CN101586128B - 应用醋酸杆菌催化还原生产(r)-4-取代基苯乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，在三乙醇胺的盐酸缓冲液中，加入底物4-取代基苯乙酮、异丙醇和湿菌体的醋酸杆菌的固定化细胞颗粒，形成混合物，调节pH值至4.0～7.0，在温度为25～35℃，转速为160～260r/min条件下，振荡反应2～12h，制得(R)-4-取代基苯乙醇；湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.1-1.0g/ml；所述醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003保藏号为CCTCCM209061。本发明得到对映体纯(R)-4-取代基苯乙醇产物的对映体纯度为99％以上e.e.，其产物的对映体纯和收率均得到提高。

Description

应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物催化手性化合物不对称合成的技术领域，特别涉及醋酸杆菌的应用催化芳香酮不对称还原制备(R)-4-取代基苯乙醇。

背景技术

手性芳香醇是合成药物、农业化学品和天然产物的重要中间体，酮的不对称还原是制备对映体纯手性醇最重要和实用的方法之一。对映体纯1-(4-甲氧基)-苯基乙醇是一种重要的手性中间体，(R)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇可用来合成3-芳基-3-取代的丙酸类抗炎药物，而(S)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇则是合成抗过敏药的重要合成子。由于手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，不同对映体必须区别对待。因此，研究对映体纯1-(4-甲氧基)-苯基乙醇的两种对映体的不对称合成具有重要意义。

用于制备对映体纯手性芳香醇的不对称还原反应的催化剂主要有纯化的氧化还原酶和各种生物细胞。氧化还原酶催化的生物转化过程具有高度的立体专一性，通常可使反应获得很高的立体选择性，但是反应时需要以化学计量的数量添加昂贵的还原型辅酶如NAD(P)H来提供电子，这样使其生产成本过高，而且用离体酶作催化剂存在需要对酶进行分离、纯化，酶在非生理环境中可能变性、失活，辅酶再生困难等问题。如果以微生物细胞作为生物催化剂，就能很好地解决以上问题。微生物细胞不仅能利用自身的代谢过程实现辅酶的原位再生，省去辅酶的添加，同时所有的酶和辅酶被保护在天然的细胞环境中，有利于生物催化反应的进行，而且若将微生物细胞进行固定化，不仅有利于产物的分离，还可回收细胞重复使用，大大简化生产工序，降低了生产成本。因此，微生物细胞已成为不对称还原潜手性酮制备对映体纯手性醇的首选生物催化剂。

目前，国内外有关利用生物催化剂不对称还原对甲氧基苯乙酮来合成对映体纯的(R)-1-(4-甲氧基)-苯基乙醇不对称还原反应，底物浓度为2～3mmol/L，尽管都能获得较高的产物对映体选择性(e.e.＞99％)，但产率均较低(＜40％)。其主要原因可能是催化剂的活性不高，且受底物、产物抑制等问题。但是产率很低，其主要原因可能是水相中存在将产物醇氧化为酮的逆反应以及严重的产物和底物抑制，而且游离微生物细胞容易受底物的毒害，导致细胞活性下降。采用新分离得到的醋酸杆菌能遵循反Prelog规则，高效、高立体选择性催化4-取代基苯乙酮，生成(R)-4-取代基苯乙醇。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术存在的不足，提供利用筛选的醋酸杆菌细胞催化芳香酮(4-取代基苯乙酮)不对称还原制备(R)-4-取代基苯乙醇的方法，绝对立体选择性，其产率大于50％。

本发明利用微生物细胞被固定化之后，由于受到固定化载体的保护与支撑作用，不仅有利于抵抗外界不良因素的影响，大大增加细胞的稳定性，还有利于细胞的循环利用，筛选能高效催化该不对称还原反应的微生物菌种，在水相中采用固定化醋酸杆菌细胞催化对甲氧基苯乙酮的不对称还原反应。

本发明实现上述目的技术方案是：

醋酸杆菌菌株XZY003(Acetobacter sp.XZY003)首次从“中华开菲尔粒”分离出来(中华开菲尔粒即为西藏“雪莲”发酵乳粒，源自西藏雪原特有珍稀菌种，是西藏土生土长的有生命的菌类)，已于2009年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCCM，保藏号为M209061，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学(邮编为430072)。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003在西红柿液体培养基中30℃培养24h观察，细胞为短小杆状，革兰氏染色阴性，不运动。在西红柿固体培养基中30℃培养48h后，菌落为乳白色，光滑，边缘整齐。固体西红柿培养基：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 6.0。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003可用普通的细菌培养基培养，如酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH 5.0，无水酒精至20mL/L，需氧，培养温度为30℃；可采用斜面、液体石蜡、冻干管法保藏。保藏用的培养基为西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 6.0。

醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003特性说明如下：

1、分子生物学鉴定：

提取50μg醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的DNA(提取方法见[美]J萨姆布鲁克《分子克隆实验指南》27页)，根据Kurtzman & Robnett的方法，用引物FD1(SEQ.ID.NO2)(5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′)和FD2(SEQ.ID.NO3)(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)PCR扩增醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的16SrRNA按下述反应条件进行35个循环：94℃，5min；56℃，20s；68℃，40s。所得PCR产物送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的DNA序列为SEQ.ID.NO1所示。

选取酸球状属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、Kozakia属、Asais属、葡糖醋杆菌属、酸单胞属中与XZY003 Blast结果显示同源性较高的菌株和部分代表种，以Rhodopila globiformis为外类群，对选取的35个菌种作进化树。从图1的聚类结果可以看出，所选取的这几个属的菌株主要分为5类。醋杆菌属的Acetobacter ghanaensis(EF030713)在与XZY003(FJ869877)比对的1396bp中，匹配率100％，rDNA差异碱基数为0；在进化树中，Acetobacter ghanaensis与XZY003显示出较高的同源性(99.95％)，而与最近的Acetobacter syzygii(AB052712)、Acetobacter lovaniensis LMG 1617(AJ419837)比对的1396bp中，其同源性分别为99.7％和99.6％。根据Kurtzman & Robnett的理论“属于同一种的菌株，其16S rRNA区碱基差异不超过1％，并预测若此差异超过1％则可以认为是属于不同种，而如果只有0-3个碱基替代，就可以认为是属于同一种或是相似种(Kurtzman & Robnett，1998)”，可以认为XZY003属于Acetobacter ghanaensis，或是其亚种。

2、生理生化鉴定：

(1)产醋酸定性实验

将新鲜菌种接种于醋酸杆菌增殖培养基中，30℃摇床培养2天后，取培养液5mL于试管内，氢氧化钠溶液中和至pH 7.0，加100g/L氯化铁溶液2～3滴混匀，观察液体颜色是否变为黄红色，在火焰上煮沸，观察有无红褐色沉淀生成，清液是否变无色。增殖培养基：酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH 4.5，121℃灭菌20min后加入30mL/L无水酒精。

(2)乙醇氧化实验

用新鲜菌种接种乙醇氧化培养基，培养2～3天后观察，若培养基产酸变黄者为阳性反应。乙醇氧化培养基配方为：酵母浸膏10g/L，20mL/L浓度为0.4g/L溴酚蓝水溶液，pH 6.8～7.0，121℃灭菌20min后加入40mL/L无水酒精。

(3)乙酸氧化实验

用新鲜菌种接种乙酸氧化培养基平板，培养2～3天后，观察菌落四周是否出现乳白色晕圈，有乳白色晕圈则为阳性反应。乙酸氧化培养基：酵母浸膏10g/L，乙酸钙10g/L，琼脂20g/L％，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

(4)生酮实验

用新鲜菌种接种生酮实验平板，培养2～3天之后，用菲林溶液注满平板，菌落周围出现明显的红色沉淀则为阳性。生酮实验培养基：酵母浸膏10g/L，甘油30mL/L，琼脂20g/L，121℃灭菌20min后加入无水酒精至40mL/L。

(5)乳酸利用实验

用新鲜菌种接种乳酸氧化培养基平板，培养2～3天后，观察菌落四周是否出现乳白色晕圈，有乳白色晕圈则为阳性反应。乳酸氧化培养基：酵母浸膏10g/L，乳酸钙10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

(6)过氧化氢酶测定

取一环生长于PYG琼脂斜面的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加5滴100mL/L的H₂O₂，若有气泡产生则为阳性反应。PY基础培养基：蛋白胨5g/L，胰酶解酪朊5g/L，酵母浸膏10g/L，盐溶液40mL/L。

PY盐溶液成分：无水氯化钙0.2g/L，七水硫酸镁0.48g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，碳酸氢钠10.0g/L，氯化钠2.0g/L。

PY盐溶液制法：将氯化钙和七水硫酸镁混合溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌至全部溶解后加200mL蒸馏水，混合后贮备于4℃备用。PY基础培养液内加入10g/L葡萄糖即为PYG培养基。

(7)石蕊牛奶实验

用新鲜菌种接种石蕊牛奶培养基，于37℃培养1，3，7天后观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。石蕊牛奶培养基：在100mL浓度为100g/L脱脂牛奶中加入4mL浓度为25g/L的石蕊，分装试管，牛奶高度4-5cm。

(8)明胶液化实验

用新鲜菌种接种明胶液化实验培养基，置于37℃培养，用两只未接种的试管培养基做对照。培养2～3天后，将已接种和对照管分别置于冰箱中，若对照管凝固，接种管液化记录为阳性，同时液化或凝固则为阴性结果。

明胶基础培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖1g/L，盐溶液40mL/L(与PY基础培养基同)，明胶120g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min。

(9)产硫化氢实验

乙酸铅试剂条的制备：将普通滤纸条剪成约0.5～0.6cm宽的纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘箱烘干，放入培养皿或试管内，灭菌后备用。

将新鲜菌种接种产硫化氢实验培养基试管后，用无菌镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。一支不接种的试管设为空白对照，也要悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养，纸条变黑则为阳性反应。

产硫化氢实验培养基(半胱氨酸培养基)：胰蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，半胱氨酸0.4g/L，葡萄糖2g/L，分装试管，每管培养液高度4-5cm，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min。

(10)产吲哚实验

将新鲜菌种接种产吲哚实验培养基，置于37℃培养。培养2-3天后，取培养液加入试管，沿管壁加入3-5mm高的试剂于培养液表面，若液层界面出现红色则为阳性反应。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛0.08g，无水乙醇7.6mL，浓HCl 1.6mL

产吲哚实验培养基：10g/L胰胨水溶液，调pH 7.2～7.5，分装试管，121℃灭菌20min。

菌种的生理生化特性如表1所示，能产醋酸和硫化氢，接触酶阳性，生酮实验阳性，能氧化乙醇，不能进行明胶液化和利用乳酸，乙酸氧化和牛奶石蕊实验阴性，不产吲哚。根据形态特征和生理生化特征，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》可鉴定菌种为醋杆菌属，结合分子生物学鉴定结果，确定醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003为Acetobacter ghanaensis，但是已知的Acetobacter ghanaensis不能利用葡萄糖生酮，因此，确定本发明XZY003菌种为Acetobacterghanaensis的亚种或变种。

表1醋酸杆菌XZY003生理生化鉴定实验结果

“+”：表示阳性，“-”：表示阴性。

醋酸杆菌(Acetobacter ghanaeni)XZY003能催化芳香酮(4-取代基苯乙酮)不对称还原为(R)-4-取代基苯乙醇，其对映体过量值(e.e.)为99％以上，产率为55～95％。

应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法：在三乙醇胺的盐酸缓冲液中，加入底物4-取代基苯乙酮、异丙醇和湿菌体的醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的固定化细胞颗粒，形成混合物，调节pH值至4.0～7.0，在温度为25～35℃，转速为160～260r/min条件下，振荡反应2～12h，进行微生物细胞催化的转化，制得(R)-4-取代基苯乙醇；所述的三乙醇胺、盐酸、4-取代基苯乙酮和异丙醇在混合物中的浓度分别为0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3-20mmol/L和43.6-200mmol/L；所述湿菌体的醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的固定化细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.1-1.0g/mL；所述醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003保藏号为CCTCC M209061。

所述pH值优选为4.0～5.0；所述固定化醋酸杆菌细胞在混合物中浓度优选为0.3g/mL。

所述异丙醇在混合物中浓度优选为130.6mmol/L～261.2mmol/L。

所述4-取代基苯乙酮在混合物中浓度优选为6mmol/L～10mmol/L。

所述温度优选为25℃～30℃。

所述4-取代基苯乙酮优选为4-溴苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-硝基苯乙酮或4-甲基苯乙酮。

相对于现有技术本发明具有如下有点和有益效果：

现有技术中用微生物细胞不对称还原芳香酮(4-取代基苯乙酮)能获得较高的产物e.e.值，但是产率很低，其主要原因可能是水相中存在将产物芳香醇氧化为芳香酮的逆反应以及严重的产物和底物抑制，而且游离微生物细胞容易受底物的毒害，导致细胞活性下降。本发明利用醋酸杆菌催化合成(R)-4-取代基苯乙醇，与游离酶作为生物催化剂相比，省去了添加昂贵的还原型辅酶如NAD(P)H，降低了其生产成本；与其他细胞作为催化剂相比，其具有绝对的立体选择性和较高的产率，同时不仅有利于产物的分离，还可回收细胞重复使用，大大简化生产工序，降低了生产成本。

附图说明

图1是以Rhodopila globiformis为外类群，XZY003对选取的35个菌种作的进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述，本发明的实施例不限如此。

实施例分析仪器：岛津2010型气相色谱仪，氢火焰离子检测器，安捷伦HP-Chiral手性柱(20％permethylated β-cyclodextrin 30m×0.25mm×0.25μm)。GC分析条件：汽化室温度和检测室温度均为250℃；

实施例1

将2g中华开菲尔粒接入装有100mL西红柿培养基的250mL三角瓶中，28℃培养24h，以同样的条件在西红柿培养基连续转接培养3次。菌液采用十倍稀释法进行适当稀释涂布于固体分离培养基上，28℃培养24～36h，获得单菌落，纯化后斜面保藏，供鉴定用。西红柿培养基：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH 6.0。

将鉴定为醋酸杆菌的菌株XZY003从斜面转接入西红柿培养基中，30℃，160r/min培养24h，离心(3500r/min，15min，4℃)，洗涤两次，得到湿菌体。然后将湿菌体分散在等重的蒸馏水中，再加入4倍湿菌体重量浓度为20g/L海藻酸钠，搅拌均匀，用5^#针头的注射器将上述悬浮液滴入200mL浓度为20g/L的CaCl₂溶液中，4℃硬化4h，用蒸馏水将硬化后的海藻酸钙凝胶球(直径2-3mm)洗涤3次，再移入200mL含有CaCl₂的葡萄糖溶液中，其终浓度为0.5g/L CaCl₂、200g/L葡萄糖，放置于4℃冰箱中保存待用，得到的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒，其直径大小为2-3mm，球形，机械强度较好，其醋酸杆菌细胞含量为10^7-8个/g，活性稳定。西红柿培养基配方：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH 6.0

实施例2

将鉴定为醋酸杆菌的菌株XZY003从斜面转接入西红柿培养基中，30℃，160r/min培养24h，离心(8000r/min，10min，4℃)，洗涤两次，得到湿菌体。然后将湿菌体分散在等重的蒸馏水中，再加入6倍湿菌体重量浓度为10g/L海藻酸钠，搅拌均匀，用5^#针头的注射器将上述悬浮液滴入200mL浓度为20g/L的CaCl₂溶液中，4℃硬化4h，用蒸馏水将硬化后的海藻酸钙凝胶球(直径2-3mm)洗涤3次，再移入200mL含有CaCl₂的葡萄糖溶液中，其终浓度为0.5g/L CaCl₂、200g/L葡萄糖，放置于4℃冰箱中保存待用，按实施例2得到的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒，其直径大小为2-3mm，球形，机械强度一般，其细胞含量10^7-8个/g，活性稳定。西红柿培养基：西红柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH 6.0。

实施例3

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 7.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例2制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-溴苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-溴苯乙酮在混合物中浓度分别为130.6mmol/L和6mmol/L，于30℃，180r/min，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为1.0g/mL，反应2h，得到(R)-4-溴苯乙醇，气相检测其产率为85.4％，(R)-4-溴苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为145℃，维持10min后，以1℃/min的速率升至150℃，维持6min。4-溴苯乙酮，(R)-4-溴苯乙醇和(S)-4-溴苯乙醇的保留时间分别为13.40，18.86和19.56min。

实施例4

将6mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.2mol/L，pH 6.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例2制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞以及异丙醇和4-氟苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-氟苯乙酮在混合物中浓度分别为195.6mmol/L和12mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.5g/mL，于30℃，200r/min，反应8h，得到(R)-4-氟苯乙醇，气相检测其产率为64.9％，(R)-4-氟苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为110℃，维持5min后，以1℃/min的速率升至120℃，维持3min。4-氟苯乙酮，(R)-4-氟苯乙醇和(S)-4-氯苯乙醇的保留时间分别为8.83，14.58和15.35min。

实施例5

将2mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.05mol/L，pH 4.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-氯苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-氯苯乙酮在混合物中浓度分别为130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.1g/mL，于25℃，180r/min，反应10h，得到(R)-4-氯苯乙醇，气相检测其产率为79.6％，(R)-4-氯苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为140℃，维持10min后，以1℃/min的速率升至145℃，维持4min。4-氯苯乙酮，(R)-4-氯苯乙醇和(S)-4-氯苯乙醇的保留时间分别为9.12，14.32和14.90min。

实施例6

将6mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 7.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例2制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-硝基苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-硝基苯乙酮在混合物中浓度分别为43.6mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.40g/mL于35℃，160r/min，反应2h，得到(R)-4-硝基苯乙醇，气相检测其产率为69.6％，(R)-4-硝基苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为175℃，维持23min。4-硝基苯乙酮，(R)-4-硝基苯乙醇和(S)-4-硝基苯乙醇的保留时间分别为10.74，20.89和21.70min。

实施例7

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.05mol/L，pH 4.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-甲氧基苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-甲氧基苯乙酮在混合物中浓度分别为261.2mmol/L和10mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.30g/mL，于25℃，160r/min，反应8h，得到(R)-4-甲氧基苯乙醇，气相检测其产率为79.3％，(R)-4-甲氧基苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为140℃，维持10min后，以1℃/min的速率升至145℃，维持4min；载气为氮气，流速为3.0mL/min，分流比1∶100；进样量1μL。在该分析条件下，4-甲氧基苯乙酮、内标正壬烷、(R)-4-甲氧基苯乙醇和(S)-4-甲氧基苯乙醇的保留时间分别为2.00，16.00，16.90和17.20min。最大相对误差小于1.0％。

实施例8

将4mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 7.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-甲基苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-甲基苯乙酮在混合物中浓度分别为130.6mmol/L和20mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.30g/mL，于30℃，180r/min，反应12h，得到(R)-4-甲基苯乙醇，气相检测其产率为55.4％，(R)-4-甲基苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

气相检测方法：色谱柱初始温度为125℃，维持10min后，以1℃/min的速率升至130℃，维持5min。4-甲基苯乙酮，(R)-4-甲基苯乙醇和(S)-4-甲基苯乙醇的保留时间分别为10.49，17.15和18.11min。

实施例9

将6mL的三乙醇胺盐酸缓冲液(三乙醇胺在盐酸中浓度为0.1mol/L，pH 6.0)装入具塞的三角瓶中，然后分别加入实施例1制备的湿菌体的固定化醋酸杆菌细胞颗粒以及异丙醇和4-甲氧基苯乙酮形成混合物，异丙醇和4-甲氧基苯乙酮在混合物中浓度分别为130.6mmol/L和8mmol/L，固定化醋酸杆菌细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.30g/mL，于30℃，180r/min，反应8h，得到(R)-4-甲氧基苯乙醇，气相检测(气相检测条件同实施例7)其产率为70.3％，(R)-4-甲氧基苯乙醇对映体纯度为99％以上e.e.。

序列列表

SEQ.ID.NO1：

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1396

<212>DNA

<213>醋酸杆菌(Acetobacter sp.)

<400>1

caagtcgcac gaacctttcg gggttagtgg cggacgggtg agtaacgcgt aggaatctgt    60

ccatgggtgg gggataactc tgggaaactg gagctaatac cgcatgatac ctgagggtca    120

aaggcgcaag tcgcctgtgg aggagcctgc gttcgattag ctagttggtg gggtaaaggc    180

ctaccaaggc gatgatcgat agctggtttg agaggatgat cagccacact gggactgaga    240

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gggcaaccct    300

gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttcgacgggg    360

acgatgatga cggtacccgt agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta    420

atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatg actgggcgta aagggcgtgt aggcggtttg    480

tacagtcaga tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggagct gcatttgata cgtgcagact    540

agagtgtgag agagggttgt ggaattccca gtgtagaggt gaaattcgta gatattggga    600

agaacaccgg tggcgaaggc ggcaacctgg ctcattactg acgctgaggc gcgaaagcgt    660

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt gtgctagatg    720

ttgggtaact ttgttattca gtgtcgcagt taacgcgtta agcacaccgc ctggggagta    780

cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt    840

ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagggctt gaatgtagag gctgtattca    900

gagatggata tttcccgcaa gggacctcta acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc    960

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatctt tagttgccag    1020

cacgtttggg tgggcactct agagagactg ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg    1080

acgtcaagtc ctcatggccc ttatgtcctg ggctacacac gtgctacaat ggcggtgaca    1140

gtgggaagct agatggtgac atcgtactga tctctaaaag ccgtctcagt tcggattgca    1200

ctctgcaact cgagtgcatg aaggtggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg    1260

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt ggtttgacct    1320

taagccggtg agcgaacccg caaggggcgc agccgaccac ggtcgggtca gcgactgggg    1380

tgaagtcgta acaagg                                                    1396

SEQ.ID.NO2：

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcac    37

SEQ.ID.NO3：

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agagtttgat cctggctcag                       20

Claims (5)

1.应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于：在三乙醇胺的盐酸缓冲液中，加入底物4-取代基苯乙酮、异丙醇和湿菌体的醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的固定化细胞颗粒，形成混合物，调节pH值至4.0～7.0，在温度为25～35℃，转速为160～260r/min条件下，振荡反应2～12h，进行微生物细胞催化的转化，制得(R)-4-取代基苯乙醇；所述的三乙醇胺、盐酸、4-取代基苯乙酮和异丙醇在混合物中的浓度分别为0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3-20mmol/L和43.6-200mmol/L；所述湿菌体的醋酸杆菌(Acetobacter sp.)XZY003的固定化细胞颗粒与混合物的重量体积比为0.1-1.0g/mL；所述醋酸杆菌(Acetobactersp.)XZY003保藏号为CCTCC M209061。

2.根据权利要求1所述应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于：所述pH值为4.0～5.0；所述固定化醋酸杆菌细胞在混合物中浓度为0.3g/mL。

3.根据权利要求1所述应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于：所述4-取代基苯乙酮在混合物中浓度为6mmol/L～10mmol/L。

4.根据权利要求1所述应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于：所述温度为25℃～30℃。

5.根据权利要求1-5任一项所述应用醋酸杆菌催化还原生产(R)-4-取代基苯乙醇的方法，其特征在于：所述4-取代基苯乙酮为4-溴苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-硝基苯乙酮或4-甲基苯乙酮。

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