CN110923162A - 白蚁肠道放线菌的分离鉴定及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于放线菌研究领域，为了解决传统来源的天然产物发现的途径难以满足具有新结构特征或新作用特点化合物发现的需要，本发明以白蚁为新的特境微生物资源，提高一种白蚁肠道放线菌的分离鉴定及其应用，以白蚁肠道为菌源，用S固体培养基进行初筛，通过培养特征观察，然后进行纯化。再通过生理生化实验、抗菌活性测试和16SrDNA序列测试结果分析，得到一种复合菌群，经过序列对比，此复合菌群包括细黄链霉菌、黄孢链霉菌、魏氏链霉菌以及其他普通微生物。此外，测序结果表明白蚁肠道里还含有大量的具有较强抑菌能力的细黄链霉菌，其发酵产物为螺旋霉素，可以用来制备抗生素。

Description

白蚁肠道放线菌的分离鉴定及其应用
技术领域
本发明属于放线菌研究领域，具体涉及一种白蚁肠道内放线菌的分离鉴定及其应用。
背景技术
放线菌是一群革兰氏阳性、高G+C含量(＞55％)的细菌，在自然界中占据着多种不同的生态位，是生物活性化合物的重要来源，现已发现的抗生素70％来源于放线菌，其中75％的放线菌属链霉菌属。放线菌因菌落呈放线状而的得名，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。目前，从陆地到海洋，人们对各类生境的放线菌都有研究。但主要集中在来自土壤、水体等环境微生物，从中分离得到的化合物往往是已知化合物，出现全新骨架活性化合物的几率已经很低，趋同的环境和重复的研究使得新天然药物的发现率从上世纪80年代开始逐年下降。但与此同时，近年来在制药领域的进步也使得人们对药用活性物质的来源与特性有了更高的要求，已有结构特征的化合物不能适应病原的快速变化，而传统来源的天然产物发现的途径也难以满足具有新结构特征或新作用特点化合物发现的需要。因此，为了发现新型天然药源分子，寻找新的特境微生物资源显得尤为必要。
近几年昆虫共生放线菌研究进展较快，在白蚁的肠道及其巢内共生有大量的细菌、古细菌、真菌等微生物。在这些微生物群落中，放线菌是较为重要的类群。无论是高等白蚁还是低等白蚁的肠道内、巢穴及其周围土壤均含有大量的共生放线菌，它们在白蚁木质纤维素消化、肠道及巢内碳氮循环、维持肠道微环境及保护巢群免受外来病菌侵染等方面发挥着重要的作用。
发明内容
为了解决传统来源的天然产物发现的途径难以满足具有新结构特征或新作用特点化合物发现的需要，本发明以白蚁为新的特境微生物资源，提供一种白蚁肠道放线菌的分离鉴定方法及其应用。
本发明的技术方案为提供一种从白蚁肠道分离出的复合菌群，其特殊之处在于：包括细黄链霉菌、黄孢链霉菌、魏氏链霉菌以及其他普通微生物，所述细黄链霉菌占比为45-50％；所述黄孢链霉菌占比为1％～5％；所述魏氏链霉菌占比为1％～5％；余量为其他普通微生物。
进一步地，上述细黄链霉菌占比为48.05％；黄孢链霉菌占比为1.78％，魏氏链霉菌占比为2.36％。
进一步地，上述复合菌群的菌落为圆形、质地致密、表面呈较紧密的绒状、干燥、多皱；
用革兰氏染液染色后放在显微镜下观察，结果显示：待测菌呈分枝丝状，且多交错在一起，由气生菌丝、基内菌和孢子丝三部分组成，孢子丝为波曲形状；
所述复合菌群有产生淀粉酶及纤维素酶的能力；
所述复合菌群对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、以及枯草芽孢杆菌均有抑制作用。
本发明还提供一种用于从白蚁肠道分离上述的复合菌群的分离培养基，其特殊之处在于：
包括葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO40.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml。
本发明还提供一种白蚁肠道放线菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
步骤a、分离白蚁肠道放线菌
a1、采集及处理白蚁样本，获得体表灭菌后的白蚁样本；
a2、分离纯化a1处理后白蚁样本的内生放线菌；
a21、对a1处理后的白蚁样本进行解剖、研磨、温养后形成菌液；
a22、利用分离培养基对待测菌进行培养，观察菌落生长情况；所述分离培养基包括葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml；
a23、挑菌落：挑取单个的菌落，镜检，然后纯化，获得目标放线菌；
纯化培养基：S培养基(固体)：葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO40.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml；
步骤b、鉴定分离出的放线菌；
b1、放线菌的分类学鉴定；所述分类学鉴定包括形态特征鉴定及生理生化特性鉴定，获得待测放线菌的形态，产生淀粉酶及纤维素酶能力的强弱；
b2、放线菌16SrDNA序列测定，包括16SrDNA和gyrB基因的PCR扩增、PCR扩增产物的验证、回收及信息分析步骤，获得每个样本中微生物的物种及区分或影响不同样本的重要菌群；
b3、放线菌抑菌试验，检测放线菌的抗菌活性。
进一步地，上述步骤a21具体为：
a211、对a1处理后的白蚁样本饥饿处理，待白蚁样本肠道内放线菌群达到稳定后备用；
a 212、将a 211处理后的白蚁解剖为头、胸、腹三个部分；
a 213、分别收集头、胸、腹，并分别研磨；
a 214、在a 213研磨后的研磨液中分别加入无菌水，形成三类悬浮液；
a 215、将三类悬浮液分别移入已灭菌的EP管中；
a 216、将a 215的EP管放入28℃、150r/分钟的恒温摇床温养30分钟，形成三类菌液；
所述步骤a 22具体为：
a 221、在超净工作台中，分别吸取0.5ml菌液注入4.5ml无菌水的试管，混匀，作为10-1稀释液，类推依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7几种稀释度的菌液；
a 222、涂布法分离待测菌：将配制好的S培养基倒入已灭菌的培养皿内，等到凝固；从稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液中分别吸取0.1ml涂布在凝固后的S培养基上，每个稀释度涂三个平板；
a 223、将所有平板放在28℃培养箱中培养，观察菌落生长情况。
进一步地，上述步骤a 23中纯化步骤具体为：
平板划线法纯化待测菌：将挑取出的单个菌落于适量的无菌水中摇匀后，用接种环以无菌操作挑取悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线，划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养；
所述步骤b2中16SrDNA和gyrB基因的PCR扩增为：
以待测菌种的基因组作为模板，以5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，作为上游引物；5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，作为下游引物，用PCR扩增其16SrDNA基因；gyrB基因上游引物为：PF-1：GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC，下游引物为：PR-2:GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTCGGCGTCCGCCAT；
选取抗菌大肠杆菌(LWCC1033)、枯草芽孢杆菌(LWCC1005)、金黄色葡萄球菌(LWCC1002)为放线菌抑菌试验中的菌株。
本发明还提供一种从白蚁肠道分离出的复合菌群的发酵液。
本发明还提供一种上述发酵液的制备方法，包括以下步骤：
将分离得到的放线菌活化后接种于发酵培养基中，28℃发酵7d，期间持续搅拌；接种量为1％；
所述发酵培养基为：S培养基(液体)：葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、水100ml。
本发明还提供一种利用上述发酵液生产螺旋霉素抗生素的方法，包括以下步骤：
步骤一、将发酵液加1.0％～1.5％的硫酸铝并调节pH值4.5～5.0，搅拌，静止，使蛋白质充分沉淀；
步骤二、将步骤一处理后的发酵液过滤，收集滤液；
步骤三、醋酸丁酯提取；
调节滤液pH值为8.5～9.0，将醋酸丁酯与滤液混合后静置分层，收集有机相层；
步骤四、水洗、水提、脱丁酯；
水洗：用无盐水洗涤步骤三收集的有机相，静置分层，收集醋酸丁酯有机相，直至放水至乳化层为白色时为止；
水提：用1moL/L氯化氢和0.05mmoL/L磷酸二氢钠缓冲液调无盐水的pH值为2.0～2.5，将该无盐水与醋酸丁酯有机相混合搅拌，静置分层，收集水提液层；
脱丁酯：用1moL/L氢氧化钠回调水提液pH值为5.0～5.5，用0.02MPa干净空气和真空彻底去除醋酸丁酯，至无丁酯味为止；
步骤五、结晶，干燥包装。
本发明的有益效果是：
1、本发明以白蚁肠道为菌源，用S固体培养基进行初筛，通过培养特征观察，然后进行纯化。再通过生理生化实验、抗菌活性测试和16SrDNA序列测试结果分析，得到一种包含了细黄链霉菌、黄孢链霉菌、魏氏链霉菌以及其他普通微生物与具有产生纤维素酶的放线菌菌种。其中细黄链霉菌占比最多，为48.05％。其抑菌作用较强，可以利用放线菌的发酵产物来制作抗生素；
2、本发明通过工艺论证，对该精制车间各生产环节所采用的生产方法、可行性、优缺点进行分析，提供精制螺旋霉素的工艺路线，经充分验证，其产量能达到设计产量的要求，并且设备选型合理。
附图说明
图1为待测菌落形态；
图2为待测菌的10倍显微镜下的结构图；
图3为待测菌的40倍显微镜下的结构图；
图4为滴加碘液后的淀粉培养基；
图5为30分钟后的淀粉培养基；
图6为培养待测菌两周后的纤维素培养基；
图7为样品序列测序质量分布图；
图8为放线菌种属以及比例；
图9为放线菌物种等级丰度；
图10为放线菌抑菌效果图；
图11为利用放线菌制备螺旋霉素抗生素的工艺流程图；
图12为白蚁样品内放线菌的分离及鉴定流程图；
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步地描述。
实施例一
本实施例主要涉及白蚁样品内放线菌的分离和纯化，主要包括下述步骤：
1.1、白蚁样品采集及处理
(1)在合肥工业大学树林中取样，然后对10只白蚁进行体表消毒：
(2)灭菌水清洗白蚁体表；
(3)75％乙醇溶液洗涤(放入搅拌)1～2分钟；
(4)3.5％次氯酸钠浸泡30s；
(5)无菌水洗涤3次以上。
1.2、白蚁样品的内生放线菌的分离、纯化
(1)白蚁样本进行一个星期的饥饿处理，待样本肠道内放线菌群达到稳定后备用；
(2)利用灭菌剪刀将表面消毒的白蚁样本解剖分为头、胸、腹三个部分；
(3)收集头、胸、腹分别研磨；
(4)白蚁样本的头、胸、腹研磨液用500μl无菌水悬浮；
(5)利用移液枪将悬浮液移入已灭菌的1.5mlEP管中；
(6)将EP管放入28℃、150r/分钟的恒温摇床温养30分钟；
(7)在超净工作台中，用吸管吸取0.5ml菌液注入4.5ml无菌水的试管，混匀，作为10-1稀释液，类推依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7几种稀释度的菌液；
(8)涂布法分离待测菌：将配制好的固体S培养基倒入已灭菌的培养皿内，等到凝固。从稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液中分别吸取0.1ml涂布在S培养基上，每个稀释度涂三个平板；其中S培养基(固体)为：葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、琼脂20.00g、水100ml。
(9)培养：将平板放在28℃培养箱中培养，每天观察菌落生长情况；
将待测菌株接种到S培养基置于28℃恒温生化培养基2周后，直接观察其形态，从图1可以看出，菌落为圆形、质地致密、表面呈较紧密的绒状、干燥、多皱。菌丝生长在培养基内，菌落与培养基结合紧密，不易挑起或挑起后不易破碎。
(10)挑菌落：挑取单个的菌落，镜检，然后纯化；
(11)平板划线法纯化待测菌：取菌落于适量的无菌水中摇匀后，用接种环以无菌操作挑取悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
1.3、放线菌的分类学鉴定
形态特征鉴定
将待鉴定的菌株接种到载玻片，用革兰氏染液染色后用光学显微镜观察制备好的载玻片，有无气生菌丝和孢子丝、基内菌丝状态，是否有包囊产生。
如图2及图3所示，待测菌呈分枝丝状，且多交错在一起，由气生菌丝、基内菌和孢子丝三部分组成，孢子丝为波曲形状。
生理生化特性鉴定
淀粉水解实验
判断分离菌种淀粉酶的产生能力，将待测菌种利用打孔器接于淀粉琼脂平板，放入28℃的培养箱中培养1～2周。如果菌落周围形成透明圈，则为阳性，圈的大小反应了菌种产生淀粉酶能力的强弱。若菌落周围染成蓝色，不出现透明圈，则说明菌种不产生淀粉酶。
取出在培养箱中培养1周的淀粉培养基，在酒精灯旁滴加碘液后，放置在抽屉。如图4与图5所示，30分钟后，菌落周围出现透明圈，直径约为4.36cm。现象表明待测菌有产生淀粉酶的能力，并且能力较强。
其中淀粉培养基：可溶性淀粉20.00g、KNO3 1.00g、NaCl 0.50g、K2HPO4 0.50g、MgSO4·7H2O 0.10g、琼脂20.00g，蒸馏水1000ml，pH 7.2～7.4。
纤维素水解实验
检测菌种产生纤维素酶的能力，将待测菌种利用打孔器接于纤维素刚果红培养基上方，放入28℃的培养箱中培养1～2周，之后观察菌落周围是否形成透明圈，有透明圈则是阳性，反之阴性。
取出在培养箱中培养2周的纤维素刚果红培养基，用1mg/mL刚果红染液染色15分钟后，再滴加1mol/L的NaCl脱色液进行脱色。10分钟后，如图6所示，观察到菌落周围出现透明圈，直径约为2.06cm。现象表明待测菌有产生纤维素酶的能力，且能力较强。
纤维素刚果红培养基：CMC-Na 2.00g，(NH4)2SO4 2.00g，MgSO4·7H2O 0.50g，K2HPO4 1.00g，NaCl 0.50g，刚果红0.40g，琼脂20.00g，pH自然。
1.4、16SrDNA序列测定
16SrDNA和gyrB基因的PCR扩增
以待测菌种的基因组作为模板，以5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,作为上游引物；5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3,作为下游引物，用PCR扩增其16SrDNA基因。gyrB基因上游引物为：PF-1：GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC，下游引物为：PR-2:GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTCGGCGTCCGCCAT，具体的PCR体系和PCR程序见表1、2。
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0002275194210000081
表2 PCR扩增体系
Figure BDA0002275194210000082
PCR产物的验证
配制1％(w/v)的小孔琼脂糖凝胶，放入装有1xTAE的电泳槽中，将4μl的PCR产物小心地加入到梳孔中，并且点入4μl、2kb的DNA marker作为对照，用90～110V电压的电泳20分钟左右，紫外灯下结果。
PCR产物的回收
PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收，回收采用AMPure XT beads回收试剂盒。
信息分析
(1)数据拆分
在对16SrDNA进行可变区测序的时候，我们选取的测序区域为V3-V4区，V3和V4区长度约为469bp。早期二代454平台测序读长在500～700bp可满足V3-V4区测序长度，但454测序通量较低，测序成本相对较高，逐渐退出市场。Illumina MiSeq平台可通过双端测序(PE300)的方法来满足V3-V4区的测序长度，且测序通量大幅度提高。由于MiSeq平台的通量很高，通常一次测序可产生12G的数据量，因此可同时对多个样品进行测序。因此，对测序获得的双端数据，首先需要根据barcode信息对样品进行数据拆分。
(2)数据拼接和过滤
为了还原真实的V3-V4区序列碱基，我们需要根据双端序列的overlap关系，将序列拼接(merge)成长的tag，并将序列上建库引入的barcode和引物序列去除。此外，测序仪按照荧光信号来判断测序碱基的类型(ATCG)，质量值是识别碱基的错误概率，为了保证后续结果的可靠性，需要将质量值低(错误率高)的序列去除。然后将嵌合体序列(嵌合体序列是指序列前半段可能属于read1，后半段属于read2，拥有两条信息的序列。可能产生的原因：一是在PCR扩增时，两条不同的序列产生杂交、扩增的序列；二是序列拼接的过程中也可能产生嵌合体)过滤后，进行Q20、Q30等质控分析，获得最终的clean data。
(3)OTU聚类
由于高通量测序产生成千上万条的16S测序序列，如果对每条序列都进行注释处理，一方面工作量大，比较耗时；另一方面，16S扩增和测序过程中可能引入错误，从而降低数据的准确性。此外，16SrDNA建库过程中按照设定引物序列对高变区(V3-V4区)进行PCR扩增，因此存在大量的重复性序列。将相似性序列(一般按照序列相似度大于97％)聚类为OTU(操作分类单元，可认为一个物种)，每个OTU对应于一条不同的16SrDNA序列(代表序列)，OTU聚类不仅可以提高分析效率，也可以在聚类中去除测序错误的序列(比如Singletons序列，只有一条的序列)，保证数据分析的准确性。
(4)多样性分析
通过OTU聚类分析，可以得到不同样品中OTU的丰度，从而评估每个样品中微生物的多样性，包括对样品中含有OTU数目(丰富度)和群落结构的稳定性(均匀度)计算和评估。通过OTU稀释曲线分析，评估测序量是否达标(如果随着测序量的增加，样品中OTU数目显著增加，说明测序量不足，不能反应样品中的大部分微生物物种)。此外，还可以根据OTU丰度表计算不同样品间的物种组成结构差异(beta多样性分析)，从而研究不同样品(分组)物种组成异同。
(5)物种注释和统计分析
根据每个OTU代表序列与16S rDNA数据库(RDP和NT-16S)比对结果，对OTU进行物种分类统计，获得不同分类水平(界门纲目科属种)物种丰度表。对样品(分组)在不同分类水平的具体物种组成分析(如优势物种柱状图分析，直观展示不同样品(分组)的物种组成)，检验组间存在显著性差异的物种，从而找到区分或影响不同样品(分组)的重要菌群(biomarker)。
16SrDNA和gyrB基因的系统发育分析
将获得的16SrDNA和gyrB基因序列提交到NCBI和EzBioCloud网站进行分析对比，将得到的结果用软件MEGA 5.05、Clustalx 1.83构建系统进化树。
如图7所示，横坐标表示测序序列的碱基位置，纵坐标表示碱基质量值(Q值)。Q20反映了数据的质量，表示测序结果中，由于测序仪器造成的某个位置的碱基错误概率小于1％。Q30表示测序结果中，由于测序仪器造成的某位置碱基错误概率小于0.1％。在测序的起始，测序质量都很高，随着反应进行，测序质量有所下降。
经过16SrDNA测序得出待测菌为放线菌，其中细黄链霉菌占比为45-50％；黄孢链霉菌占比为1％～5％；魏氏链霉菌占比为1％～5％；余量为其他普通微生物。
如图8所示，放线菌最优种属比例，包含了细黄链霉菌、黄孢链霉菌、魏氏链霉菌以及其他普通微生物与具有产生纤维素酶的放线菌菌种。其中细黄链霉菌占比最多，为48.05％，黄孢链霉菌占比为1.78％，魏氏链霉菌占比为2.36％。
从图9可以得出放线菌的样品曲线在0～300丰度间陡峭，证明样品在此丰度间差异很大。样品在400～800丰度间平缓，则样品在此丰度差异很小。
1.5、放线菌抑菌试验
指示菌
革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌。革兰氏阴性菌：大肠杆菌、沙门式杆菌。
方法
(1)筛选放线菌菌株接种到S培养基中，摇瓶发酵7天(28℃，120r/分钟)，将发酵液于5000rmp/分钟离心10分钟，收集上清液，采用琼脂扩散法检测菌株的抗菌活性。
(2)琼脂扩散法：提前准备好直径为0.5cm的滤纸片，提前一天接种指示菌在肉汤培养基中，摇瓶发酵(37℃，120r/分钟)。将灭菌好的LB培养基冷却至培养基温度适宜的状态，加入接有指示菌的液体培养基中，充分摇匀倒入培养皿中，待培养基凝固后，用灭过菌的镊子夹取滤纸片并蘸取发酵上清液，然后把滤纸片放在固体培养基上，放入培养箱中，培养2～3天，观察是否有抑菌圈的产生。LB培养基：胰蛋白胨1.00g、NaCl 1.00g、酵母提取物0.50g、琼脂1.5～2g、水100ml、pH 7.0。
从图10可以看出放线菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、以及枯草芽孢杆菌均有抑制作用，且抑制效果为：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。
通过实验也能分析出放线菌的抑菌作用较强，可以利用放线菌的发酵产物来制作抗生素。
实施例二
本实施例利用实施例一分离出的放线菌制备螺旋霉素抗生素，其工艺流程如图11所示，主要包括菌种活化、配置液态发酵培养基、灭菌、发酵、过滤、浓缩，醋酸丁酯提取、水洗、水提、脱丁酯、结晶、产品检测及干燥包装的过程。
工艺操作要点
1.发酵培养基配制与灭菌：使用固液混合罐配制培养基，并通过泵转移至压力蒸汽灭菌锅中加热至121℃(0.1MPa)，保持20分钟后降温冷却，泵入发酵罐中接种。
2.发酵：按1％接种量，向发酵罐中加入菌种液，使用发酵罐于28℃发酵7d，期间持续搅拌。将发酵液加1.0％～1.5％的硫酸铝并调节pH值4.5～5.0，搅拌，静止，使蛋白质充分沉淀。
3.过滤：发酵液首先通过板框过滤机过滤。各板框机的进料压力相同，过滤压力最初不得超过0.03MPa，待每个出料嘴都出料后可以提高至0.05MPa，滤速减慢，至0.10～0.15MPa，整批过滤完后，用3.5～4.0m3/次的水顶洗，用30％(V/V)低单位(400U/mL以下)酸水顶洗。接着过滤液由水输送至滤液贮池，滤液再通过泵送至混合萃取罐。
4.醋酸丁酯提取：用5moL/LNaOH调过滤液pH值8.5～9.0，将醋酸丁酯泵入混合萃取罐。启动搅拌机搅拌(80～100r/min)混合后静置分层。若干小时后，如出现乳化层，则用高速离心机将丁酯相和水相分开。
5.水洗：丁酯提取液由萃取罐泵送到水洗罐。然后用40℃、50％(V/V)无盐水洗涤2次，每次洗涤均间歇搅拌(转速80～100r/min)1min，重复3次，静置分层40～60min，当放水至乳化层为白色时为止。
6.水提：水洗后再泵入水提灌。按水提液为30000～50000U/mL计算无盐水。用量：用1moL/L氯化氢和0.05mmoL/L磷酸二氢钠缓冲液调pH值为2.0～2.5，与丁酯提取液混合搅拌1min，重复3次，静置分层40～60min，分2次提取，合并2次水液，用真空泵抽到脱溶罐。
7.脱丁酯：水提液通过真空泵缓缓输入脱丁酯罐。用1moL/L氢氧化钠回调pH值5.0～5.5，加碱液要慢，防止局部结膜，用0.02MPa干净空气和真空彻底去除，至无丁酯味为止，防止跑料。
8.结晶：螺旋霉素颗粒的真密度可以使用比重瓶法测量，因为螺旋霉素在正辛烷中的溶解度很小，而且正辛烷的密度较小，因此正辛烷可作为测量的流体介质，通过试验得螺旋霉素的真密度为1.10g/cm3。
9.干燥包装：将颗粒在真空干燥箱内真空度为99990Pa以下，水温80℃，每2h翻料1次，如有结块必须压碎。干燥时间10h左右，当水分达到15％以下时停止。干燥后进入最后包装阶段，将干粉分装于8kg的木桶或3kg的铁桶内，桶内用3层包装，塑料袋外层为1层牛皮纸，最内一层仍为塑料袋，用绳扎好。
物料衡算
1、基础数据
生产规模：10吨/年
生产天数：320天/年
接种量：15％
倒罐率：1％
发酵周期：8天
每天放罐：2罐
发酵装料系数：70％
发酵液收率：95％
提炼总收率：70％
种子培养基配比(g/L)：牛肉膏6％，葡萄糖4％，KH2PO4 1％，MgSO4 1％
生产培养基配比(g/L)：葡萄糖4％，黄豆饼粉0.8％，玉米浆1.5％，(NH4)2SO40.5％，豆油0.2％，KH2PO4 0.01％，CaCO3 0.04％
2、物料衡算
首先计算生产1000kg成品链霉素所需耗用的原辅材料及其他物料量：
1)发酵液量：V1＝1000×800÷[25000×(1-1％)×95％×70％]＝48.61m3
2)种子液量(接种量为15％):V2＝V1×15％＝7.292m3
3)牛肉膏耗用量：种子液用量：V2×6％＝7.292×103×6％＝437.52kg
4)葡萄糖耗用量：种子液用量：V2×4％＝7.292×103×4％＝291.68kg
发酵液用量：V1×4％＝48.61×103×4％＝1944.4kg
葡萄糖总共耗用量：291.68+1944.4＝2236.08kg
5)KH2PO4耗用量：种子液用量：V2×1％＝7.292×103×1％＝72.92kg
发酵液用量：V1×0.01％＝48.61×103×0.01％＝4.861kg
KH2PO4总共耗用量：72.92+4.861＝77.781kg
6)MgSO4耗用量：种子液用量：V2×1％＝7.292×103×1％＝72.92kg
7)黄豆饼粉耗用量：发酵液用量：V1×0.8％＝48.61×103×0.8％＝388.88kg
8)玉米浆耗用量：发酵液用量：V1×1.5％＝48.61×103×1.5％＝729.15kg
9)(NH4)2SO4耗用量：发酵液用量：V1×0.5％＝48.61×103×0.5％＝243.05kg
10)豆油耗用量：发酵液用量：V1×0.2％＝48.61×103×0.2％＝97.22kg
11)CaCO3耗用量：发酵液用量：V1×0.04％＝48.61×103×0.04％＝19.444kg则10t成品链霉素所消耗的材料如表3所示。
表3 10t成品链霉素所消耗的材料总量
Figure BDA0002275194210000141
3、设备选型
3.1、设备选型原则
(1)合工艺生产的要求，保证产品的质量和产量。
(2)根据车间食品工厂设计的规模和技术力量，选择技术先进，经济合理的设备。一般大型生产车间工厂可以采用自动化、机械化程度高的设备，小型车间工厂可采用一些简单的设备。
(3)所选择的设备可以充分利用原料，能耗小，效率高，体积小，维修方便，劳动强度低。
(4)所选择的设备，不仅符合工艺卫生条件，易清洗装拆，与产品接触的设备材料必须耐腐蚀以避免造成对产品的污染。
(5)选用国内技术上已经成熟的设备，设备结构布局合理，材料能够适应各种特定的工作条件。
(6)在国内比较落后的设备部分，可根据条件的许可，从国外引进技术先进价格合理，适合于国内使用的设备，从中学习，提高国内生产水平，以利于加快产品工业的发展。
(7)便于控制，在各工艺参数和程序各方面需有合理的控制系统，尽量采用整个生产线自动控制方式。
3.2、设备选型
(1)菌种保藏冷库
菌种保藏冷库可以利用低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种条件保藏菌株，使微生物的代谢处于相对静止状态。同时该法可用于细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌及病毒的保藏。因而具有保藏菌种范围广、时间长(10-20年)、存活率高等特点，是目前最有效的菌株保藏方法之一。菌种液为25L，故使用型号为TF-86-50-LA的菌种保藏冷库。
(2)立式储罐
菌种液为7292L，使用成都德明机电设备制造有限公司制造的型号为CG2000的立式储罐4个。
(3)发酵罐
发酵工序一共输入均匀12152.5L，故用无锡雷特重工装备有限公司生产的HND-GJ-15000L 1个。
本设备适用于食品、生物制品、保健品等的发酵，发酵罐是发酵工序的关键设备。该设备全部用不锈钢制作，配有高压水自动喷淋清洗系统，夹套中可通低温冷却水，传动部位采用机械密封，防爆电机确保生产过程符合GMP质量标准。
(4)多带式过滤器
袋式过滤机是一种压力式过滤装置，主要有过滤筒体、过滤筒盖和快开机构、不锈钢滤袋加强网等主要部件组成，滤液由过滤机外壳的旁侧入口管流入滤袋，滤袋本身是装置在加强网篮内，液体渗透过所需要细度等级的滤袋即能获得合格的滤液，杂质颗粒被滤袋拦截。该机换滤袋方便，过滤基本无物料消耗。袋式过滤器具备构造合理、密封性好、流通才能强、操作简便等长处。尤其是滤袋侧漏机率小，能保障过滤精度，并能快捷地改换滤袋，使得操作成本下降。滤器内外表面采取机械喷砂抛光解决，平均、易清洗。我们知道，袋式过滤器所采取的过滤方法是侧进侧出的方法，也可以采取侧进底出的方法，通过管道中的压力将过滤液体介质压入或抽入袋式过滤器桶体，要过滤的液体介质经由电抛光冲孔支持滤蓝承托的过滤袋的过滤，发生变化的固液分别到达液体介质被过滤的结果。
发酵后的菌液为25249L，故可以选择上海清筑过滤系统有限公司制造的型号为HT-80-12-MT的多带式过滤器。
(5)沉淀罐
该沉淀工段需要沉淀的物料总体积为7350L，无锡雷特重工装备有限公司生产的JC—3000型沉淀罐：容积3000m3，工作温度－15℃～常温，热传介质最高工作压力0.25MPa，工作介质工作压力0.01MPa，传热系数150～200kJ/m2·h·℃，搅拌功率0.75kW，搅拌转速250r/min，外形尺寸800×800×2300mm，重量1260kg。故该沉淀罐满足该工段工艺需求。
本设备适用于食品、生物制品、保健品等的沉淀，沉淀罐是沉淀工序的关键设备。该设备全部用不锈钢制作，配有高压水自动喷淋清洗系统，夹套中可通低温冷却水，传动部位采用机械密封，防爆电机确保生产过程符合GMP质量标准。
(6)高速离心机
离心机需要处理额物料总体积为36L，辽阳隆达制药机械有限公司生产的GF75型号离心机：生产能力670L/h，有效高度450mm，沉积容量2.67L,最高转速21000r/min，最大分离因数22500，进料口喷嘴直径3/4/6，物料进口压力≥0.05MPa，电机类型：直流高速电机，电机功率1.5kW，外型尺寸500×700×1300mm，重量300kg。故该设备符合离心段工艺需求。
该设备具有分离效率高，便于拆卸维修，占地面积小等特点。主要用于分离各种难分离的乳浊液，特别适用于二相密度差甚微的液、液分离(比重差大于0.1％)，以及含有少量杂质的液、液、固三相分离。油品类的分离，食用油脱水及脱蜡，各种糖浆剂的分离；全血分离--从全血中分离血浆、血球；生物制品的分离；油水分离，污水处理等。
(7)冷凝器
上海欣谕仪器有限公司生产的XY—FD—8型冷凝器：捕水能力：15kg/24h，干燥温度：－55℃～+60℃，有效冻干面积0.8m2～1m2，外形尺寸1500×900×800mm，功率5700W。故该设备符合冷凝段工艺的需要。
本设备具有样品原位预冻功能，预冻温度低，有利于样品冻速冻；超低温冷凝盘管，大大提高其捕水能力，防止水分逃逸到真空泵中；采用进口压缩机制冷机组，性能稳定可靠；搁板带加热系统，可预设加热程序，由PID智能调节，分层控温，人机界面采用大屏幕液晶屏，以曲线和数据的方式，同时提供给用户有关冻干进程的更多信息，并配有上位机通讯接口，大大提高了冻干速度。
(8)结晶罐
选用上海宇舰机械设备有限公司的型号为Y-J-1000的结晶罐，该结晶罐夹套形式选用中空螺带式搅拌结构可增大换热面积，提高换热效率，提升结晶产能，且进料出料方便。搅拌系统采用无级调速装置，搅拌轴转速调节范围大，搅拌均匀，结晶体均匀。结晶罐上安装0.2μm疏水性通气过滤器，罐内能承受高温蒸汽，配备卫生压力表。设备罐体外采用卫生级快开接口。配备有温度计，2个视镜，清洗球及氮气进口等接口。密封装置采用特殊的卫生级机械密封，确保物料不受污染。本套设备夹套内可通入蒸汽或冷媒以使物料处于最佳温度下，具有使用效率高，操作方便等优点。结晶罐采用进口316L或304不锈钢制作，内壁采用电解镜面抛光或机械抛光，外壁采用304全焊接结构保温制作而成，外表面采用镜面或亚光处理，可根据客户具体要求制作。
(9)包装机
需要包装的成品质量为17kg，河北跃达电器设备有限公司生产的DXDC—Y60型包装机：包装速度(袋/分)40—60，功率1000w，制袋尺寸(mm)长20—120宽35—80，计量范围(1—50ml),外型尺寸625×750×1550mm，机重170kg。故该设备符合包装工艺的需要。
本机特点：本机型采用智能数控系统，粉末螺杆填充装置是一套独立的计量填充系统，配置可调式计量容杯，采用高精度步进电机驱动，螺杆进行填充。在机器计量范围内可由几种大小不同的螺杆完成不同的计量范围。操作简单、制袋精准、性能稳定可靠。
进口步进电机拉袋机构，可自动完成制袋、计量、充填、封合、切断、打印批号等功能。
4、年产量
每日三班，8小时一班，年工作日320天，生产周期为8天，采用单罐单批式发酵，即320÷8＝40个周期。每周期产量250kg，则年产量为250×40＝10000kg＝10t。
每周期处理发酵液量为48.61×1000÷4＝12152.5L。
每千克售价1000元，则年总收益额为10000×1000＝1000万元/年。
5、人员安排
安排一男一女2名员工在中央控制间。
安排1名男员工观察并记录控制点仪表数据，并在生产关键点进行检测。
安排2名男员工将仓库中的原料用手推车运送至相应进料处。
安排一男一女2名员工在包装完成时对产品包装是否完好进行检查，并抽样检测产品各项指标。
安排班长和副班长各一名，对生产过程进行监控，进行技术监督以及小型维修工作，保证生产过程干净、安全的进行。
因此车间每班需要工人11人，其中男员工8人，女员工3人。
6、原料采购
由表4可知每周期各物料成本合计
表4每年原料用量及价格汇总
Figure BDA0002275194210000181
Figure BDA0002275194210000191
7、水电费
水费：约为1000t×2元/t＝2000元。
电费：采用电网供电，属于普通工业电价，类型为1～10千伏，电价为2.6元
每度，则电费约为150000度/年×2.6元/度＝39万元/年。
8、员工工资
11人×100元/班×3班/天×320天/年＝105.6万元/年。
9、包材费
0.2元/盒×5000000＝100万元。
10、利润计算
表5年成本汇总
Figure BDA0002275194210000192
Figure BDA0002275194210000201
如表5所示，每年成本为759.3万元(其中设备购置费可均摊至每年，则其余成本为718.3万元)。由生产安排可知年收入为1000万元。总共投资1000万，设x年回本，忽略固定资产贬值率，则
1000·x-718.3·x-41≥1000
x≥3.70，即4年可以回本。
11、车间布置
车间布置的依据
(1)生产工艺流程图
(2)物料衡算数据及物料性质，包括原料、半成品、成品、副产品的数量及性质，三废的数量及处理方法。
(3)设备资料。包括设备外形尺寸，重量，支撑形式，保温情况及其操作条件，设备一览表等。
(4)公用系统耗用量，供排水、供电、供热、冷冻、压缩空气、外管资料等。
(5)土建资料和劳动安全、防火、防爆资料。
(6)车间组织及定员资料。
(7)有关布置方面的一些规范资料。
车间布置设计的原则
(1)车间布置应符合生产操作的要求
a.考虑设备占位要求。
b.同类设备尽可能集中布置。
c.设备尽量对称、紧凑。
(2)车间布置应符合设备安装、检修的要求
a.根据设备大小及结构，考虑设备安装，检修及拆卸所需的窨和面积。
b.满足设备顺利进出车间的要求。
c.通过楼层的设备，楼面上要设置吊装孔。
d.必须考虑设备的检修和拆卸以及运送物料所需要的起重设备。
(3)车间布置应符合厂房建筑的要求
a.凡是笨重或运转时会产生很大振动的设备，如压缩机、粉碎机、大型通风机、离心机等，应该尽量布置在厂房的底层，以减少厂房楼面的荷载和振动。
b.有剧烈振动的设备，其操作台和基础不得与建筑物的柱、墙连在一起，以免影响建筑物的安全。
c.设备布置时，要避开建筑的柱子及主梁。
d.设备不应该布置在建筑物的沉降缝或伸缩缝处。
(4)车间布置应符合节约建设投资的要求
a.节约用地，合理布置、优美流畅。
b.厂房非高层是近代工厂的设计特点。
c.工艺管道应集中布置，要尽可能的缩短设备间管线，供气、供无菌空气、供电的设备位置应尽量靠近负荷中心，使管线最短。
d.尽量采用一般的土建结构，尽可能少用或不用特殊的土建结构。
(5)车间布置应符合安全、卫生和防腐蚀的要求
a.车间内空气清洁、通风、采光良好、保持四壁和上下面清洁，地面采用冲洗不积水，车间内采取防止水蒸气冷凝措施以免污染产品。
b.车间要便于清扫，有防尘、防蝇、防鼠等的措施，有洗手，污水排放设备。
车间布置设计的内容
(1)车间布局
a.大小：车间面积大小为1152m2。
b.设备摆放：设备分两排布置，单排设备间距均为1.5m。1～5号设备中心距柱子2m，5号设备距右墙2m；6～10号设备中心距墙2m，十号设备距右墙2m。
c.流程：设备安装流向为S型。
(2)车间附属工程设计
车间附属工程设计是指分布在车间总体建筑内的非生产性或非直接工艺生产性用房，本车间附属区域包括更衣室、菌种库、杂物间、卫生间、产品检验室、成品室等，面积共计600m2
本实施例提出年产10t螺旋霉素抗生素车间的设计方案。通过工艺论证，对该精制车间各生产环节所采用的生产方法、可行性、优缺点进行分析，证明该精制工艺路线可行。通过物料衡算，计算各工段的物料处理量、产量，并根据计算结果，进行设备选型，确定设备的数量、型号、生产厂家。经充分验证，其产量能达到设计产量的要求，并且设备选型合理。根据物料衡算及设备选型结果进行车间的平面布置设计，本精制车间设计面积为1752m2，形式为矩形。分更衣室、菌种库、杂物间、卫生间、产品检验室、成品室和生产区，且该车间布置满足生产要求。

Claims (10)

1.一种从白蚁肠道分离出的复合菌群，其特征在于：包括细黄链霉菌、黄孢链霉菌、魏氏链霉菌以及其他普通微生物，所述细黄链霉菌占比为45-50％；所述黄孢链霉菌占比为1％～5％；所述魏氏链霉菌占比为1％～5％；余量为其他普通微生物。
2.根据权利要求1所述的从白蚁肠道分离出的复合菌群，其特征在于：所述细黄链霉菌占比为48.05％；黄孢链霉菌占比为1.78％，魏氏链霉菌占比为2.36％。
3.根据权利要求1所述的从白蚁肠道分离出的复合菌群，其特征在于：所述复合菌群的菌落为圆形、质地致密、表面呈较紧密的绒状、干燥、多皱；
用革兰氏染液染色后放在显微镜下观察，结果显示：待测菌呈分枝丝状，且多交错在一起，由气生菌丝、基内菌和孢子丝三部分组成，孢子丝为波曲形状；
所述复合菌群有产生淀粉酶及纤维素酶的能力；
所述复合菌群对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、以及枯草芽孢杆菌均有抑制作用。
4.一种用于从白蚁肠道分离权利要求1所述的复合菌群的分离培养基，其特征在于：
包括葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO40.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml。
5.一种白蚁肠道放线菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、分离白蚁肠道放线菌
a1、采集及处理白蚁样本，获得体表灭菌后的白蚁样本；
a2、分离纯化a1处理后白蚁样本的内生放线菌；
a21、对a1处理后的白蚁样本进行解剖、研磨、温养后形成菌液；
a22、利用分离培养基对待测菌进行培养，观察菌落生长情况；所述分离培养基包括葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO40.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml；
a23、挑菌落：挑取单个的菌落，镜检，然后纯化，获得目标放线菌；
纯化培养基：S培养基(固体)：葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO4 0.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、甲酸0.05g-0.5g、琼脂20.00g、水100ml；
步骤b、鉴定分离出的放线菌；
b1、放线菌的分类学鉴定；所述分类学鉴定包括形态特征鉴定及生理生化特性鉴定，获得待测放线菌的形态，产生淀粉酶及纤维素酶能力的强弱；
b2、放线菌16SrDNA序列测定，包括16SrDNA和gyrB基因的PCR扩增、PCR扩增产物的验证、回收及信息分析步骤，获得每个样本中微生物的物种及区分或影响不同样本的重要菌群；
b3、放线菌抑菌试验，检测放线菌的抗菌活性。
6.根据权利要求5所述的白蚁肠道放线菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤a21具体为：
a211、对a1处理后的白蚁样本饥饿处理，待白蚁样本肠道内放线菌群达到稳定后备用；
a 212、将a 211处理后的白蚁解剖为头、胸、腹三个部分；
a 213、分别收集头、胸、腹，并分别研磨；
a 214、在a 213研磨后的研磨液中分别加入无菌水，形成三类悬浮液；
a 215、将三类悬浮液分别移入已灭菌的EP管中；
a 216、将a 215的EP管放入28℃、150r/分钟的恒温摇床温养30分钟，形成三类菌液；
所述步骤a 22具体为：
a 221、在超净工作台中，分别吸取0.5ml菌液注入4.5ml无菌水的试管，混匀，作为10-1稀释液，类推依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7几种稀释度的菌液；
a 222、涂布法分离待测菌：将配制好的S培养基倒入已灭菌的培养皿内，等到凝固；从稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液中分别吸取0.1ml涂布在凝固后的S培养基上，每个稀释度涂三个平板；
a 223、将所有平板放在28℃培养箱中培养，观察菌落生长情况。
7.根据权利要求6所述的白蚁肠道放线菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤a 23中纯化步骤具体为：
平板划线法纯化待测菌：将挑取出的单个菌落于适量的无菌水中摇匀后，用接种环以无菌操作挑取悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线，划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养；
所述步骤b2中16SrDNA和gyrB基因的PCR扩增为：
以待测菌种的基因组作为模板，以5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，作为上游引物；5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，作为下游引物，用PCR扩增其16SrDNA基因；gyrB基因上游引物为：PF-1：GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC，下游引物为：PR-2:GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTCGGCGTCCGCCAT；
选取抗菌大肠杆菌(LWCC1033)、枯草芽孢杆菌(LWCC1005)、金黄色葡萄球菌(LWCC1002)为放线菌抑菌试验中的菌株。
8.一种权利要求1或2从白蚁肠道分离出的复合菌群的发酵液。
9.一种权利要求8所述发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将分离得到的放线菌活化后接种于发酵培养基中，28℃发酵7d，期间持续搅拌；接种量为1％；
所述发酵培养基为：S培养基(液体)：葡萄糖1.00g、酵母膏0.40g、蛋白胨0.40g、K2HPO40.40g、KH2PO4 0.20g、MgSO4·7H2O 0.05g、水100ml。
10.利用权利要求8所述发酵液生产螺旋霉素抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将发酵液加1.0％～1.5％的硫酸铝并调节pH值4.5～5.0，搅拌，静止，使蛋白质充分沉淀；
步骤二、将步骤一处理后的发酵液过滤，收集滤液；
步骤三、醋酸丁酯提取；
调节滤液pH值为8.5～9.0，将醋酸丁酯与滤液混合后静置分层，收集有机相层；
步骤四、水洗、水提、脱丁酯；
水洗：用无盐水洗涤步骤三收集的有机相，静置分层，收集醋酸丁酯有机相，直至放水至乳化层为白色时为止；
水提：用1moL/L氯化氢和0.05mmoL/L磷酸二氢钠缓冲液调无盐水的pH值为2.0～2.5，将该无盐水与醋酸丁酯有机相混合搅拌，静置分层，收集水提液层；
脱丁酯：用1moL/L氢氧化钠回调水提液pH值为5.0～5.5，用0.02MPa干净空气和真空彻底去除醋酸丁酯，至无丁酯味为止；
步骤五、结晶，干燥包装。
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