CN101586091B

CN101586091B - 醋酸杆菌及应用其生产对映体纯(r)-有机硅醇的方法

Info

Publication number: CN101586091B
Application number: CN2009101462613A
Authority: CN
Inventors: 宗敏华; 肖仔君; 娄文勇
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: CN101586091A

Abstract

本发明公开醋酸杆菌及应用其生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法，该醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003保藏号为CCTCC M209061。应用醋酸杆菌生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法是在三乙醇胺的盐酸缓冲液中加入有机硅酮、异丙醇和固定化醋酸杆菌(Acetobacter sp.)颗粒成混合物，调节pH值至4.0-6.0，在温度为25-35℃，转速为160-200r/min条件下，振荡反应0.5-8.0h，制得对映体纯(R)-有机硅醇，本发明利用遵循反Prelog规则的醋酸杆菌催化合成(R)-有机硅醇，省去添加昂贵的还原型辅酶，降低了其生产成本，具有绝对的立体选择性和较高的产率。

Description

醋酸杆菌及应用其生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法

技术领域

本发明属于生物催化手性化合物不对称合成的技术领域，特别涉及一种醋酸杆菌，还涉及该醋酸杆菌的应用，即催化有机硅酮不对称还原制备(R)-有机硅醇。

背景技术

有机硅化合物是指含有C-Si键的有机化合物。目前，在自然界中尚未发现这类物质的存在。有机硅化合物不但在不对称合成及功能材料中具有重要作用，德国化学家Tacke等就发现许多有机硅化合物具有特定的生物活性。如含硅药物Zifrosilone、Cisobitan和Silabolin比其碳结构类似物具有更高的药理活性、更好的选择性及更小的毒性。合成现有药物的含硅结构类似物(“硅替代”)是药物设计、改造的有效途径。对映体纯手性醇及其衍生物，是许多具有巨大商业价值的重要医药和农药产品的中间体。合成对映体纯手性醇的含硅结构类似物，并以含硅手性醇及其衍生物作手性砌块，可合成大量现有药物的含硅结构类似物，为利用硅替代设计、改造药物及开发新药奠定物质基础。如对映体纯的(S)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇是一种重要的药物手性中间体，可用于合成5′-脂氧化酶抑制剂，来治疗风湿性关节炎，哮喘等疾病；对映体纯的(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇是许多重要的药物手性中间体，如可用于合成喜巴辛(himbacine)结构类似物，来治疗老年痴呆症；也可用来合成一些抗生素。

目前，生产手性硅醇的主要方法有化学法和生物法两种。过去30年里，化学法催化羰基的立体选择性还原的研究取得了重大进展。化学法催化的不对称还原主要分为手性试剂控制的不对称还原和手性催化剂控制的不对称还原。常用的手性试剂有：手性配体修饰的氢化铝锂和手性硼烷试剂。常用的手性催化剂有：硼氢化钠、手性硅烷、手性过渡金属络合物以及Meerwein-Porndorf-Verley还原试剂等。但是化学法存在很多缺陷，如手性催化剂制备复杂，成本高，有时反应的立体选择性与催化剂的量成正比，甚至需要催化剂与反应底物以化学计量的比率进行，反应条件苛刻，许多催化剂有剧毒，造成环境污染。而采用生物法进行潜手性酮的不对称还原反应，一般来说反应活性高，易于控制，比较安全，而且立体选择性高，底物范围广，反应条件温和，同时对环境友好，符合原子经济、绿色化学的发展方向，因此颇受青睐。生物法催化不对称还原制备手性硅醇主要有外消旋醇的动力学拆分法和前体硅酮的不对称还原法。通常，如果不辅以原位外消旋化，外消旋体拆分法的最高产率仅为50％，而潜手性硅酮不对称还原法的最高产率则可高达100％。因此，目前国内外的研究报道大多采用这一方法。

自然界中微生物的种类异常之多，估计不少于10万种，是一个极其丰富的宝库。遵循反Prelog规则催化潜手性酮不对称还原的微生物细胞比较少，已报道的有乳杆菌属的Lactobacillus kefir、Lactobacillus brevis、粉状毕赤氏酵母Yamadazyma farinosa IFO 10896、白地霉Geotrichum sp.38、爪哇毛霉Mucor javanicus、假单胞属Pseudomonas sp.、土曲霉Aspergillus terreus CCT 3320、构巢曲霉Emericella nidulans CCT 3119、酒类酒球菌Oenococcusoeni、木兰假丝酵母Candida magnoliae、近平滑假丝酵母Candida parapsilosis CCTCC M203011等。许多重要的手性醇，如用于合成(R)-苯基-4-羟基-戊酸盐(治疗Alzheimer’s病)的中间体(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇，用遵循Prelog规则的微生物细胞催化其对应的潜手性酮不对称还原只能合成其对映异构体，唯有遵循反Prelog规则的微生物细胞才能用于这些手性化合物的不对称合成。因之，研究遵循反Prelog规则的微生物细胞催化手性酮不对称还原反应具有重要的实践意义。

目前，关于利用生物催化剂不对称还原4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮来合成对映体纯的(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的文章，Bradshaw等在水相体系中用Lactobacillus kefir醇脱氢酶作为催化剂，得到的(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇e.e.值为94％，而产物的产率只有25％{Bradshaw C.W.Hummel W.Wong C.H.Journal of Organic Chemistry，1992，57(5)：1532-1536}。其主要原因是催化剂的活性不高，且受底物、产物抑制等。迄今，国内外尚未见微生物细胞遵循反Prelog规则催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原合成(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的研究报道。与潜在遵循反Prelog规则微生物相比，新分离得到的醋酸杆菌能遵循反Prelog规则，高效、高立体选择性催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮生成(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术存在的不足，提供一种能高效、高立体选择性催化潜手性酮新的醋酸杆菌菌株。

本发明的另一目的在于提供该醋酸杆菌细胞催化有机硅酮不对称还原制备(R)-型有机硅醇的方法，其产率大于50％。

本发明实现上述目的技术方案是：

醋酸杆菌菌株XZY003(Acetobacter sp.XZY003)首次从“中华开菲尔粒”分离出来(中华开菲尔粒即为西藏“雪莲”发酵乳粒，源自西藏雪原特有珍稀菌种，在西藏生长的有生命的菌类)，已于2009年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCCM，保藏号为M209061，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学(邮编为430072)。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003在西红柿液体培养基中30℃培养24h观察，细胞为短小杆状，革兰氏染色阴性，不运动。在西红柿固体培养基中30℃培养48h后，菌落为乳白色，光滑，边缘整齐。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003可用普通的细菌培养基培养，如酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH 5.0，无水酒精至20mL/L，需氧，培养温度为30℃；可采用斜面、液体石蜡、冻干管法保藏。保藏用的培养基为西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003特性说明如下：

1、分子生物学鉴定：

提取50μg醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的DNA(提取方法见[美]J萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》27页)，根据Kurtzman & Robnett的方法，用引物FD1(SEQ.ID.NO2)(5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′)和FD2(SEQ.ID.NO3)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)PCR扩增醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的16SrRNA按下述反应条件进行35个循环：94℃，5min；56℃，20s；68℃，40s。所得PCR产物送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的DNA序列为SEQ.ID.NO1所示。

选取酸球状属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、Kozakia属、Asais属、葡糖醋杆菌属、酸单胞属中与XZY003 Blast结果显示同源性较高的菌株和部分代表种，以Rhodopila globiformis为外类群，对选取的35个菌种作进化树。从图1的聚类结果可以看出，所选取的这几个属的菌株主要分为5类。醋杆菌属的Acetobacter ghanaensis(EF030713)在与XZY003(FJ869877)比对的1396bp中，匹配率100％，rDNA差异碱基数为0；在进化树中，Acetobacter ghanaensis与XZY003显示出较高的同源性(99.95％)，而与最近的Acetobacter syzygii(AB052712)、Acetobacter lovaniensis LMG 1617(AJ419837)比对的1396bp中，其同源性分别为99.7％和99.6％。根据Kurtzman & Robnett的理论“属于同一种的菌株，其16S rRNA区碱基差异不超过1％，并预测若此差异超过1％则可以认为是属于不同种，而如果只有0-3个碱基替代，就可以认为是属于同一种或是相似种(Kurtzman & Robnett，1998)”，可以认为XZY003属于Acetobacter ghanaensis，或是其亚种。

2、生理生化鉴定：

(1)产醋酸定性实验

将新鲜菌种接种于醋酸杆菌增殖培养基中，30℃摇床培养2天后，取培养液5mL于试管内，氢氧化钠溶液中和至pH 7.0，加100g/L氯化铁溶液2～3滴混匀，观察液体颜色是否变为黄红色，在火焰上煮沸，观察有无红褐色沉淀生成，清液是否变无色。增殖培养基：酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5，121℃灭菌20min后加入30mL/L无水酒精。

(2)乙醇氧化实验

用新鲜菌种接种乙醇氧化培养基，培养2～3天后观察，若培养基产酸变黄者为阳性反应。乙醇氧化培养基配方为：酵母浸膏10g/L，20mL/L浓度为0.4g/L溴酚蓝水溶液，pH 6.8～7.0，121℃灭菌20min后加入40mL/L无水酒精。

(3)乙酸氧化实验

用新鲜菌种接种乙酸氧化培养基平板，培养2～3天后，观察菌落四周是否出现乳白色晕圈，有乳白色晕圈则为阳性反应。乙酸氧化培养基：酵母浸膏10g/L，乙酸钙10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

(4)生酮实验

用新鲜菌种接种生酮实验平板，培养2～3天之后，用菲林溶液注满平板，菌落周围出现明显的红色沉淀则为阳性。生酮实验培养基：酵母浸膏10g/L，甘油30mL/L，琼脂20g/L，121℃灭菌20min后加入无水酒精至40mL/L。

(5)乳酸利用实验

用新鲜菌种接种乳酸氧化培养基平板，培养2～3天后，观察菌落四周是否出现乳白色晕圈，有乳白色晕圈则为阳性反应。乳酸氧化培养基：酵母浸膏10g/L，乳酸钙10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

(6)过氧化氢酶测定

取一环生长于PYG琼脂斜面的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加5滴100mL/L的H₂O₂，若有气泡产生则为阳性反应。PY基础培养基：蛋白胨5g/L，胰酶解酪朊5g/L，酵母浸膏10g/L，盐溶液40mL/L。

PY盐溶液成分：无水氯化钙0.2g/L，七水硫酸镁0.48g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，碳酸氢钠10.0g/L，氯化钠2.0g/L。

PY盐溶液制法：将氯化钙和七水硫酸镁混合溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌至全部溶解后加200mL蒸馏水，混合后贮备于4℃备用。PY基础培养液内加入10g/L葡萄糖即为PYG培养基。

(7)石蕊牛奶实验

用新鲜菌种接种石蕊牛奶培养基，于37℃培养1，3，7天后观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。石蕊牛奶培养基：在100mL浓度为100g/L脱脂牛奶中加入4mL浓度为25g/L的石蕊，分装试管，牛奶高度4-5cm。

(8)明胶液化实验

用新鲜菌种接种明胶液化实验培养基，置于37℃培养，用两只未接种的试管培养基做对照。培养2～3天后，将已接种和对照管分别置于冰箱中，若对照管凝固，接种管液化记录为阳性，同时液化或凝固则为阴性结果。

明胶基础培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖1g/L，盐溶液40mL/L(与PY基础培养基同)，明胶120g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

(9)产硫化氢实验

乙酸铅试剂条的制备：将普通滤纸条剪成约0.5～0.6cm宽的纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘箱烘干，放入培养皿或试管内，灭菌后备用。

将新鲜菌种接种产硫化氢实验培养基试管后，用无菌镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。一支不接种的试管设为空白对照，也要悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养，纸条变黑则为阳性反应。

产硫化氢实验培养基(半胱氨酸培养基)：胰蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，半胱氨酸0.4g/L，葡萄糖2g/L，分装试管，每管培养液高度4-5cm，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min。

(10)产吲哚实验

将新鲜菌种接种产吲哚实验培养基，置于37℃培养。培养2-3天后，取培养液加入试管，沿管壁加入3-5mm高的试剂于培养液表面，若液层界面出现红色则为阳性反应。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛0.08g，无水乙醇7.6mL，浓HCl 1.6mL

产吲哚实验培养基：10g/L胰胨水溶液，调pH 7.2～7.5，分装试管，121℃灭菌20min。

菌种的生理生化特性如表1所示，能产醋酸和硫化氢，接触酶阳性，生酮实验阳性，能氧化乙醇，不能进行明胶液化和利用乳酸，乙酸氧化和牛奶石蕊实验阴性，不产吲哚。根据形态特征和生理生化特征，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》可鉴定菌种为醋杆菌属，结合分子生物学鉴定结果，确定醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003为Acetobacter ghanaensis，但是已知的Acetobacter ghanaensis不能利用葡萄糖生酮，因此，确定本发明XZY003菌种为Acetobacterghanaensis的亚种或变种。

表1醋酸杆菌XZY003生理生化鉴定实验结果

“+”：表示阳性，“-”：表示阴性。

醋酸杆菌(Acetobacter ghanaeni)XZY003能催化有机硅酮不对称还原为(R)-有机硅醇，其对映体过量值(e.e.)为99％以上，产率为50～95％。

应用所述醋酸杆菌催化还原生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法：在三乙醇胺的盐酸缓冲液中加入有机硅酮、异丙醇和固定化醋酸杆菌(Acetobacter sp.)颗粒成混合物，调节pH值至4.0-6.0，在温度为25-35℃，转速为160-200r/min条件下，振荡反应0.5～8h，进行微生物细胞催化的转化，制得对映体纯(R)-有机硅醇；所述的三乙醇胺、盐酸、有机硅酮和异丙醇在混合物中的浓度分别为0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3.0～20mmol/L和43.6～200mmol/L；所述固定化醋酸杆菌(Acetobacter sp.)颗粒与混合物的重量体积比为0.1～1.0g/m L。

所述对映体纯(R)-有机硅醇为(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇或(R)-三甲基硅乙醇。

所述固定化醋酸杆菌细胞、异丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中浓度分别优选为0.50g/mL、130.6mmol/L和10mmol/L。

所述pH优选为5.0，温度优选为30℃，转速优选为180r/min。

相对于现有技术本发明具有如下有点和有益效果：

目前，国内外有关利用生物催化剂催化有机硅酮不对称还原合成对映体纯手性有机硅醇，产率或产物的对映体选择性低下。本发明利用遵循反Prelog规则的醋酸杆菌催化合成(R)-有机硅醇，与游离酶作为生物催化剂相比，省去了添加昂贵的还原型辅酶如NAD(P)H，降低了其生产成本；与其他细胞作为催化剂相比，其具有绝对的立体选择性和较高的产率，同时不仅有利于产物的分离，还可回收细胞重复使用，大大简化生产工序，降低了生产成本。

附图说明

图1是以Rhodopila globiformis为外类群，XZY003对选取的35个菌种作的进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述，本发明的实施例不限如此。

实施例1

将2g中华开菲尔粒接入装有100mL西红柿培养基的250mL三角瓶中，28℃培养24h，以同样的条件在西红柿培养基中连续转接培养3次。菌液用十倍稀释法进行适当稀释后涂布于固体分离培养基上，28℃培养28h(可以是24～36h)，获得单菌落，纯化后西红柿培养基的斜面进行保藏，供鉴定用；2009年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCCM，保藏号为M209061，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学(邮编为430072)。西红柿培养基的配方具体为：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH 6.0。

将鉴定为醋酸杆菌的菌株XZY003从斜面转接入西红柿培养基中，30℃，160r/min培养24h，离心(3500r/min，15min，4℃)，洗涤两次，得到湿菌体。然后将湿菌体分散在等重的蒸馏水中，再加入4倍湿菌体重量浓度为20g/L海藻酸钠，搅拌均匀，用5^#针头的注射器将上述悬浮液滴入200mL浓度为20g/L的CaCl₂溶液中，4℃硬化4h，用蒸馏水将硬化后的海藻酸钙凝胶球(直径2-3mm)洗涤3次，再移入200mL含有CaCl₂的葡萄糖溶液中，其终浓度为0.5g/L CaCl₂、200g/L葡萄糖，放置于4℃冰箱中保存待用，得到的固定化醋酸杆菌颗粒，其直径大小为2-3mm，球形，机械强度较好，其细胞含量10^7-8个/g，活性稳定。西红柿培养基的配方具体为：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH 6.0。

实施例2

将鉴定为醋酸杆菌的菌株XZY003从斜面转接入西红柿培养基中，30℃，160r/min培养24h，离心(8000r/min，10min，4℃)，洗涤两次，得到湿菌体。然后将湿菌体分散在等重的蒸馏水中，再加入6倍湿菌体重量浓度为10g/L海藻酸钠，搅拌均匀，用5^#针头的注射器将上述悬浮液滴入200mL浓度为20g/L的CaCl₂溶液中，4℃硬化4h，用蒸馏水将硬化后的海藻酸钙凝胶球(直径2-3mm)洗涤3次，再移入200mL含有CaCl₂的葡萄糖溶液中，其终浓度为0.5g/L CaCl₂、200g/L葡萄糖，放置于4℃冰箱中保存待用，得到的固定化醋酸杆菌颗粒，其直径大小为2-3mm，球形，机械强度较好，机械强度一般，其细胞含量10^7-8个/g，活性稳定。西红柿培养基的配方具体为西红柿汁200mL/L、葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，pH6.0。

实施例3

将2mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.05mol/L，pH5.0)装入具塞的10mL的三角瓶中，然后分别加入上述实施例1制备的固定化醋酸杆菌颗粒、异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物；异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的浓度分别为43.6mmol/L和3.0mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.2g/mL，于30℃，180r/min，条件下反应1h，得到(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇对映体，气相检测{仪器：日本岛津GC-2010型气相色谱仪，配备工作站，FID检测器；手性柱：HP-Chiral-5(20％Permethylated β-cyclodextrin)，柱长30m，柱径0.25mm(美国安捷伦公司)。GC分析条件：汽化室温度和检测室温度均为250℃；色谱柱初始温度为85℃，维持13min；载气为氮气，流速为1.2mL/min，分流比100∶1；进样量1μL。在该分析条件下，4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮、内标正癸烷、4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的保留时间分别为5.2，5.7和10.5min。4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇用醋酸酐酯化后其S型和R型酯化产物的保留时间分别为11.7和12.0min。最大相对误差小于1.0％。}，得到(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇对映体纯度为99％以上对映体过量值e.e.，产率为52.3％。

实施例4

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH4.5)装入具塞的10mL三角瓶中，然后分别加入上述实施例1制备的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的浓度分别为43.6mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.3g/mL，于25℃，160r/min，反应2h，气相检测(检测条件同实施例3)其产率为59.7％，(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇对映体纯度为99％以上对映体过量值e.e.。

实施例5

将6mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 5.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入上述实施例1的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的浓度分别为130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.1g/mL，于30℃，180r/min，反应1h气相检测(检测条件同实施例3)其产率为71.3％，(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇对映体纯度为99％以上e.e.。

实施例6

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.2mol/L，pH 6.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入上述实施例1制备的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和三甲基硅乙酮形成混合物，异丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中浓度分别为200.0mmol/L和10mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为1.0g/mL，于30℃，200r/min，反应2h，气相检测(仪器条件同实施例3，GC分析条件：汽化室温度和检测室温度均为250℃；色谱柱初始温度为64℃，维持1min后，以1℃/min的速率升至71℃，维持1min；载气为氮气，流速为2.5mL/min，分流比100∶1；进样量1μL。在该分析条件下，三甲基硅乙酮、内标正壬烷、(R)-1-三甲基硅乙醇和(S)-1-三甲基硅乙醇的保留时间分别为3.50min、6.02min、6.72min和7.28min。)其产率为95％，(R)-三甲基硅基-2-醇对映体纯度为99％以上e.e.。

实施例7

将6mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 5.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例2制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中浓度分别为130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.4g/mL，于30℃，180r/min，反应1h，过滤分离出固定化醋酸杆菌细胞，用蒸馏水洗涤两次，再次放入新鲜的反应液中进行下一次反应，依次方法进行8批次试验，气相检测(检测条件同实施例3)其相对活性为70％。

实施例8

将2mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 6.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，异丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中浓度分别为163.5mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.1g/mL，于35℃，180r/min，反应2h，气相检测(检测条件同实施例6)其产率为65.2％，(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇对映体纯度为99％以上e.e.。

实施例9

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 6.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入上述实施例2制备的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和三甲基硅乙酮，异丙醇和三甲基硅乙酮在混合物中浓度分别为163.5mmol/L和20mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.3g/mL，于25℃，160r/min，反应2h，气相检测(检测条件同实施例6)其产率为96％，(R)-三甲基硅基-2-醇对映体纯度为99％以上e.e.。

实施例10

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.05mol/L，pH 5.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的固定化醋酸杆菌颗粒以及异丙醇和三甲基硅乙酮形成混合物，异丙醇和三甲基硅乙酮在混合物中浓度分别为200mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸杆菌颗粒与混合物的重量体积比为0.3g/mL，于30℃，180r/min，反应8h，气相检测(检测条件同实施例6)其产率为65％，(R)-三甲基硅基-2-醇对映体纯度为99％以上e.e.。

序列列表

SEQ.ID.NO1：

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>醋酸杆菌及应用其生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1396

<212>DNA

<213>醋酸杆菌(Acetobacter sp.)

<400>1

caagtcgcac gaacctttcg gggttagtgg cggacgggtg agtaacgcgt aggaatctgt 60

ccatgggtgg gggataactc tgggaaactg gagctaatac cgcatgatac ctgagggtca 120

aaggcgcaag tcgcctgtgg aggagcctgc gttcgattag ctagttggtg gggtaaaggc 180

ctaccaaggc gatgatcgat agctggtttg agaggatgat cagccacact gggactgaga 240

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gggcaaccct 300

gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttcgacgggg 360

acgatgatga cggtacccgt agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta 420

atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatg actgggcgta aagggcgtgt aggcggtttg 480

tacagtcaga tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggagct gcatttgata cgtgcagact 540

agagtgtgag agagggttgt ggaattccca gtgtagaggt gaaattcgta gatattggga 600

agaacaccgg tggcgaaggc ggcaacctgg ctcattactg acgctgaggc gcgaaagcgt 660

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt gtgctagatg 720

ttgggtaact ttgttattca gtgtcgcagt taacgcgtta agcacaccgc ctggggagta 780

cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 840

ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagggctt gaatgtagag gctgtattca 900

gagatggata tttcccgcaa gggacctcta acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatctt tagttgccag 1020

cacgtttggg tgggcactct agagagactg ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg 1080

acgtcaagtc ctcatggccc ttatgtcctg ggctacacac gtgctacaat ggcggtgaca 1140

gtgggaagct agatggtgac atcgtgctga tctctaaaag ccgtctcagt tcggattgca 1200

ctctgcaact cgagtgcatg aaggtggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1260

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt ggtttgacct 1320

taagccggtg agcgaacccg caaggggcgc agccgaccac ggtcgggtca gcgactgggg 1380

tgaagtcgta acaagg 1396

SEQ.ID.NO2：

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcac 37

SEQ.ID.NO3：

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agagtttgat cctggctcag 20

Claims

1.一种醋酸杆菌，其特征是：该醋酸杆菌菌株(Acetobacter sp XZY003.)保藏号为CCTCC M209061。

2.应用权利要求1所述醋酸杆菌生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法，其特征在于：在三乙醇胺的盐酸缓冲液中加入有机硅酮、异丙醇和固定化醋酸杆菌(Acetobacter sp.)颗粒成混合物，调节pH值至4.0-6.0，在温度为25-35℃，转速为160-200r/min条件下，振荡反应0.5～8h，进行微生物细胞催化的转化，制得对映体纯(R)-有机硅醇；所述的三乙醇胺、盐酸、有机硅酮和异丙醇在混合物中的浓度分别为0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3.0～20mmol/L和43.6～200mmol/L；所述固定化醋酸杆菌(Acetobacter sp.)颗粒与混合物的重量体积比为0.1～1.0g/mL；所述有机硅酮为4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮或三甲基硅乙酮；所述对映体纯(R)-有机硅醇为(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇或(R)-三甲基硅乙醇。

3.根据权利要求2所述的应用醋酸杆菌生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法，其特征在于：所述固定化醋酸杆菌细胞、异丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中浓度分别为0.50g/mL、130.6mmol/L和10mmol/L。

4.根据权利要求2所述的应用醋酸杆菌生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法，其特征在于：所述pH为5.0，温度为30℃，转速为180r/min。