CN110317746A

CN110317746A - 一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌cx10及其应用

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Publication number: CN110317746A
Application number: CN201910467048.6A
Authority: CN
Inventors: 李建喜; 张景艳; 王磊; 张凯; 张康; 马玉俊; 王学智; 辛蕊华; 罗永江; 李锦宇; 王贵波; 罗超应; 仇正英
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110317746B

Abstract

本发明公开了一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10，该菌株于2018年8月27日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.16344。该菌株为革兰氏阳性杆菌，无荚膜，芽孢染色可见内生芽孢，菌落为裂状，单个，菌落颜色为白色，菌落边缘完整。该菌株为产纤维素酶的兼性厌氧菌株；在48h内该菌株的FPA酶活力为49.5U/mL，CMCase酶活为95.0IU/mL，CX酶活为23.26IU/mL。该菌株不仅具有很高的生物多样性价值，而且在纤维素富集的农作物、中药发酵再利用技术的开发与应用中也存在进一步研究的科学价值。

Description

一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10及其应用

技术领域

本发明涉及一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10及其应用。

背景技术

木质纤维素是植物细胞壁中的主要结构组成成分，由木质素、纤维素和半纤维素3者相互嵌合，以共价键结合构成空间网状结构。由于木质纤维素自身分子量大、结构复杂、性质稳定，在自然条件下极难被分解。在我国农业生产中各种富含木质纤维素的农作物秸秆、经济作物与药用植物废弃物资源丰富，产量巨大。然而长期以来，受生活方式、加工技术及其本身饲用性差等因素的影响，大量的农作物秸秆、药用植物废弃物被丢弃或焚烧，没有得到合理开发利用。据调查，目前我国秸秆利用率约为33％，其中大部分未加处理，经过技术处理后利用的仅大约占2.6％。因此，开展木质纤维素的综合利用研究对于节约资源、保护环境、增加农民收入、促进农业的可持续发展都具有重要的现实意义。目前常见的纤维降解方法有机械降解、酸降解、碱降解、热降解、氧化降解、电化学降解和生物酶解。相对于其它方法而言，生物酶解法利用纤维素酶催化纤维素降解，是一种温和、快速并且环境友好的方法。自然界中产纤维素酶的生物种属多种多样，所产纤维素酶的分子大小、酶活力、反应条件以及纤维素酶基因在不同微生物中的表达水平也各有差异，因而需要对产纤维素酶的生物来源进行筛选和鉴定。白蚁是自然界中罕见的可高效利用木质纤维素的食木性昆虫，其肠道存在的特殊微生物环境是导致纤维素高效降解的主要原因，特别是在热带地区，白蚁肠道细菌对植物细胞壁多糖的分解水平比同一地区大型草食动物高30％-40％。

白蚁肠道是一个重要的生态系统，寄生着多种微生物，包括细菌、原生生物、真菌和古生菌,由于宿主微生物的相互作用是木质纤维素有效降解的重要原因。白蚁肠道可以看作为一个厌氧梯度系统，是通过上皮细胞不断供氧的，肠道菌群菌落成员之间的交换是通过营养轴(proctodealfeeding)传递给下一代，这样促进共生微生物与宿主系统在共同进化时产生多样性。白蚁是由不同种类的白蚁组成的复杂群体，大致分为低等白蚁和高等白蚁，低等白蚁在它们的肠道中有密集而多样的原核生物和鞭毛原生生物。生活在白蚁下层的原生动物共生体负责木质纤维素的消化，它们的寄主特异性系统发育和组成反映了原生生物和白蚁之间专性(互惠)共生关系，高等白蚁缺乏鞭毛，在它们高度结构的内脏中只包含原核生物，但是高等白蚁和低等白蚁都会产生自己的纤维素分解酶。Haizhu Zhou从白蚁肠道分离出4株可降解纤维素、半纤维素的菌株，证明了白蚁肠道的确存在可降解纤维素的细菌。白蚁肠道共生系统的研究屏障是在分离和培养大量肠道微生物，鉴于肠道细菌生存和繁殖需要严格的环境条件，培养技术往往不适合它们的研究。但是这些问题已经被独立培养的方法所克服，这为研究白蚁肠道细菌的系统发育物种丰富度提供了一个有效的机会。特别是基于16SrRNA基因测序和指纹分析，产生了关于各种白蚁肠道细菌物种丰富度的稳定信息流。本试验旨在从木食低等黄胸散白蚁肠道中分离出可降解纤维素的菌株，并通过酶活性的测定，筛选出纤维素降解能力高、易于培养和繁殖的优势菌株，为农作物秸秆、经济作物与药用植物废弃物的循环再利用提供有效的技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10及其应用。

一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10，该菌株于2018年8月27日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.16344。建议的分类命名：Bacillus firmus。

该菌株为革兰氏阳性杆菌，无荚膜，芽孢染色可见内生芽孢，菌落为裂状，单个，菌落颜色为白色，菌落边缘完整。

该菌株为产纤维素酶的兼性厌氧菌株；在48h内该菌株的CMCase酶活为95.0IU/mL，CX酶活为23.26IU/mL，FPA酶活力为49.5U/mL。

该纤维素降解菌CX10在纤维素富集的农作物、中药发酵再利用技术中的开发与应用。

也可以用于木质纤维素转化为生物乙醇中的应用及中药材废弃物发酵再利用中的应用。

本发明以羧甲基纤维素为基质，建立了富集培养基，用刚果红染色液后，通过比较各细菌透明水解圈与菌落直径的比值初步筛选出高产纤维素酶的菌株CX1-CX10。纤维素酶可分为外切—β-1，4-葡萄糖酶、内切-β-1，4-葡萄糖酶和β-1，4-葡萄糖甘酶三类，本发明通过测定这些菌株中纤维素内切酶(CMCase)、滤纸酶活(FPA)及棉花酶活(CX)三种酶系的酶活，并将这三种酶活叠加进行比较大小，对白蚁肠道分离纯化出的细菌进一步筛选。筛选出CX10在产纤维素酶及酶活性方面都有很大优势的CX10菌株。研究中筛选出白蚁肠道纤维素降解菌株CX10具有很高的生物多样性价值，在纤维素富集的农作物、中药发酵再利用技术中的开发与应用存在进一步研究的科学价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明分离的菌株的透明水解圈；

图2是测纤维素酶的活力时的葡萄糖标准曲线；

图3是本发明的菌株发酵后的酶活力测定；

图4是本发明的菌株的显微形态；其中(a)为×100下的革兰氏染色，(b)为×100下的荚膜染色，(c)为×100下的芽孢染色；

图5是本发明的菌株的16SrDNA基因PCR扩增；其中M为2000bpDNAMarke，1-3分别代表菌株CX8、CX9和CX10；

图6是菌株CX2、CX3、C4、CX5、CX8、CX9、CX10同源进化树；

图7是CX10菌株生长曲线；

图8是CX10菌株接种量曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1材料与方法

1.1试验材料

白蚁购自安徽滁州，均为低等木食黄胸散白蚁。购买后实验室养殖一周，待白蚁生活稳定后进行实验。

1.1.1主要试剂及仪器

LB琼脂培养基、MRS肉汤、血平板培养、营养肉汤基、细菌基因组DNA试剂盒、细菌PCR试剂盒、革兰氏染色液、荚膜染色液、芽孢染色液购于均购于北京索莱宝科技有限公司；羧甲基纤维素钠培养基(CMC-Na)、羧甲基纤维素钠刚果红培养(CMC-Na刚果红培养基)、刚果红购于山东拓扑生物工程有限公司；主要仪器有电子天平JY502(上海浦春计量仪器有限公司)，厌氧培养箱1029(Thermo Scientific公司)，生物安全柜HFsafe-1500(力康生物医疗科技有限公司)，紫外分光光度计EVO300LC型，PCR仪9002型，ABI公司。

1.2方法

1.2.1白蚁的处理

取白蚁20只，用75％酒精消毒5min，在无菌操作台用镊子拉出试验白蚁整个肠道，用匀浆机将其混匀，取匀浆菌液1mL，采用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释倍数分别为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶。

1.2.2菌株初筛

分别取10⁴，10⁵，10⁶倍的白蚁菌液稀释液100μL涂布于CMC-Na，LB琼脂和血平板固体培养基上，每个稀释梯度做3个平行试验。涂布后的固体平板分别放入37℃恒温培养箱37℃厌氧培养箱，倒置培养24h/72h，观察细菌的生长状况，挑选生长状态良好的菌株进一步复筛。

1.2.3菌株复筛

将挑选得到的纯培养菌落在CMC-Na培养基划线，在37℃培养24h，然后挑取单个菌落点种于CMC-Na刚果红固体平板上，每个平板点种4株菌株，并做3个平行试验。分别测量透明水解圈直径(D)和菌落直径(d),并计算每种菌株的D/d比值。挑选菌落周围有明显透明水解圈的菌株进行纯化。

1.2.4纯化

挑取经复筛后单个菌落，点种于初筛选的培养基上，在37℃连续划线培养3次，挑取生长状态良好的单个菌落，划线培养于CMC-Na培养基上，经刚果红染色后，对有明显的透明圈的菌株进行革兰氏染色与镜检，观察细菌染色特性、形态特征的均一性，并进行编号。

1.3纤维素酶的活力测定

1.3.1粗酶液的制备

取每个培养菌种，按8％的接菌量分别接种于装有100mL CMC-Na液体发酵培养基、滤纸培养基和脱脂棉球培养基的三角瓶中，37℃，120r/min,恒温摇床震荡培养。48h后取发酵液2mL在10000r/min条件下离心5min去除菌体，取上清液即为粗酶液。

1.3.2葡萄糖标准曲线的绘制

配置1mg/mL葡萄糖溶液100mL，准备18支10mL试管，分为两组，每组两个平行，编号为1、2、3、4、5、6、7。按表1量取试剂，在每支试管中加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂2mL，于沸水中煮2min，流水冷却，用超纯水定容至10mL，摇匀，以1号试管为对照在490nm波长下测定各试管的OD值。以A_490nm下吸光度为横坐标，葡萄糖的含量(mg/mL)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

表1葡萄糖表准曲线绘制

1.3.3纤维素酶活力的测定

以灭活粗酶液作为对照，采用DNS法分别检测纤维素内切葡聚糖酶(CMCase)、滤纸酶(FPA)、纤维素外切葡聚糖酶(CX)活力。纤维素内切葡聚糖酶酶活测定，在15mL试管中加入含1％CMC-Na的0.2mol/L，pH＝4.8无菌醋酸钠缓冲液作为底物，加入1mL相应的粗酶液,2mL的醋酸钠缓冲液，50℃水浴30min,完成后用超纯水定量到10mL，摇匀，以灭活的粗酶液作为对照，采用DNS法测定还原糖的生成量。

在滤纸酶、纤维素外切酶酶活测定中，分别以1cm×3cm滤纸条的0.2mol/L，pH＝4.8无菌醋酸钠缓冲液和0.05g脱脂棉的0.2mol/L，pH＝4.8无菌醋酸钠缓冲液作为底物,按照上述方法进行测定。

酶活定义：在一定温度及pH条件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位，以IU/mL表示。

酶活力计算公式：酶活力(IU)＝还原糖的量×稀释倍数×1000×/180×0.5×反应时间

1000－酶活单位转换因子

180－葡萄糖分子量

1.3.4菌株生长曲线的测定

将CX10菌株在100mL CMC-Na培养基中以5％接菌量，将纯化后的菌株传代4次后，在37℃条件培养,每隔6h测定菌液OD_600nm,连续测定48h,每次平行3组，绘制菌株生长曲线。接种量曲线测定，接种量(v/v)设定为2％、4％、6％、8％、10％和12％,生长24h测定菌液OD_600nm，每组平行3次，绘制接种量曲线。

1.4产纤维素酶菌株的种类鉴定

1.4.1菌株形态学特征

分别采用革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色法，对分离纯化后的菌株进行涂片，观察菌株的显微染色形态。

1.4.2生化鉴定实验

采用VITEK2微生物生化自动鉴定仪和肠杆菌科生化鉴定管，对分离纯化后的菌株进行生化鉴定，其中肠杆菌科生化鉴定管方法参考东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》。

1.4.3 16SrRNA基因鉴定

提取纤维降解菌基因组DNA采用细菌通用16SrDNA引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，扩增16SrDNA全序列基因。总反应体积为25μL，模板DNA为2.0μL，PCR Premix 12.5μL，Forward premix 1.0μL，Reverse primer1 1.0μL，16s-freeH₂O 8.5μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃复性1.5min，30个循环；最后在72℃下延伸5min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后紫外灯下采集图片。将扩增产物置于-20℃下保存，送上海生工基因测序公司检测。

2结果与分析

2.1产纤维素酶菌株的筛选

如表2所示，用CMC-Na培养基，LB培养基，TSB和血平板4种培养基，在37℃有氧条件下对白蚁肠道菌进行菌株初筛，选择生长状态良好的10株细菌，分别测量菌株透明水解圈与菌落直径的比值(D/d)比值，将白蚁肠道分离出的细菌依次命名为CX1～CX10。结合图1，刚果红染色后，可观察到细菌在CMC-Na培养基上有明显的水解圈，此外，在厌氧环境下，4种培养基上共分离得到2株细菌，但没有明显观察到透水解圈，故不做标记。

表2白蚁肠道细菌菌落的形态特征

2.2纤维素酶的活力测定

如图2所示，根据DNS法制作葡萄糖标准曲线，所得标准曲线的线性方程为y＝5.1196x+0.0441，相关系数R²为0.9916，线性相关度好，可用作分离出的白蚁肠道细菌的纤维素酶活力测定。

2.3酶活力的测定

将白蚁肠道分离筛选出的10株菌株分别接种到CMC-Na液体发酵培养基中，在37℃，150rpm条件下摇床培养，分别在48h测定纤维素内切酶(CMCase)、滤纸酶活(FPA)及棉花酶活(CX)，并依据酶活大小进一步筛选。由图3可得知：在10株菌株中，CX10的CMCase酶活为95.0IU/mL；CX酶活为23.26IU/mL。综合3种纤维素酶活力的叠加结果，CX10、CX8、CX9高于其他菌株，表明纤维素酶系中协同作用较强，对多组分的纤维素底物作用能力高，其中CX10滤纸酶活活力明显高于CX8和CX9，说明其对含结晶区域较多的纤维素底物分解能力强于其他菌株。综上分析可知:同一菌株底物不同，3种酶活力也不同，不同菌株之间的酶活力也存在显著的差异。而且CX10号菌株的3种酶活力最高。

2.2.3CX10菌株生长曲线

由图7可知CX10菌株在18h时达到生长对数期，在24h菌株CX10增殖数量最大，此时产酶活性最高，24h后进入稳定期，OD值依次减小；由图8可以看出，接菌量为8％时菌株CX10增殖数量最大，10％到12％时依次减小。

2.3产纤维素酶菌株的鉴定

2.3.1形态学特征

将白蚁肠道分离纯化出的单一菌落涂片，在酒精灯上固定，分别进行革兰氏染色为革兰氏阳性杆菌。同时，采用荚膜染色和芽孢染色的方法，对CX10进一步观察，结果如图6所示，该菌株为革兰氏阳性杆菌，无荚膜，芽孢染色可见内生芽孢。

2.3.2生化实验鉴定

根据2.3.1细菌形态学特征的鉴定结果，采用肠杆菌科生化鉴定管，对CX2、CX3、CX4、CX5菌株进行生化鉴定。如表3所示，CX2、CX3、CX4、CX5的生化特性在靛基质和枸橼酸盐检测项不完全一致。参考《常见细菌系统手册》，初步判断CX2、CX4为肠杆菌科沙雷氏菌属(Serratia)，CX3、CX5为肠杆菌科枸橼酸杆菌(citrobacter)属。同时，采用VITEK2微生物生化自动鉴定仪对CX8、CX9、CX10的生化特性进行分析与鉴定。结果如表4所示，CX8、CX9、CX10的生化特性在苦杏仁苷(AMY)、D-山梨醇(dSOR)、β-D-葡萄糖醛酸酶(BGUR)、d-甘露醇(dMAN)项有差异。参考《伯杰氏系统细菌学手册》，初步判断CX8、CX9、CX10为芽孢杆菌科芽孢杆菌属(Bacillic)。

表3肠杆菌科CX2、CX3、CX4和CX5细菌生化鉴定

+阳性

-阴性

表4芽孢杆菌CX8、CX9和CX10生化鉴定结果

+阳性

-阴性

2.3.3 16SrDNA的PCR扩增及系统发育树的构建

分别提取CX2、CX3、CX4、CX5、CX8、CX9、CX10菌株的DNA，采用细菌通用引物27F和1492R扩增16SrDNA基因，目的片段大小在1 500bp左右，扩增结果如图5。

将克隆得到的各菌株16SrDNA基因扩增产物进行测序，在NCBI数据库中进行BLAST比对。结果如图6显示，在GenBank中将所获得序列的同源性较高菌株进行比较，可知CX2和CX4均来源于沙雷氏菌属(Serratia)的基因序列，一致性大于95％。CX3和CX5均来源于枸橼酸杆菌(citrobacter)的基因序列，一致性大于95％，因此判定该菌株属于枸橼酸杆菌(citrobacter)。CX8、CX9和CX10菌株均来源于芽孢杆菌(Bacillus)的基因序列，且同源性高于95％，其中CX8和CX10菌株与坚强芽孢杆菌(Bacillus firms)同源性高达97％，CX9菌株与Bacillus sp.171544同源性高达96％。

本研究以低等木黄胸食散白蚁作为研究对象，采用有氧培养法分离纯化出的白蚁肠道菌株主要有芽孢杆菌，枸橼酸杆菌，沙雷氏菌，这与Haizhu zho等发现白蚁肠道微生物菌群研究结果相似。同时，徐荣等采用刚果红固体平板法，从高等木食白蚁肠道微生物中分离纯化出解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。Thayer从散白蚁(Reticulitermes hesperus)后肠中分离出能产生羧甲基纤维素酶活性的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cerecus)。然而，本试验通过有氧和厌氧培养方法，以CMC-Na为分离培养基，CMC-Na刚果红培养基为鉴别培养基，从木食黄胸散白蚁肠道共分离10株菌，在厌氧条件下为分离到菌株，有氧条件下分离出的优势菌株CX10，经16SrRNA基因鉴定为坚强芽孢杆菌，在已有文献中未见报道。本研究中没有分离到嗜纤维杆菌，肠球菌，厌氧中温梭菌等在白蚁肠道中出现的菌属，这可能与在白蚁肠道中兼性微生物是清除氧气和创造厌氧条件有关，也可能与试验选择的培养基，培养条件有关。除此之外，白蚁的种类也可能是一个重要因素。根据白蚁后肠是否含有共生原生生物，可分为为低等白蚁(有共生原生生物)和高等白蚁(无共生原生生物)两大类群，本研究中购买的白蚁为木食黄胸散白蚁,属于低等白蚁，其肠道内细菌种类十分丰富，但大多数为不可培养的微生物，后肠细菌和古菌主要存在于鞭毛虫的细胞质和外表面。通过16SrRNA测序等方法对低等白蚁肠道细菌多样性研究表明，低等白蚁肠道共生菌的主要类群为螺旋体菌门(Spirochetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、变性菌门(Proteobacteria)。Pieer Hethener从高等白蚁中分离到一株具有降解纤维素能力的厌氧中温梭菌Clostrium termitidis sp.nov.。因此，以非培养的方法分析肠道微生物的16SrRNA基因文库序列以及基因组学等，可弥补目前众多微生物不能培养以及培养纯化过程中菌种退化，变异，污染等问题。

本研究以羧甲基纤维素为基质，建立了富集培养基，用刚果红染色液后，通过比较各细菌透明水解圈与菌落直径的比值初步筛选出高产纤维素酶的菌株CX1-CX10。纤维素酶可分为外切—β-1，4-葡萄糖酶、内切-β-1，4-葡萄糖酶和β-1，4-葡萄糖甘酶三类，本试验通过测定这些菌株中纤维素内切酶(CMCase)、滤纸酶活(FPA)及棉花酶活(CX)三种酶系的酶活，并将这三种酶活叠加进行比较大小，对白蚁肠道分离纯化出的细菌进一步筛选。结果发现CX10在48h内菌株的3种酶酶活具有优势。研究中筛选出白蚁肠道纤维素降解菌株CX10具有很高的生物多样性价值，具备为木质纤维素转化为生物乙醇以及中药发酵生物技术应用的制备菌株必要条件。此外，要实现将木质纤维素转化为生物燃料或应用于中药材废弃物再利用技术，水解酶也是必不可少的。因此，该研究还需要通过分析和比较这些菌株中水解酶的生化和生理特性，才能够进一步确定白蚁肠道微生物中具有很好降解木质纤维素功能的菌株。

白蚁肠道中的芽孢杆菌对木质纤维素的分解起着重要作用。本研究从低等木食黄胸散白蚁肠道发现了芽孢杆菌CX10，该菌株在48小时内能够产生纤维素内切酶(CMCase)、滤纸酶活(FPA)及棉花酶活(CX)，其中酶活性最高的坚强芽孢杆菌-CX10具有进一步深入研究的价值。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10，其特征在于，该菌株于2018年8月27日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.16344。

2.如权利要求1所述的来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10，其特征在于，该菌株为革兰氏阳性杆菌，无荚膜，芽孢染色可见内生芽孢，菌落为裂状，单个，菌落颜色为白色，菌落边缘完整。

3.如权利要求1所述的来自白蚁肠道的纤维素降解菌CX10，其特征在于，该菌株为产纤维素酶的兼性厌氧菌株；在48h内该菌株的CMCase酶活为95.0IU/mL，CX酶活为23.26IU/mL，FPA酶活力为49.5U/mL。

4.权利要求1所述的纤维素降解菌CX10在纤维素富集的农作物、中药发酵再利用技术中的开发与应用。

5.权利要求1所述的纤维素降解菌CX10在木质纤维素转化为生物乙醇中的应用。

6.权利要求1所述的纤维素降解菌CX10在中药材废弃物发酵再利用中的应用。