃。保持料温在52℃-58℃持续通蒸汽3-4d，然后通风降温到28℃左右，二次发酵结束。一次发酵过程中，自建堆开始，每天9：00和16：00用水银温度计测定堆体大约60cm深的部位，每次随机选3个点测量温度，然后取平均温度作为堆体实际温度。pH值采用水样比10:1搅拌1h后静置，取上清用便携式pH计测定，每个样品三个重复。
表2实验处理方案
编号 处理 菌剂 菌渣用量
CK 对照 0 1.3t
A 商业有机肥发酵菌剂 2kg 1.3t
B (NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂 10L 1.3t
2.2.2栽培管理
每个处理分成3份，随机放置菇架上进行铺料，铺料至厚度在20cm左右，料温稳定在28℃左右，原料颜色正常，发酵气味正常播种，播种量350g/m2。播种后20d左右菌。丝长满培养料，覆3cm左右厚的预湿红土(其中加草炭土3％、石灰1％)，补充水分，使培养料水分维持在65％左右。覆土后按常规技术进行出菇管理，16d左右出菇，统计前3潮菇的产量。
4.3结果与分析
4.3.1菌渣堆制发酵温度变化
温度可以作为判断微生物活动强弱的指标。本试验结果表明(图6)，不同处理堆肥温度的总体变化相似。在整个堆制发酵过程中，添加了菌剂的处理A和处理B的温度与CK相比，高5℃左右，在翻堆后，CK温度变化较大，而处理A、B温度变化较小。表明菌渣发酵过程加入(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂，有利于温度的升高和稳定。
4.3.2菌渣发酵过程pH变化
培养料在一次翻堆后加入过磷酸钙，且预湿过程微生物分解有机物产生有机酸，所以发酵初始pH偏酸，随着发酵过程微生物分解作用产生氨气使堆体pH开始上升(见图7)。处理A、B在二次翻堆后pH快速上升，可能是添加表明菌渣发酵过程加入(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂，堆肥中微生物有利于大分子对含氮有机物分解，产生的大量氨使pH升高。
4.3.3菌渣发酵过程含氮量、含碳量变化
发酵过程含氮、含碳量见表3，从试验结果来看，含氮量在发酵过程中逐渐增加，处理A、B和CK含氮量分别从开始的1.55％、1.54％、1.58％增加到二次发酵结束时的1.75％、1.71％、1.70％，但是二次发酵结束后，处理A、B与CK之间无明显差异；含碳量在逐渐减小，二次发酵结束处理A、B的含碳量明显低于CK。
由此可见，菌渣发酵过程加入NFB7组合发酵菌剂，堆肥中含N量高于对照。
表3堆肥过程中含氮、含碳量(％)
4.3.6双孢蘑菇产量统计
统计3个处理前3潮双孢蘑菇的产量(表4)，处理A、B的总产量与CK相比略有提高，但总产量差异不显著。可见，表明菌渣发酵过程加入(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂，有利于提高菌渣堆肥质量，从而提高双孢蘑菇产量。
表4不同处理双孢蘑菇产量
实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NFB7菌株对菌渣堆肥的肥力效应
1实验材料与方法
1.1实验材料
收集白灵菇和香菇栽培后的废弃菌袋，经过破袋机脱袋、粉碎后备用，每吨菌渣(湿)加入干牛粪0.23吨、(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂5L。
1.2实验方法
白灵菇菌渣与香菇菌渣比例大致1∶1，堆料含水量以65％-70％为宜。当堆内温度升至60℃，维持24小时，进行第二次翻堆。以后每2-3d翻一次堆，直至温度不再升高为止。翻堆时务必均匀彻底，以便充分腐熟。发酵中如发现物料过干，应及时在翻堆时喷洒水分，经8-10d的发酵达到完全腐熟。腐熟的堆肥堆温下降，物料松散，质地松软，体积缩小，呈深褐色或黑褐色，无异味。
1.3实验处理
处理A：菌渣直接堆制发酵，含水率维持在60％左右。
处理B：菌渣79％，畜禽粪20％，(NFB7+BCB4+BCB2)混合菌剂5L，尿素1％左右，含水率维持在60％左右。
处理C：菌渣89％，堆肥菌剂(用量参照使用说明)，含水率维持在60％左右。
处理D：菌渣原样，不发酵。
整个堆肥阶段，应该严格监视堆肥温度变化(通过在堆肥上安插不同深度的温度计进行控制)，并测定pH值、电导率、有机质、全氮、全磷、全钾以及速效N\P\K，以检验堆肥效果。堆肥结束后，各处理作为玉米基肥分别施入玉米地，测定其肥力效果。
2实验结果
2.1菌渣堆肥发酵效果
2.1.1堆肥过程中温度的变化情况
堆肥的温度变化是堆肥微生物活动和堆肥进程的最直观反映，同时也是堆肥快速腐熟的一个重要参数。本项目通过加牛粪、加菌剂处理进行堆肥示范。示范效果表明添加了牛粪的和菌剂的菌渣堆肥快速腐熟，堆内温度快速上升，堆置1d后分别达到55.6℃和59.6℃(见图8)，整个堆肥过程温度持续在50℃以上10d左右，有利于杀灭病虫害及其虫卵，有利于微生物的分解和除臭。而不加牛粪和菌剂的处理，由于初期堆肥中发酵微生物缺乏，导致温度上升过慢，后期呈现降温较慢的趋势。另外，牛粪等营养物质的添加能够促进堆肥的发酵升温，但添加过量容易延长腐熟时间，不利于堆肥的快速腐熟。
2.1.2电导率的变化规律
在堆肥的初期，电导率(CE)值有一个上升的过程，这是因为在堆肥开始阶段，微生物吸收了大电导率(CE)反映了堆肥浸提液中离子总浓度，即可溶性盐含量，在一定范围内，溶液的含盐量与CE成正相关。
试验结果(图9)可以看出，前期，由于各物质的成分基本相似，电导率相差不大。但是还能看出微生物发酵菌剂的添加还是增加了堆肥发酵料的电导率。未进行堆置的菌渣电导率在1980us/cm。菌渣经过堆制发酵处理，CE值在堆肥过程中逐渐升高，但处理A和处理B在堆肥过程中CE值变化呈现较大的波动性，先降低后升高。这是因为处理B和处理C中添加有发酵菌剂，微生物的活动比较剧烈，分解大量的物质并产生响应的产物，在吸收和利用直接引起了堆肥电导率的剧烈变化。在此过程中，处理A的变化趋势不是非常明显，总体处于较为稳定的水平。发酵后期，处理A和处理C电导率相对增高，而处理B的电导率相对降低。这反映了处理B中的大分子物质相对降解完毕，而处理C中添加了适量的牛粪，营养物质相对丰富，降解时间没有非常彻底，处理B中未添加发酵菌剂，发酵降解速度相对缓慢，降解时间也比较长。最终3个处理的CE值均稳定在2150-3480us/cm范围之内，避免了不经处理的堆肥直接施入田中，因肥料中各种离子波动性变化而对作物生长造成影响。总的来说，白灵菇菌渣是经过一次发酵后的堆肥原料，堆肥过程中CE值虽呈现出一定波动性，但整体变化不大，远低于抑制作物生长的限定值4000us/cm。
2.1.3白灵菇菌渣堆肥pH值的变化
pH是影响微生物生长的重要因素之一，大多数微生物最适宜生长的pH值为中性或弱碱性，pH值太高或太低都将影响堆肥的效果。由于白灵菇生产过程中，培养料中加入了石灰，因此，四种菌渣堆肥处理的起始pH值较高在8.3左右(图10)。在整个堆肥过程中，各处理pH值变化在8.0-9.2之间。前期，由于处理A和处理B主要成分相同都是粉碎的白灵菇菌渣，pH值处于相同的水平上。而处理C中加有部分牛粪，所以pH值偏低。在第三天时，温度和湿度都比较适合发酵菌剂的发挥作用。所以在后期整个大的环境中，处理B和处理C都处于相同的水平中，而处理A由于没有添加发酵菌剂，所以在前期升温过程中，pH值处于较低的水平，pH值升高也相对滞后，随着时间的增长，趋势与其他两个处理趋于一致。处理B和处理C由于加入了发酵菌剂，随着微生物分解作用而释放出大量氨气使得其在堆肥初期pH值快速升高；在翻堆后，氨气等物质的挥发，使得pH值逐渐降低，后期处于较为中性的水平。pH值的中性化表现出微生物的活动变缓，纤维物质分解完全。同时也预示着发酵过程的结束。
2.2不同处理下菌渣堆肥速效氮、速效磷、速效钾比较
由图11可以看出，堆肥中速效氮含量先升高后降低，在堆肥结束时除“菌渣”配方外，另两个配方速效氮含量略微升高。速效磷、速效钾含量的变化不是很大，到堆肥后期，随着微生物的分解，速效磷、速效钾得到进一步的积累，含量有所上升。其中“菌渣+菌剂”配方中，速效磷的含量由堆肥初期的0.12％增加至堆肥后的0.19％，增加了58.3％，速效钾的含量由堆肥初期的1.38％增加到堆肥后的1.67％，增加了21.0％，说明通过堆肥可以提高菌渣中的速效磷、速效钾的含量。
2.3不同处理下菌渣堆肥效果
在测定当地土壤中养分后，进行田间试验设计：堆肥结束后，(干品，按水分含量确定最后施用量)。根据配方施肥的要求及菌渣有机肥中养分含量，试验设6个处理，分别施入处理A(菌渣堆肥)、处理B(菌渣+牛粪+菌剂)、处理C(菌渣+菌剂)、处理D(菌渣原样)，每个处理按照600kg/亩施肥，以未施肥或只施化肥为对照(CK1、CK2)，各处理均设3次重复，每个小区面积0.5～1亩，合计示范面积12.8亩。按照均衡施肥原理，各处理养分总施用量按基肥氮8.8kg/亩、P2O59.8kg/亩、K2O13kg/亩，追肥氮12.6kg/亩、P2O51.4kg/亩、K2O4.5kg/亩设计。
从产量来看，堆肥配方为“菌渣+牛粪+菌剂”堆制的菌渣有机肥(C处理)用作玉米基肥，单位产量最高，亩均产量达509.04kg/亩，比传统栽培亩产量471.04kg/亩增产8.14％(图12)。从颗粒饱满度来看，“菌渣+牛粪+菌剂”堆制的菌渣有机肥(C处理)千粒重达到409.42g，比传统栽培387.83g增加了5.57％(图13)。从株高来看，各处理差异不显著，B处理玉米略高，株高252.36厘米(图14)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNFB7，其保藏号为CGMCCNO.11927。
2.权利要求1所述NFB7的菌丝体液体培养方法，其特征在于，具体步骤如下：挑取纯培养的NFB7接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，摇床震荡培养18h，即可得到NFB7培养液。
3.权利要求1所述NFB7在食用菌菌渣降解中的应用。
4.含有权利要求1所述NFB7的菌剂。
5.如权利要求4所述菌剂，其特征在于，通过如下方法制备：将NFB7接种到种子培养基中，37℃摇床震荡培养1d，即可获得含有NFB7的菌剂。
6.权利要求4-5任一项所述菌剂的制备方法，其特征在于，将NFB7接种到种子培养基中，37℃摇床震荡培养1d，即可获得含有NFB7的菌剂。
7.权利要求4-5任一项所述菌剂在堆肥中的应用。
8.一种复合菌剂，其特征在于，其有效成分是保藏编号CGMCCNO.11927的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilissubspecies.SubtilisNFB7、保藏编号CGMCCNO.11141的解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensBCB4和保藏编号CGMCCNO.11140的特基拉芽孢杆菌BacillustequilensisBCB2。
9.权利要求8所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，将NFB7、BCB4和BCB2分别接种到种子培养基中，37℃摇床震荡培养1d，然后各取1mL接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中混合培养即得到液体复合菌剂。
10.权利要求8所述复合菌剂在堆肥中的应用。
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