CN105018410B - 一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，包括如下步骤：(1)在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在相对湿度为80‑95%、空气流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先于25‑30℃下培养24‑48h，再于10‑20℃下培养12‑24 h，培养基平板上长出孢子或菌丝；(2)将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(1)所述环境参数和时间下培养；(3)重复步骤(2)所述操作，培养1‑5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子。本发明所述的方法产孢量多、产孢速度快，有效解决了三孢布拉霉菌（尤其是负菌）培养过程中不产或少产孢子的问题。
Description
技术领域
本发明属于农用微生物技术领域，涉及一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法及所得孢子在三孢布拉氏霉菌株分离和选育上的应用。
背景技术
番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有良好的抗氧化、抗肿瘤功效，且对肿瘤的预防、心血管的保护、维持免疫细胞的完整性有一定作用，因此备受众多研究者关注。番茄红素的主要获取方式有提取法、化学合成法和生物合成法。其中生物合成法是一种最有前景的获取番茄红素的方式，三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素具有发酵单位效价高、环境友好、绿色天然、生产不受季节影响等优点，因而被广泛用于工业化发酵生产番茄素。但三孢布拉霉菌存在老化速度快、优良生产性状易丢失、保存菌株性状难恢复等缺点给工业化生产带来困难，发酵生产中需要不断地对菌株持续进行优化选育。
三孢布拉霉菌菌丝为一种多核无横隔菌丝，其存在的等位基因可掩盖基因的正突变，故以单核孢子悬液为载体的选育方式成为最佳选择。三孢布拉霉菌（尤其是负菌）老化速度较快，菌丝老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，细胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌种接入培养料后表现为菌丝生长慢、抵抗杂菌能力弱、产孢能力降低，给菌种的分离纯化和优化选育带来困难，因此迫切需要掌握三孢布拉霉菌老化菌株的大量产孢技术。
华中科技大学张阳（三孢布拉霉大量产孢条件及发酵动力学研究,2013,8-21.）在250 ml 的锥形瓶中分装 60 ml 的 PDA 培养基，以孢子悬液的方式接种，每个锥形瓶的接种量为 1 ml，接种后置于 28℃恒温摇床静置培养 20-24 h，然后置于 20℃恒温摇床静置培养 6 d，整个培养过程历时 7d，培养时间过长，不适于工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种诱导三孢布拉霉正、负菌的老化菌株快速大量产生孢子的方法，为三孢布拉霉菌菌种的优化选育提供简便而必备的前提条件。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所采用菌种，三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazust 1+)、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trisporazust 1-) （浙江汇能动物药品有限公司微生物发酵实验室保藏），该菌种具有代表性。
具体操作方法为：
(1) 在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在相对湿度为80-95%、空气流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先于25-30℃下培养24-48h，再于10-20℃下培养12-24 h，培养基平板上长出孢子或菌丝；三孢布拉霉菌的接种方式有菌饼、菌丝体、孢子液三种方式，采用菌饼的接种方式，产孢量较低，菌丝体的接种方式产孢量高且操作简便。水分是控制三孢布拉霉孢囊孢子萌发的关键因素，湿度越大越有利于孢囊孢子的萌发；当湿度超过95%时，染菌几率增高，同时因细胞渗透压的影响，孢子反而不易形成。由于生物的应激效应，高温转低温的培养方法更有利于孢子的产生。三孢布拉氏霉菌是好氧微生物，氧气供应充足可以提高细胞的生长。然而，三孢布拉霉交织生长的菌丝使氧气在培养基中的含量降低，因此培养过程中要保持一定的空气流量，同时采用培养皿作为三孢布拉霉菌的培养器皿，相比三角瓶，可以增加三孢布拉霉菌与氧气的接触面积，增大其产孢量。
(2) 将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(1)所述环境参数下培养；
(3) 重复步骤(2)所述操作，培养1-5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子，即可得到大量孢子，菌丝的培养代次数量与菌株老化程度有关。
步骤(1)中所述半固体培养基配方为：麦芽浸膏 5-40 g/L，酵母蛋白胨 5-20 g/L，小分子羧酸盐1-20 g/L，CuSO4·5H2O 1-10 mg/L，FeCl3·6H2O 10-500 mg/L， Co(NO3)2·6H2O 1-10mg/L，琼脂粉15-20g/L，所述培养基的pH为5.5-7.5。蛋白胨富含有机氮化合物，能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。小分子羧酸盐可以为三孢布拉霉菌提供氮源，用于形成孢子的结构蛋白和mRNA 分钟以及孢子形成所需的一些相关酶，其适当的用量可以诱导三孢布拉霉子囊孢子产生，但是过量的小分子羧酸盐和蛋白胨反而会抑制三孢布拉霉子囊孢子的产生。CuSO4·5H2O可以作为一些酶类的激活剂，在其适当浓度时可能对三孢布拉霉菌株产孢过程的相关酶有激活作用，从而促进菌株产孢，但当CuSO4·5H2O用量较大时，反而会导致菌株产孢量降低。FeCl3·6H2O和Co(NO3)2·6H2O均为三孢布拉霉孢子的形成提供了微量元素，其用量适当时对孢布拉霉菌株产孢有明显促进作用，当超过最佳用量时，菌株产孢量反而会下降。三孢布拉霉菌株的产孢需要适宜的PH条件，偏酸或者偏碱性的培养基均会导致产孢量降低，对菌株的代谢活动产生影响。
作为优选，步骤(1)所述相对湿度为85%，培养时间为：先于27℃下培养44 h，再于15℃培养16 h。
作为优选，所述半固体培养基配方为：麦芽浸膏 20 g/L，酵母蛋白胨 10g/L， 小分子羧酸盐3 g/L，CuSO4·5H2O 7 mg/L， FeCl3·6H2O 250 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 4 mg/L，琼脂粉18g/L，所述培养基的pH为7。
作为优选，步骤(1)中所述平板培养基厚度为1.5-1.9mm。
作为优选，所述小分子羧酸盐为丙酸盐、乙酸盐或乳酸盐中的一种。
本发明还涉及老化菌株所产孢子在菌株分离纯化及菌种选育方面的应用，具体操作方法为：在无菌条件下，将所得孢子和菌丝混合物用无菌生理盐水冲洗并收集，再采用4层擦镜纸过滤，将滤液收集于三角瓶中，稀释得孢子悬液，将浓度为105-106个/mL的孢子悬液用于诱变处理，将浓度为106-108个/mL的孢子悬液平板涂布，用于菌种的分离纯化。
本发明的有益效果为：
1、本发明所采用的培养基配方简单、原料廉价易得，对菌株培养环境要求简单、常规，易于操作控制，适于工业化生产。
2、产孢量多、产孢速度快，有效解决了三孢布拉霉菌（尤其是负菌）培养过程中不产或少产孢子的问题。
3、所生产孢子可用于三孢布拉霉菌菌株的分离纯化和菌种优化选育，对接种方式优化、单位效价提高、防止菌株过快老化等具有重要意义。
说明书附图
图1为产孢前的负菌孢子；
图2为产孢后的负菌孢子；
图3为产孢前的正菌孢子；
图4为产孢后的正菌孢子。
具体实施例
下面结合具体实验实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明不受实施例限制。
实施例1：三孢布拉霉菌老化菌株产生大量孢子
(1) 按如下配方配制半固体培养基：麦芽浸膏20g/L，酵母蛋白胨10g/L，丙酸盐3g/L，CuSO4 . 5H2O 7 mg/L，FeCl3 . 6H2O 250 mg/L，Co(NO3)2 . 6H2O 4 mg/L，琼脂粉 18g/L，pH7，平板厚度1.5mm。
(2)无菌操作下将老化菌株的少量菌丝接种于半固体培养基平板，在相对湿度为85%、 空气单位体积流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先在27℃培养44 h，后在15℃培养16h后，将生长出的少量孢子收集划线于新的无菌平板，并于相同的培养环境和条件下继续培养，重复操作培养5代，即可得到大量三孢布拉霉孢子。附图1为产孢前的负菌孢子数量为3~7×108个/平皿；附图2为产孢后的负菌孢子数量为3~7×1010个/平皿；附图3为产孢前的正菌孢子数量为3~7×109个/平皿；附图4为产孢后的正菌孢子数量为3~7×1012个/平皿。
实施例2：三孢布拉霉菌老化菌株产生大量孢子
(1) 按如下配方配制半固体培养基：麦芽浸膏5g/L，酵母蛋白胨5g/L，乙酸盐20g/L，CuSO4 . 5H2O 1 mg/L，FeCl3 . 6H2O 10 mg/L，Co(NO3)2 . 6H2O 1 mg/L，琼脂粉 15g/L，pH5.5，平板厚度1.7mm。
(2)无菌操作下将老化菌株的少量菌丝接种于半固体培养基平板，在相对湿度为80%、 空气单位体积流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先在25℃培养24 h，后在10℃培养12h后，将生长出的少量孢子收集划线于新的无菌平板，并于相同的培养环境和条件下继续培养，重复操作培养5代，即可得到大量三孢布拉霉孢子。经检测产孢前的负菌孢子数量为2~8×108个/平皿，产孢后的负菌孢子数量为2~8×1010个/平皿；产孢前的正菌孢子数量为2~8×109个/平皿，产孢后的正菌孢子数量为2~8×1012个/平皿。
实施例3：三孢布拉霉菌老化菌株产生大量孢子
(1) 按如下配方配制半固体培养基：麦芽浸膏40g/L，酵母蛋白胨20g/L，乳酸盐1g/L，CuSO4 . 5H2O 10 mg/L，FeCl3 . 6H2O 500 mg/L，Co(NO3)2 . 6H2O 10 mg/L，琼脂粉20g/L，pH7.5，平板厚度1.9mm。
(2)无菌操作下将老化菌株的少量菌丝接种于半固体培养基平板，在相对湿度为95%、 空气单位体积流量为0.5 L/min的黑暗环境中，先在30℃培养48 h，后在20℃培养24h后，将生长出的少量孢子收集划线于新的无菌平板，并于相同的培养环境和条件下继续培养，重复操作培养5代，即可得到大量三孢布拉霉孢子。经检测产孢前的负菌孢子数量为4~8×108个/平皿，产孢后的负菌孢子数量为4~8×1010个/平皿；产孢前的正菌孢子数量为4~8×109个/平皿，产孢后的正菌孢子数量为4~8×1012个/平皿。
实施例4： 三孢布拉霉老化菌株所产生的大量孢子在菌种分离纯化和选育上的应用
无菌条件下用无菌生理盐水将实施例1所得的三孢布拉霉菌老化菌株孢子和菌丝混合物冲洗并收集，再采用4层擦镜纸过滤，滤液收集于18×18mm试管中，稀释后可得适宜浓度的孢子悬液。将105~106个/mL浓度的孢子悬液可直接用于诱变处理。将106~108个/mL浓度的孢子悬液可直接用于平板涂布，用于菌种的分离纯化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质和原理下所作的改变、替代、组合、简化均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，所述诱导方法包括如下步骤：
(1)在培养皿中装入半固体培养基，将三孢布拉霉菌老化菌株的菌丝接种于半固体培养基中，在培养环境为:相对湿度为80-95％、空气流量为0.5L/min的黑暗环境；培养条件为：先于25-30℃下培养24-48h，再于10-20℃下培养12-24h，培养基平板上长出孢子或菌丝；
(2)将所得孢子或菌丝收集划线于另一新半固体培养基平板上，在步骤(1)所述培养环境和培养条件下培养；
(3)重复步骤(2)所述操作，培养1-5代菌丝，挑取或收集孢子，即可得到大量孢子；
步骤(1)中所述半固体培养基配方为：麦芽浸膏5-40g/L，酵母蛋白胨5-20g/L，小分子羧酸盐1-20g/L，CuSO4·5H2O 1-10mg/L，FeCl3·6H2O 10-500mg/L，Co(NO3)2·6H2O 1-10mg/L，琼脂粉15-20g/L，所述培养基的pH为5.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基平板厚度为1.5-1.9mm。
3.根据权利要求1所述的诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，步骤(1)所述相对湿度为85％，培养条件为：先于27℃下培养44h，再于15℃培养16h。
4.根据权利要求1所述的诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，步骤(1)所述半固体培养基配方为：麦芽浸膏20g/L，酵母蛋白胨10g/L，小分子羧酸盐3g/L，CuSO4·5H2O 7mg/L，FeCl3·6H2O 250mg/L，Co(NO3)2·6H2O 4mg/L，琼脂粉18g/L，所述培养基的pH为7。
5.根据权利要求1或4所述的诱导三孢布拉氏霉老化菌株快速大量产孢的方法，其特征在于，所述小分子羧酸盐为丙酸盐、乙酸盐或乳酸盐中的一种。
6.如权利要求1所述方法在三孢布拉氏霉菌株分离纯化及菌种选育上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是在无菌条件下，将所得孢子和菌丝混合物用无菌生理盐水冲洗并收集，再采用4层擦镜纸过滤，将滤液收集于试管中，稀释得孢子悬液，将浓度为105-106个/mL的孢子悬液用于诱变处理，将浓度为106-108个/mL的孢子悬液平板涂布，用于菌种的分离纯化。
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