CN105602874A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105602874A
CN105602874A CN201610188044.0A CN201610188044A CN105602874A CN 105602874 A CN105602874 A CN 105602874A CN 201610188044 A CN201610188044 A CN 201610188044A CN 105602874 A CN105602874 A CN 105602874A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterium
bcb4
slag
bacillus amyloliquefaciens
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610188044.0A
Other languages
English (en)
Inventor
胡清秀
杨小红
邹亚杰
刘晓梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Original Assignee
Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS filed Critical Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority to CN201610188044.0A priority Critical patent/CN105602874A/zh
Publication of CN105602874A publication Critical patent/CN105602874A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F3/00—Fertilisers from human or animal excrements, e.g. manure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Treatment Of Sludge (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用。本发明菌株所产滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)活性均较高，能提高菌渣堆肥发酵速度和发酵质量。本发明还提供了一种所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)BCB4的配套菌组，该菌组由BCB4、BCB2、NFB7三种菌种复合而成，可提高菌渣堆肥发酵速度。本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌BCB4及其菌组在食用菌菌渣堆肥降解中的应用，堆肥后的菌渣的肥力得到了改善，可用于再次生产食用菌，还可用作玉米基肥，提高玉米产量。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用。
背景技术
菌渣是食用菌栽培过程中收获产品剩下的培养基废料。随着食用菌产业的发展，每年有大量的菌渣随之产生。特别是一些大型生产基地，每天数以吨计的菌渣需要处理。大量的菌渣和废棒就地堆置或随意丢弃，不仅造成环境污染和资源浪费，而且还会影响食用菌生产，给企业和生产者带来一定负担。菌渣堆肥是有效处理食用菌菌渣的主要途径，经堆肥处理的菌渣可做草腐菌(双孢蘑菇、草菇、鸡腿菇等)的栽培原料；亦可进一步发酵作为农作物优质有机肥。
纤维素是食用菌菌渣中主要成份，也是制约菌渣降解的主要因素之一。目前对纤维素的处理方法主要有物理、化学处理法和生物降解法，物理、化学处理法是通过酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法来处理，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本高等问题。而利用添加纤维素高效降解菌的方法最为经济有效，已成为当前的研究热点和重要手段。目前所选育出来的一些产纤维素酶的菌种虽具有一定的产酶能力，但是还存在所产酶的种类不丰富，降解纤维素纤维素效率不高等问题，因而应用于生产还不是很理想，有待进一步选育出更多高活力优良菌株。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌BCB4，该菌株可解决现有菌株产纤维素酶种类不丰富，酶活不高的问题。
本发明的第二目的在于提供一种所述的解淀粉芽孢杆菌BCB4的配套菌组，该菌组由三种菌种复合而成，可提高菌渣堆肥发酵速度。
本发明的第三目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌BCB4及其菌组在食用菌菌渣堆肥降解中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种解淀粉芽孢杆菌BCB4，所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCCNO.11141。
该解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCB4的保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏时间为：2015年07月21日；
经保藏中心于2015年07月21日检测为存活菌株。
BCB4菌落的外观特征为：淡黄色，不透明，表面褶皱，有隆起，边缘不规则。
本发明针对菌渣发酵过程纤维素降解缓慢的问题，提供1株高效降解菌渣纤维素的菌株，此菌株具有较高的纤维素降解酶活性。
本发明菌株是从自然堆放的食用菌菌渣中采集样品，经富集与分离培养得到原始菌株(BCB4)，后经过16SrDNA基因序列分析的方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌种所产滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)活性均较高，能提高菌渣堆肥发酵速度和发酵质量。
如上所述解淀粉芽孢杆菌BCB4的液体种子培养基，包括以下成分：葡萄糖18～22g·L-1、蛋白胨0.8～1.2g·L-1、Mandels营养盐浓缩液90～110mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液0.8～1.2mL·L-1、1mol·L-1柠檬酸缓冲液45～55mL·L-1；
所述Mandels营养盐浓缩液包括以下成分：KH2PO418～22g·L-1、(NH4)2SO413～15g·L-1、(NH2)2CO2～4g·L-1、CaCl2·2H2O3～5g·L-1、MgSO4·7H2O0.15～0.25g·L-1；
所述Mandels微量元素浓缩液包括以下成分：FeSO4·7H2O4.5～5.5g·L-1、ZnSO4·7H2O1.2～1.6g·L-1、CoCl2·6H2O3.6～3.8g·L-1、MnSO4·H2O1.5～1.7g·L-1。
优选的，所述液体种子培养基的pH为4.4～4.6。
如上所述解淀粉芽孢杆菌BCB4的培养保存条件为：36～38℃在LB培养基培养20～28h，随后接种于斜面固体LB培养基，4℃保存。
一种菌组，所述菌组由如上所述的解淀粉芽孢杆菌BCB4，以及BCB2、NFB7三种菌组成，所述BCB2和NFB7菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏编号分别为CGMCCNO.11140和CGMCCNO.11142。
BCB2为葡聚糖特基拉芽孢杆菌，拉丁学名为：Bacillustequilensis、NFB7为枯草芽孢杆菌枯草亚种，拉下学名为：Bacillussubtilissubsp.Subtilis，这两种菌的保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
BCB2的菌落形态特征如图15所示，NFB7的菌落形态特征如图16所示。
如上所述解淀粉芽孢杆菌BCB4或如上所述菌组在食用菌菌渣堆肥降解中的应用。
使用上述解淀粉芽孢杆菌及其菌组，用于食用菌菌渣堆肥降解，可大幅度增加菌渣的降解速度，且堆肥后的菌渣还可以用于食用菌的再次培养。
优选的，将所述解淀粉芽孢杆菌BCB4或所述菌组制成菌剂后再进行食用菌菌渣堆肥；
BCB4菌剂制备方法为，将BCB4菌种活化后接种至权利要求2所述的液体种子培养基中培养，得到的菌液即为BCB4菌剂；
菌组菌剂制备方法为，将BCB4、BCB2、NFB7三个菌种分别与液体培养基培养后等体积混合，得到的混合菌液即为菌组菌剂。
优选的，如上所述的应用，所述食用菌菌渣包括杏鲍菇菌渣、双孢蘑菇菌渣、白灵菇菌渣或香菇菌渣中的一种与多种。
优选的，如上所述的应用，在利用芽孢杆菌及其菌组进行菌渣堆肥降解时，还包括向菌渣中添加占总发酵体系质量15～35％畜禽粪。
畜禽粪等营养物质的添加能够促进堆肥的发酵升温，但添加过量容易延长腐熟时间，不利于堆肥的快速腐熟。总发酵体系是指由菌渣、含有本申请所述菌株BCB4或所述菌组的菌剂以及其他优选的成分，如畜禽粪和无机盐等。
进一步优选的，所述畜禽粪为牛粪。
如上所述的应用，所述菌渣堆肥的最适发酵温度为50～60℃，发酵湿度为65～75％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请提供的解淀粉芽孢杆菌BCB4所产滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)活性均较高，能提高菌渣堆肥发酵速度和发酵质量。
(2)本申请提供的菌组，三种菌株之间可相互协同，进一步提升发酵效率。
(3)本申请提供的解淀粉芽孢杆菌BCB4及其菌组在食用菌菌渣堆肥降解中的应用，操作简便，可行性高；堆肥后的菌渣的肥力得到了改善，可用于再次生产食用菌，还可用作玉米基肥，提高玉米产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
本申请提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCB4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2015年07月21日，保藏编号CGMCCNO.11141。经保藏中心于2015年07月21日检测为存活菌株。
图1为实验例1中革兰氏染色后在光学显微镜(100×)下的BCB4形态；
图2为实验例1中LB固体培养基菌落形态；
图3为实验例2中BCB416SrDNA的PCR电泳图；
图4为实验例2中基于16SrDNA序列同源性构建的系统发育树；
图5为实验例3中葡萄糖标准曲线；
图6为实验例4中堆肥过程中温度变化；
图7为实验例4中不同处理堆肥过程pH变化；
图8为实验例5中白灵菇菌渣堆肥过程中温度变化；
图9为实验例5中白灵菇菌渣堆肥过程中电导率变化；
图10为实验例5中白灵菇菌渣堆肥过程中pH变化；
图11为实验例5中堆肥过程中速效氮含量变化；
图12为实验例5中不同菌渣堆肥对玉米产量的影响；
图13为实验例5中不同菌渣堆肥对玉米千粒重的影响；
图14为实验例5中不同菌渣堆肥对玉米株高的影响；
图15为BCB2的菌落形态；
图16为NFB7的菌落形态。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
解淀粉芽孢杆菌BCB4的液体种培养、保存。
液体种培养培养的培养条件为，将菌株接种于液体种子培养基，37℃，150r/min培养24h。
液体种子培养基包括以下成分：
葡萄糖18g·L-1、蛋白胨0.8g·L-1、Mandels营养盐浓缩液90mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液0.8mL·L-1、1mol·L-1柠檬酸缓冲液45mL·L-1；将上述成分以水为溶剂制成溶液，调节pH＝4.4；
所述Mandels营养盐浓缩液包括以下成分：KH2PO418g·L-1、(NH4)2SO413g·L-1、(NH2)2CO2g·L-1、CaCl2·2H2O3g·L-1、MgSO4·7H2O0.15g·L-1；
所述Mandels微量元素浓缩液包括以下成分：FeSO4·7H2O4.5g·L-1、ZnSO4·7H2O1.2g·L-1、CoCl2·6H2O3.6g·L-1、MnSO4·H2O1.5g·L-1。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌BCB4的液体种培养、保存。
液体种培养培养的培养条件为，将菌株接种于液体种子培养基，37℃，150r/min培养24h。
液体种子培养基包括以下成分：
葡萄糖22g·L-1、蛋白胨1.2g·L-1、Mandels营养盐浓缩液110mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液1.2mL·L-1、1mol·L-1柠檬酸缓冲液55mL·L-1；将上述成分以水为溶剂制成溶液，调节pH＝4.5；
所述Mandels营养盐浓缩液包括以下成分：KH2PO422g·L-1、(NH4)2SO415g·L-1、(NH2)2CO4g·L-1、CaCl2·2H2O5g·L-1、MgSO4·7H2O0.25g·L-1；
所述Mandels微量元素浓缩液包括以下成分：FeSO4·7H2O5.5g·L-1、ZnSO4·7H2O1.6g·L-1、CoCl2·6H2O3.8g·L-1、MnSO4·H2O1.7g·L-1。
实施例3
解淀粉芽孢杆菌BCB4的分离、培养、保存
1、纤维素降解菌的富集与分离培养
供试材料为食用菌菌渣，采自北京通州永乐店自然堆放的杏鲍菇菌渣。取10g供试材料加入90mL已灭菌的富集培养基中，在取样温度下，150r/min摇床震荡培养3d，移5mL富集培养液到新的培养基中继续培养3d。
富集培养基的配方为：蛋白胨10.0g，K2HPO41.0g，Na2CO35.0g，MgSO4·7H2O0.1g，FeSO4·7H2O0.015g，MnSO40.05g，酵母膏10g，蒸馏水1000mL，pH6.0。
吸取富集后的培养液10mL，加入到90mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，用移液枪取吸取10-4、10-5、10-63个梯度稀释液各100μl涂布在CMC培养基平板上，每一稀释度重复3次。在取样温度下培养24h，从培养基上挑取单菌落于CMC培养基平板上划线分离、纯化培养。
2、解淀粉芽孢杆菌的培养
将纯化培养后的菌株活化好后，接种于液体种子培养基中，37℃，150r/min培养24h。
所述液体种子培养基包括以下成分：
葡萄糖20g·L-1、蛋白胨1g·L-1、Mandels营养盐浓缩液100mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液1mL·L-1、1mol·L-1柠檬酸缓冲液50mL·L-1；将上述成分以水为溶剂制成溶液，调节pH＝4.5；
所述Mandels营养盐浓缩液包括以下成分：KH2PO420g·L-1、(NH4)2SO414g·L-1、(NH2)2CO3g·L-1、CaCl2·2H2O4·L-1、MgSO4·7H2O0.2·L-1；
所述Mandels微量元素浓缩液包括以下成分：FeSO4·7H2O5.0L-1、ZnSO4·7H2O1.4g·L-1、CoCl2·6H2O3.7g·L-1、MnSO4·H2O1.6g·L-1。
实施例4
杏鲍菇菌渣培养料堆肥方法
取菌渣3t，加水预湿1d，使其水分达到50～60％，然后加占总发酵体系质量15％的畜禽粪，铺于菌渣上加水预湿1d，调节含水量达到65％。第3d翻堆加入1.5％的过磷酸钙，1％的盐，翻堆后分别添加实施例1～3制得的BCB4细菌的菌剂，每个分组堆体的基部直径2m，堆体高1m。之后每2d翻一次堆，每次翻堆调节含水量达到65％。3次翻堆后，一次发酵结束。将培养料移入室内栽培架上，通入蒸汽，待料温上升到65℃左右，维持24h左右，通风使料温维持不超过60℃。保持料温在50℃～60℃持续通蒸汽3～4d，然后通风降温到28℃左右，二次发酵结束。
实施例5
杏鲍菇菌渣堆肥方法
所用材料
菌渣：来自福建省龙海市角美镇杏鲍菇工厂，总碳质量分数为45.8％、全氮质量分数为1.44％(表1)
牛粪：购自福建省漳州市，总碳质量分数为34.8％、全氮质量分数为1.72％(表1)。
表1堆肥原料理化成分
取菌渣1.3t，加水预湿1d，使其水分达到50～60％，然后加30％牛粪，铺于菌渣上加水预湿1d，调节含水量达到75％。第3d翻堆加入1.5％的过磷酸钙，1％的盐，翻堆后添加BCB4、NFB7、BCB2等比例混合制得的混合菌剂10L，堆体的基部直径2m，堆体高1m。之后每2d翻一次堆，每次翻堆调节含水量达到75％。3次翻堆后，一次发酵结束。将培养料移入室内栽培架上，通入蒸汽，待料温上升到65℃左右，维持24h左右，通风使料温维持不超过58℃。保持料温在52℃～58℃持续通蒸汽3～4d，然后通风降温到28℃左右，二次发酵结束。
实施例6
白灵菇和香菇菌渣堆肥方法
收集白灵菇和香菇栽培后的废弃菌袋，经过破袋机脱袋、粉碎后备用，每吨菌渣(湿)加入干牛粪0.23吨、(BCB4+NFB7+BCB2)混合菌剂5L。
白灵菇菌渣与香菇菌渣比例大致1∶1，堆料含水量以65～70％为宜。当堆内温度升至60℃，维持24小时，进行第二次翻堆。以后每2～3d翻一次堆，直至温度不再升高为止。翻堆时务必均匀彻底，以便充分腐熟。发酵中如发现物料过干，应及时在翻堆时喷洒水分，经8～10d的发酵达到完全腐熟。腐熟的堆肥堆温下降，物料松散，质地松软，体积缩小，呈深褐色或黑褐色，无异味。
整个堆肥阶段，应该严格监视堆肥温度变化(通过在堆肥上安插不同深度的温度计进行控制)，并测定pH值、电导率、有机质、全氮、全磷、全钾以及速效N\P\K，以检验堆肥效果。
实验例1
解淀粉芽孢杆菌BCB4的形态及培养特征
1、菌株形态特征
将将实施例1～3中的菌株接种到LB液体培养基中，28℃培养24h，革兰氏染色后在光学显微镜下观察记录该菌株形态特征。经染色镜检，观察菌体形状(图1)。
2、菌株的菌落培养特征观察
将实施例1～3中的菌株接种到LB液体培养基中，37℃培养18h，经染色镜检，观察菌体形状，可见37℃培养18h后，BCB4菌落淡黄色，不透明，表面褶皱，有隆起，边缘不规则(图2)。
3、液体培养特征
在LB液体培养基中培养24h，液体变浑浊，静置培养后表面形成一层菌膜。
实验例2
解淀粉芽孢杆菌BCB4的系统发育树的构建
将菌株采用16SrDNA基因序列分析的方法鉴定。使用天根的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)对筛选出的纤维素降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。
PCR引物为：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行扩增。
PCR反应体系：
反应条件：
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图3所示)。PCR产物送华大科技有限公司测序，降解菌的16SrDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，选取序列相似性较高的菌株，采用MEGA6.0的Neighbor-joining法构建系统进化树。
序列比对结果表明，BCB4的16srDNA序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的16SrDNA序列相似度为98％，其系统发育树如图4所示。
实验例3
解淀粉芽孢杆菌BCB4的纤维素酶活测定
1、将实施例1～3中在液体种子培养基中培养得到的BCB4按1％的接种量接种到100mL产酶培养基中，摇床37℃，150r/min培养4d，发酵液4000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液。测定降解菌的纤维素酶活性。
(1)全酶活(FPA)的测定
每组取4支20mL刻度的试管编号，各加50mg无淀粉滤纸，再加1.5mL0.2MpH4.8醋酸缓冲液。向1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温1h。
(2)外切酶活(C1)的测定
每组取4支20mL刻度的试管编号，各加50mg脱脂棉，再加1.5mL0.1MpH5.0柠檬酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温24h。
(3)内切酶活(Cx)活力的测定
每组取4支20mL刻度的试管编号，各加1.5mL0.51％CMCpH4.8柠檬酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min。
(4)葡萄糖苷酶活力的测定
每组取4支20mL刻度的试管编号，各加1.5mL1％水杨苷pH4.8醋酸缓冲液。1号试管中加入2mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min。
上述反应时间结束后，立即取出并向2、3、4号试管中各加入2mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。用对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的OD值，在葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖量，根据葡萄糖量计算出酶活力。
发酵培养基培养4d后测定筛选菌株的纤维素酶活性，BCB4的滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(C1)、葡萄糖苷酶(β-Gase)酶活分别为(实施例1～3均值)13.81U·g-1、174.42U·g-1、0.83U·g-1、52.85U·g-1。
2、葡萄糖标准曲线测定
取8支20mL刻度的试管，分别加入1mg/mL的葡萄糖标准溶液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，补加蒸馏水至总体积为2mL，配制成浓度梯度的葡萄糖溶液。向各试管中加入2mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，立即取出冷却，用蒸馏水定容至20mL。在540nm下，以1号试管溶液作为对照调零点，测定其它各管溶液的OD值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线(图5)。
实验例4
解淀粉芽孢杆菌BCB4菌株对菌渣栽培双孢蘑菇的堆肥效应
取实施例5中的杏鲍菇菌渣堆肥方法(编号为B)与对比例CK，对比例A进行比较，三者除菌剂以外其他操作均相同(如表2所示)。
表2实验处理方案
1、菌渣堆制发酵温度变化
一次发酵过程中，自建堆开始，每天9:00和16:00用水银温度计测定堆体大约60cm深的部位，每次随机选3个点测量温度，然后取平均温度作为堆体实际温度。
温度可以作为判断微生物活动强弱的指标。本试验结果表明(图6)，不同处理堆肥温度的总体变化相似。在整个堆制发酵过程中，添加了菌剂的处理A和处理B的温度与CK相比，高5℃左右，在翻堆后，CK温度变化较大，而处理A、B温度变化较小。表明菌渣发酵过程加入BCB4组合发酵菌剂，有利于温度的升高和稳定。
2、菌渣发酵过程pH变化
pH值采用水样比10:1搅拌1h后静置，取上清用便携式pH计测定，每个样品三个重复。
培养料在一次翻堆后加入过磷酸钙，且预湿过程微生物分解有机物产生有机酸，所以发酵初始pH偏酸，随着发酵过程微生物分解作用产生氨气使堆体pH开始上升(图7)。处理A、B在二次翻堆后pH快速上升，可能是添加BCB4组合发酵菌剂，堆肥中微生物有利于含氮有机物分解，产生的大量氨使pH升高。
3、菌渣发酵过程含氮量、含碳量变化
发酵过程含氮、含碳量见(表3)，从试验结果来看，含氮量在发酵过程中逐渐增加，处理A、B和CK含氮量分别从开始的1.55％、1.54％、1.58％增加到二次发酵结束时的1.75％、1.71％、1.70％，但是二次发酵结束后，处理A、B与CK之间无明显差异；含碳量在逐渐减小，二次发酵结束处理A、B的含碳量明显低于CK。
表3堆肥过程中含氮、含碳量(％)
由此可见，菌渣发酵过程加入BCB4组合发酵菌剂，堆肥中含N量高于对照。
4、双孢蘑菇产量统计
将发酵后的菌渣，每个处理分成3份，随机放置菇架上进行铺料，铺料至厚度在20cm左右，料温稳定在28℃左右，原料颜色正常，发酵气味正常播种，播种量350g/m2。播种后20d左右.菌丝长满培养料，覆3cm左右厚的预湿红土(其中加草炭土3％、石灰1％)，补充水分，使培养料水分维持在65％左右。覆土后按常规技术进行出菇管理，16d左右出菇，统计前3潮菇的产量(表4)。
表4不同处理双孢蘑菇产量
从表4可知，处理A、B的总产量与CK相比略有提高，但总产量差异不显著。可见，表明菌渣发酵过程加入BCB4组合发酵菌剂，有利于提高菌渣堆肥质量，从而提高双孢蘑菇产量。
实验例5
解淀粉芽孢杆菌BCB4菌株对菌渣堆肥的肥力效应
以实施例6为实验基础，分为四个处理组：
处理A：菌渣直接堆制发酵，含水率维持在60％左右。
处理B(实施例6)：菌渣79％，畜禽粪20％，堆肥菌剂((BCB4+NFB7+BCB2)混合菌剂)5L，尿素1％左右，含水率维持在60％左右。
处理C：菌渣89％，堆肥菌剂(用量参照使用说明)，含水率维持在60％左右。
处理D：菌渣原样，不发酵。
整个堆肥阶段，应该严格监视堆肥温度变化(通过在堆肥上安插不同深度的温度计进行控制)，并测定pH值、电导率、有机质、全氮、全磷、全钾以及速效N\P\K，以检验堆肥效果。堆肥结束后，各处理作为玉米基肥分别施入玉米地，测定其肥力效果。
实验结果
1、菌渣堆肥发酵效果
1.1、堆肥过程中温度的变化情况
堆肥的温度变化是堆肥微生物活动和堆肥进程的最直观反映，同时也是堆肥快速腐熟的一个重要参数。本项目通过加牛粪、加菌剂处理进行堆肥示范。示范效果表明添加了牛粪的和菌剂的菌渣堆肥快速腐熟，堆内温度快速上升，堆置1d后分别达到55.6℃和59.6℃(图8)，整个堆肥过程温度持续在50℃以上10d左右，有利于杀灭病虫害及其虫卵，有利于微生物的分解和除臭。而不加牛粪和菌剂的处理，由于初期堆肥中发酵微生物缺乏，导致温度上升过慢，后期呈现降温较慢的趋势。另外，牛粪等营养物质的添加能够促进堆肥的发酵升温，但添加过量容易延长腐熟时间，不利于堆肥的快速腐熟。
1.2、电导率的变化规律
在堆肥的初期，电导率(CE)值有一个上升的过程，这是因为在堆肥开始阶段，微生物吸收了电导率(CE)反映了堆肥浸提液中离子总浓度，即可溶性盐含量，在一定范围内，溶液的含盐量与CE成正相关。
试验结果(图9)可以看出，前期，由于各物质的成分基本相似，电导率相差不大。但是还能看出微生物发酵菌剂的添加还是增加了堆肥发酵料的电导率。未进行堆置的菌渣电导率在1980us/cm。菌渣经过堆制发酵处理，CE值在堆肥过程中逐渐升高，但处理A和处理B在堆肥过程中CE值变化呈现较大的波动性，先降低后升高。这是因为处理B和处理C中添加有发酵菌剂，微生物的活动比较剧烈，分解大量的物质并产生响应的产物，在吸收和利用直接引起了堆肥电导率的剧烈变化。在此过程中，处理A的变化趋势不是非常明显，总体处于较为稳定的水平。发酵后期，处理A和处理C电导率相对增高，而处理B的电导率相对降低。这反映了处理B中的大分子物质相对降解完毕，而处理C中添加了适量的牛粪，营养物质相对丰富，降解时间没有非常彻底，处理B中未添加发酵菌剂，发酵降解速度相对缓慢，降解时间也比较长。最终3个处理的CE值均稳定在2150～3480us/cm范围之内，避免了不经处理的堆肥直接施入田中，因肥料中各种离子波动性变化而对作物生长造成影响。总的来说，白灵菇菌渣是经过一次发酵后的堆肥原料，堆肥过程中CE值虽呈现出一定波动性，但整体变化不大，远低于抑制作物生长的限定值4000us/cm。
1.3、白灵菇菌渣堆肥pH值的变化
pH是影响微生物生长的重要因素之一，大多数微生物最适宜生长的pH值为中性或弱碱性，pH值太高或太低都将影响堆肥的效果。由于白灵菇生产过程中，培养料中加入了石灰，因此，四种菌渣堆肥处理的起始pH值较高在8.3左右(图10)。在整个堆肥过程中，各处理pH值变化在8.0～9.2之间。前期，由于处理A和处理B主要成分相同都是粉碎的白灵菇菌渣，pH值处于相同的水平上。而处理C中加有部分牛粪，所以pH值偏低。在第三天时，温度和湿度都比较适合发酵菌剂的发挥作用。所以在后期整个大的环境中，处理B和处理C都处于相同的水平中，而处理A由于没有添加发酵菌剂，所以在前期升温过程中，pH值处于较低的水平，pH值升高也相对滞后，随着时间的增长，趋势与其他两个处理趋于一致。处理B和处理C由于加入了发酵菌剂，随着微生物分解作用而释放出大量氨气使得其在堆肥初期pH值快速升高；在翻堆后，氨气等物质的挥发，使得pH值逐渐降低，后期处于较为中性的水平。pH值的中性化表现出微生物的活动变缓，纤维物质分解完全。同时也预示着发酵过程的结束。
2、不同处理下菌渣堆肥速效氮、速效磷、速效钾比较
由图11可以看出，堆肥中速效氮含量先升高后降低，在堆肥结束时除“菌渣”配方外，另两个配方速效氮含量略微升高。速效磷、速效钾含量的变化不是很大，到堆肥后期，随着微生物的分解，速效磷、速效钾得到进一步的积累，含量有所上升。其中“菌渣+菌剂”配方中，速效磷的含量由堆肥初期的0.12％增加至堆肥后的0.19％,增加了58.3％，速效钾的含量由堆肥初期的1.38％增加到堆肥后的1.67％，增加了21.0％，说明通过堆肥可以提高菌渣中的速效磷、速效钾的含量。
3、不同处理下菌渣堆肥效果
在测定当地土壤中养分后，进行田间试验设计：堆肥结束后，(干品，按水分含量确定最后施用量)。根据配方施肥的要求及菌渣有机肥中养分含量，试验设6个处理，分别施入处理A(菌渣堆肥)、处理B(菌渣+牛粪+菌剂)、处理C(菌渣+菌剂)、处理D(菌渣原样)，每个处理按照600kg/亩施肥，以未施肥或只施化肥为对照(CK1、CK2)，各处理均设3次重复，每个小区面积0.5～1亩，合计示范面积12.8亩。按照均衡施肥原理，各处理养分总施用量按基肥氮8.8kg/亩、P2O59.8kg/亩、K2O13kg/亩，追肥氮12.6kg/亩、P2O51.4kg/亩、K2O4.5kg/亩设计。
从产量来看，堆肥配方为“菌渣+牛粪+菌剂”堆制的菌渣有机肥(C处理)用作玉米基肥，单位产量最高，亩均产量达509.04kg/亩，比传统栽培亩产量471.04kg/亩增产8.14％(图12)。从颗粒饱满度来看，“菌渣+牛粪+菌剂”堆制的菌渣有机肥(C处理)千粒重达到409.42g，比传统栽培387.83g增加了5.57％(图13)。从株高来看，各处理差异不显著，B处理玉米略高，株高252.36厘米(图14)。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌BCB4，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCCNO.11141。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌BCB4的液体种子培养基，其特征在于，包括以下成分：葡萄糖18～22g·L-1、蛋白胨0.8～1.2g·L-1、Mandels营养盐浓缩液90～110mL·L-1、Mandels微量元素浓缩液0.8～1.2mL·L-1、lmol·L-1柠檬酸缓冲液45～55mL·L-1；
所述Mandels营养盐浓缩液包括以下成分：KH2PO418～22g·L-1、(NH4)2SO413～15g·L-1、(NH2)2CO2～4g·L-1、CaCl2·2H2O3～5g·L-1、MgSO4·7H2O0.15～0.25g·L-1；
所述Mandels微量元素浓缩液包括以下成分：FeSO4·7H2O4.5～5.5g·L-1、ZnS04·7H2O1.2～1.6g·L-1、CoCl2·6H2O3.6～3.8g·L-1、MnSO4·H2O1.5～1.7g·L-1。
3.如权利要求2所述的液体种子培养基，其特征在于，所述培养基的pH为4.4～4.6。
4.一种菌组，其特征在于，所述菌组由权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌BCB4，以及BCB2、NFB7三种菌组成，所述BCB2和NFB7菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏编号分别为CGMCCNO.11141、CGMCCNO.11140和CGMCCNO.11142。
5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌BCB4或权利要求4所述菌组在食用菌菌渣堆肥降解中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌BCB4或所述菌组制成菌剂后再进行食用菌菌渣堆肥；
BCB4菌剂制备方法为，将BCB4菌种活化后接种至权利要求2所述的液体种子培养基中培养，得到的菌液即为BCB4菌剂；
菌组菌剂制备方法为，将BCB4、BCB2、NFB7三个菌种分别与液体培养基培养后等体积混合，得到的混合菌液即为菌组菌剂。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食用菌菌渣包括杏鲍菇菌渣、双孢蘑菇菌渣、白灵菇菌渣或香菇菌渣中的一种与多种。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在利用芽孢杆菌及其菌组进行菌渣堆肥降解时，还包括向菌渣中添加占总发酵体系质量15～35％畜禽粪。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述畜禽粪为牛粪。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌渣堆肥的最适发酵温度为50～60℃，发酵湿度为65～75％。
CN201610188044.0A 2016-03-29 2016-03-29 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用 Pending CN105602874A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610188044.0A CN105602874A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610188044.0A CN105602874A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105602874A true CN105602874A (zh) 2016-05-25

Family

ID=55983223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610188044.0A Pending CN105602874A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105602874A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106747701A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 湖南科技学院 一种利用杏鲍菇菌糠制备的烟草专用有机菌肥
CN110317746A (zh) * 2019-05-31 2019-10-11 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌cx10及其应用
CN114933986A (zh) * 2022-05-07 2022-08-23 曲阜师范大学 一株纤维素降解菌及其应用
CN114958680A (zh) * 2022-06-16 2022-08-30 河南农业大学 一种降解平菇菌渣纤维素的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘晓梅等: "菌渣纤维素降解菌的筛选与鉴定", 《农业环境科学学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106747701A (zh) * 2017-02-21 2017-05-31 湖南科技学院 一种利用杏鲍菇菌糠制备的烟草专用有机菌肥
CN110317746A (zh) * 2019-05-31 2019-10-11 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一株来自白蚁肠道的纤维素降解菌cx10及其应用
CN114933986A (zh) * 2022-05-07 2022-08-23 曲阜师范大学 一株纤维素降解菌及其应用
CN114933986B (zh) * 2022-05-07 2023-08-22 曲阜师范大学 一株纤维素降解菌及其应用
CN114958680A (zh) * 2022-06-16 2022-08-30 河南农业大学 一种降解平菇菌渣纤维素的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104817408B (zh) 一种高效生物菌肥及其制备方法
CN101941851B (zh) 采用餐厨废弃物制备生化腐植酸的技术与工艺
CN103966150B (zh) 一种农作物秸秆腐熟菌剂及其使用方法和效果
CN103232272B (zh) 一种复合有机微生物菌肥及其制造方法
CN105462878B (zh) 一种畜禽粪便高效腐熟剂及其发酵方法
CN105936881B (zh) 一种用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌及其应用方法
CN101603019B (zh) 一种高无机氮源生物复合肥及其制备方法
CN107201229A (zh) 一种具有改良土壤及调控微生物种群结构功能的生物修复剂及其制备和应用
CN100460501C (zh) 一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品
CN101333510A (zh) 一种处理污泥制备生物有机肥料的方法及其专用发酵剂
CN102617208A (zh) 一种食用菌菌渣有机肥原料及其制备方法
CN106047764A (zh) 一种运用于秸秆还田的低温有益微生物制剂产品
CN106810302A (zh) 一种养殖粪污资源化利用生产有机肥料的方法
CN103694010A (zh) 一种污泥超高温好氧发酵方法及其应用
CN107285925A (zh) 一种利用微生物制剂秸秆堆沤还田的方法
CN101717315A (zh) 一种生物防治根结线虫病的花生专用有机无机复合肥及其制备方法
CN107473786A (zh) 一种水稻秸秆还田改善土壤的方法
CN106244475A (zh) 一种具有除臭功能的耐低温堆肥发酵菌剂及其应用
CN105602874A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在食用菌菌渣堆肥降解中的应用
CN107298633A (zh) 一种秸秆堆沤用生物制剂
CN105802888A (zh) 一种降解食用菌菌渣纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用
CN101948780A (zh) 防治连作辣椒疫病的拮抗菌及其微生物有机肥料
CN106045677A (zh) 一种果树专用的有机复合生物肥的制备方法
CN103602592A (zh) 一株纤维素降解真菌及其菌剂的制备和应用
CN109835881A (zh) 一种改性生物炭、生物炭基有机肥及其制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160525