CN104762238A - 一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用 - Google Patents

一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用，属于生物发酵技术领域。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L10-2，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2015118，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，中国典型培养物保藏中心。本发明在黄酒酿造开始时将该植物乳杆菌、原料大米、酒母和麦曲等一起加入发酵罐进行黄酒酿造，以对照组黄酒为参照样进行理化指标评价。结果表明添加该植物乳杆菌可有效降低黄酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量，极大提高了黄酒的安全性。

Description

一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
乳酸菌在自然界分布广泛，可栖居于人和各种动物的消化道及其它器官内。虽然大多数乳酸菌无毒、无害，对人体和动植物具有较好的益生效果，也被称为“益生菌”。但乳酸菌作为天然的食品发酵剂，在相对低酸和营养匮乏的条件下，为了维持自身生长会利用食品中氨基酸产生碱性生物胺，这将导致发酵食品出现一定的安全隐患。
黄酒是谷物为主要原料，经蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、澄清、过滤、煎酒、贮存和勾兑而成的酿造酒。由于黄酒的酿造地区和发酵方法存在差异，所以不同黄酒中生物胺的种类和含量有很大不同，其中的主要种类有腐胺、酪胺、组胺、精胺、亚精胺和尸胺等。黄酒中生物胺含量明显高于啤酒和葡萄酒，究其原因可能主要是因为黄酒中的氨基酸含量明显高于其他酿造酒，这为生物胺的形成提供了大量的前体物质。
生物胺是一类含氮的低分子量有机化合物的总称。根据结构可分成脂肪族芳香族和杂环族3类。生物胺不仅是生成荷尔蒙、核酸、蛋白质等的前体物质，也是生成致癌物质和亚硝基化合物的前体物质。生物胺具有强烈的急性毒性，并会产生亚急性毒性反应和致癌作用，人体在摄入过量的生物胺后会产生头疼、恶心、痉挛等一系列的中毒症状，各种生物胺的毒性存在一定差异，并且存在显著的协同作用。其中对人体危害最大的是组胺，其次是酪胺，尸胺和腐胺毒性较小，但是会增加组胺和酪胺的毒性；腐胺、尸胺、精胺和亚精胺可以与食物中的亚硝酸盐反应产生强列的致癌性物质亚硝基胺。因此，降低黄酒中生物胺的含量是很有必要的。
此外，研究发现我国黄酒中氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)含量较高，这是一种潜在致癌物，其存在影响了黄酒的安全性，制约了黄酒产业的发展，实现对黄酒中氨基甲酸乙酯含量的有效控制显得尤为重要。黄酒中的氨基甲酸乙酯主要是由尿素与乙醇在加热的条件下反应生成的，而尿素来源于酵母对精氨酸的代谢，因此对氨基甲酸乙酯含量的控制主要体现在对尿素含量的控制上。脲酶可以分解尿素为氨和二氧化碳，其中酸性脲酶能够耐受酸性环境，并且在大部分低酒精度的饮料中仍具有很高的活性，因而可作为降低成品酒中尿素含量的重要方法。
本发明旨在提供一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L10-2，将其应用于黄酒酿造中，从而降低黄酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量，提高黄酒的安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L10-2，从而降低黄酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量，提高黄酒的安全性。
所述植物乳杆菌(L.plantarum)L10-2，于2015年3月15日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2015118。该菌株不产酪氨基酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶。
本发明还提供了一种应用上述植物乳杆菌CCTCC NO:M2015118酿造高安全性黄酒的方法：将菌种活化和扩大培养后在黄酒酿造开始时，与原料大米、酒母、麦曲等一起加入发酵罐进行黄酒酿造。
在本发明的一种实施方式中，将植物乳杆菌接种至活化培养基中活化12～48h，接种到5L美国NBS公司的BioFlo 310型自动厌氧发酵罐对植物乳杆菌进行高密度培养，设置培养温度30-37℃、pH6.1-7.2，培养12-48h，然后经25000g离心30min冷冻离心制备高密度菌液。将扩大培养后的植物乳杆菌CCTCC NO:M2015118应用于黄酒酿造开始阶段：在不改变其它工艺的情况下，在酿造开始时将植物乳杆菌CCTCC NO:M2015118和原料大米、酒母、麦曲等一次性添加到黄酒发酵罐中，植物乳杆菌的添加量为体积比0.1‰～10‰(所述千分比是mL/L)。
本发明还提供一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯的方法，是将乳酸菌CCTCC NO:M2015118活化扩培后在黄酒酿造开始时，与原料大米、酒母、麦曲等一起加入发酵罐进行黄酒酿造。
本发明的酿造方法，相比现有酿造方法的优越之处：在保持黄酒原风味的基础上显著降低黄酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量。相比没有接种植物乳杆菌CCTCC NO:M2015118的样品，接种植物乳杆菌CCTCC NO:M2015118的黄酒后酵结束后的发酵醪液中生物胺浓度降低了32.1％，氨基甲酸乙酯浓度降低了26.4％。
生物材料保藏
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L10-2，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015118。
附图说明
图1乳酸菌生长曲线图
图2黄酒中生物胺含量
具体实施方式
实施例1 筛选不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌
①分别取实验室第2天、第4天、第5天、第6天、第10天、第13天自制黄酒发酵醪于蓝盖瓶中；
②取上述6个样品分别稀释104、105、106倍后取200μL于MRS平板固体培养基上涂布，37℃，厌氧培养12～48小时；
③第二天挑取平板上获得的单菌落菌种进行划线分离，37℃，厌氧培养12～48小时；
④重复上述划线分离操作3次得到纯种菌种；
⑤最后将上述得到的菌种依次进行镜检，排除酵母，得到纯种乳酸菌；
⑥将得到的所有乳酸菌按0.1‰～10‰接种量(所述千分比是mL/L)接种于液体MRS培养基中，并分别补加终浓度为10g/L的氨基酸(分别为酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸和精氨酸)，37℃厌氧培养12～48小时，并传代3次；
⑦将步骤⑥中活化后的乳酸菌接种于液体脱羧酶培养基中检测氨基酸脱羧酶活力，同时做3组平行，空白培养基对照试验。37℃，培养4天后，观察颜色变化。液体脱羧酶培养基配方(％)为：胰蛋白胨0.5，酵母膏0.5，牛肉膏0.5，氯化钠0.25，葡萄糖0.05，Tween800.1，MnSO40.05，MgSO40.02，FeSO40.004,硫胺素0.001，K2HPO40.2，CaCO30.01，溴甲酚紫0.006，5'-磷酸吡哆醛0.005，pH值5.3-5.5，1×105Pa灭菌20min。
相对于空白对照培养基呈现出黄色并澄清透明的状态，阴性菌和阳性菌均呈现浑浊，表示乳酸菌在培养基中可以正常生长。氨基酸脱羧酶阴性菌由于没有代谢碱性生物胺的能力，培养基中就没有生物胺产生，培养基不发生酸碱度的变化，而最终呈现黄色；而氨基酸脱羧酶阳性菌可以将前体氨基酸脱羧形成生物胺，使培养基的酸碱性发生改变，导致最终呈现紫色或者紫红色。
根据最后实验结果可以发现所筛出的6株乳酸菌中，有4株乳酸菌是产生物胺的，分别是第2天发酵醪中筛得的乳酸菌2-1，第4天发酵醪中筛得的乳酸菌4-4，第6天发酵醪中筛得的乳酸菌6-1和第13天发酵醪中筛得的乳酸菌13-1，其中2-1可利用酪氨酸产生酪胺，4-4可利用鸟氨酸产生腐胺，6-1可利用酪氨酸产生酪胺，而13-1可分别利用赖氨酸和酪氨酸产生尸胺和酪胺。结果如表1所示：
表1 乳酸菌脱羧酶活性检测结果
⑧将新鲜菌种接种至PYG斜面培养基，37℃培养12～48h后，取斜面的菌苔制成20mL浓菌悬液，加一滴酚红指示剂，调PH到7，即酚红刚刚转黄呈橙黄色，再将该菌悬液分为两份，一管中加入终浓度为5～10g/L结晶的尿素，另一管不加尿素作为对照，加尿素试管中的菌悬液若几分钟内由黄色变为红色，则为阳性反应，即该乳酸菌产脲酶；仍为黄色的为阴性反应，即不产脲酶。
PYG基础培养基为：蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母提取物10g，蔗糖10g，盐溶液40mL(盐溶液成分(L)：无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.48g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g)，蒸馏水1000mL。
通过将上述6株菌株2-1、4-4、5-1、6-1、10-2和13-1进行产脲酶实验检测，只有一株菌种5-1不产脲酶，其他5株菌种都产脲酶，而10-2产脲酶活性最高，结果如表2所示：
表2 乳酸菌脲酶活性检测结果
菌种10-2经16s rDNA测序鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2015118，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。10-2植物乳杆菌CCTCC No.M2015118在MRS液体培养基中所得的生长曲线如图1所示。
实施例2 加乳酸菌进行黄酒酿造
对照组黄酒制作工艺具体流程为大米蒸煮后用冷水淋冷，之后加生麦曲和纯种酵母发酵成黄酒，前发酵温度30℃，时间5-7天；后发酵温度20℃，时间23-25天。本发明工艺采用上述工艺，所不同的是刚开始阶段就将筛选的植物乳杆菌CCTCC M2015118和原料大米、麦曲、酒母一起添加到发酵罐中进行发酵酿造，植物乳杆菌的添加量为体积比0.1‰～10‰(所述千分比是mL/L)。
在不改变对照组黄酒工艺的前提下，在刚开始时就将不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌37℃培养12h制成菌悬液后和原料大米、麦曲、酒母等一起添加到发酵罐中，该植物乳杆菌添加量为体积比10‰，所述千分比是mL/L。然后对发酵结束后的发酵醪液的生物胺和氨基甲酸乙酯的含量进行测定，观察黄酒发酵过程是否正常，此发酵黄酒是否具有更高的安全性。
实施例3 按实施例2得到的黄酒与对照组黄酒进行检测分析
本实施例以对照组黄酒为参照样，对添加量体积比为10‰的植物乳杆菌酿造的黄酒中生物胺和氨基甲酸乙酯进行测定。
准确称取腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺各50mg，用0.1mol/L HCl溶液配制成浓度为l mg/mL(以生物胺单体计)的标准储备液，4℃冰箱储存；准确称取适量丹磺酰氯，以丙酮为溶液配制成浓度5mg/mL的储备液，4℃冰箱储存；分别吸取各生物胺单组分标准储备溶液，置10mL容量瓶中，用0.1mol/L HCl溶液定容至刻度，再用0.1mol/L HCl分别配制成浓度为2.5、5.0、10、25、50、100μg/mL的混合标准溶液，然后衍生处理和分析并制作标准曲线。取1mL的待衍生黄酒样于塑料离心管中，在离心管中加入1mL的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)衍生化试剂，在涡流混合器上涡旋混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min后取出；在室温下放置几分钟后，加入0.5mL饱和NaCl溶液，最后用乙醚萃取溶液，充分涡旋5min后在3200r/min下离心5min，取出上层有机相，再萃取两次，合并上层有机相用氮吹仪吹干后用1mL 0.1mol/L乙腈溶解，将其用0.45μm的有机滤膜过滤后待测。色谱柱：Waters Symmetry C18柱，250mm×4.6mm(内径)，粒度5μm；柱温：35℃；流动相：A为超纯水，B：为乙腈；荧光检测器：λex＝340nm，λem＝515nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min。梯度洗脱程序如表3：
表3梯度洗脱
黄酒发酵结束后生物胺含量的变化如表4和图2所示：
表4添加乳酸菌时黄酒后发酵液中生物胺含量
黄酒发酵结束后氨基甲酸乙酯含量的变化如表5所示：
表5添加乳酸菌时黄酒后发酵液中氨基甲酸乙酯的含量
不同工艺酿造黄酒中各种生物胺及氨基甲酸乙酯总量之间存在差异，尤其是黄酒酿造开始时添加不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌能够显著降低黄酒中的生物胺和氨基甲酸乙酯的含量。添加植物乳杆菌(10‰)的黄酒中生物胺总含量为128.102mg/L，为对照组黄酒生物胺总含量的67.9％，降低了32.1％。添加植物乳杆菌(10‰)的黄酒中氨基甲酸乙酯总含量为127.696μg/L，明显低于对照组黄酒中氨基甲酸乙酯的含量。另外本实施例分析结果表明，本发明酿造的黄酒中组胺含量仅为16.599mg/L，低于组胺的最低限量标准50mg/L，本实施例酿造的黄酒具有较高的安全性。
实施例4 加乳酸菌进行黄酒酿造
在不改变对照组黄酒工艺的前提下，在刚开始时将不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌37℃培养48h制成菌悬液后和原料大米、麦曲、酒母等一起添加到发酵罐中，该植物乳杆菌添加量为体积比0.01‰，所述千分比是mL/L。然后对发酵结束后发酵醪液的生物胺和氨基甲酸乙酯的含量进行测定，结果发现添加植物乳杆菌(0.01‰)的黄酒中生物胺总含量为对照组黄酒生物胺总含量的71.9％，降低了28.1％。添加植物乳杆菌(0.01‰)的黄酒中氨基甲酸乙酯总含量为对照组黄酒中氨基甲酸乙酯含量的24.1％。本实施例酿造的黄酒具有较高的安全性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L10-2，其特征在于，于2015年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015118，保藏地址中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述乳酸菌在黄酒酿造中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将乳酸菌CCTCC No.M2015118活化扩培后在黄酒酿造开始时，与原料大米、酒母、麦曲等一起加入发酵罐进行黄酒酿造。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在酿造刚开始时将0.1‰～10‰的植物乳杆菌CCTCC No.M2015118菌液接种于黄酒发酵液中，所述千分比是mL/L。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，将植物乳杆菌接种活化培养12～48h，然后30-37℃、pH6.1-7.2，扩培12-48h，经25000g冷冻离心30min制备高密度菌液；在黄酒酿造开始时将植物乳杆菌CCTCC No.M2015118菌液和原料大米、酒母、麦曲等一次性添加到黄酒发酵罐中，植物乳杆菌的添加量为体积比0.1‰～10‰。
6.一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，将乳酸菌CCTCC No.M2015118活化扩培后在黄酒酿造开始时，与原料大米、酒母、麦曲等一起加入发酵罐进行黄酒酿造。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在酿造刚开始时将0.1‰～10‰的植物乳杆菌CCTCC No.M2015118菌液接种于黄酒发酵液中，所述千分比是mL/L。
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