JP6444419B2 - スポロラクトバチルス・テラエおよびその使用 - Google Patents
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Description
1)斜面培養
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)の菌種を20g/Lの寒天培地を含有する固体斜面培地に接種し、40〜45℃の条件下で24〜48h培養する。
斜面培養をしたスポロラクトバチルスを無菌条件下で種培地に接種し、35〜45℃の条件下で24〜36h静置培養後、中和剤を投入して発酵液のpHを制御し、種培養液を調製する。
接種量を5〜20%の体積比で発酵培地に移し、35℃〜45℃の環境下において48〜72h培養する。42℃の温度が好ましい。
ブドウ糖、ショ糖、果糖、及び麦芽糖を炭素源とし、イースト、ペプトン、ピーナッツミール、及びコーンスティープリカーパウダーを窒素源とする。前記原料は市販ルートから入手可能である。
当該実施例で用いられた培地の組成は下記のとおりである。
雲南から採取した土壌から2gを測り、40 mLの栄養液体培地に溶解させ、42℃で24h集積培養をする。その後、無菌の生理食塩水で培養液の希釈を行い、培養液をそれぞれ10倍、100倍、1000倍、10000倍に希釈した後に栄養寒天培地を含有する培養プレードに塗布し、42℃で48h培養する。シングルコロニーが生えた後に、コロニーの面積が大きいもの、及びコロニーの周りの透明斑の面積が大きいものを選んで、発酵培地に接種し、42℃で48h静置培養を行い、D-乳酸の生成量を測定し、複数回のスクリーニングを経て、D-乳酸の生成量が比較的高い菌株を1株選出する。
1. 菌株HKM-1の生理学的同定:
生理学的同定は中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)にて完成され、具体的には表1、表2に示す通りである。
菌株HKM-1を培養し、OD600が2〜5である時に、菌株HKM-1の全ての遺伝子群を抽出し、菌株HKM-1の16S rRNAのDNA配列を増やす。選ばれる参照菌は、本発明で提供する菌株と、近縁関係が比較的近い合計10株の菌株である。菌株HKM-1の進化系統樹解析図を図1に示す。
スポロラクトバチルス・テラエHKM-1とDSM11697の2つの菌株を16SrRNAのDNA配列で比較した結果、類似性は100%である。しかしながら、Yanagida F, Suzuki K I, Kozaki M, et al. Proposal of Sporolactobacillus nakayamae subsp. nakayamae sp. nov., subsp. nov., Sporolactobacillus nakayamae subsp. racemicus subsp. nov., Sporolactobacillus terrae sp. nov., Sporolactobacillus kofuensis sp. nov., and Sporolactobacillus lactosus sp. nov[J]. International journal of systematic bacteriology, 1997, 47(2): 499-504.という文献で報告された情報によると、表1「スポロラクトバチルス・テラエHKM-1の生理学的性質―炭素源を用いた酸生成」という部分と比較した結果、表3で示したように、これら2つの菌株はヘキソースの使用に明らかな相違が存在していることが分かった。
そのうち、ステップ(2)、(3)に記載の培養過程において投入する中和剤は、炭酸カルシウムであり、pHを制御するものである。
斜面培地1Lあたり、ブドウ糖30〜50 g、イースト5〜10g、ペプトン2〜8 g、炭酸カルシウム50 g、及び寒天粉15〜25 gを含有し、残りは水である。前記種培地のpHが6.0であり、115℃で15 min滅菌する。
(1)斜面培養:スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を斜面培地に接種し、42℃で24h培養する。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
(3)発酵培養:ステップ(2)で得られた5 mLの種培養液を、40 mLの発酵培地を入れた100 mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
(3)発酵培養:ステップ(2)で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
(3)発酵培養:ステップ(2)で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
(3)発酵培養:ステップ(2)で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
斜面培地と種培地は実施例1と同様である。
(1)斜面培養:実施例1と同様である。
Claims (10)
- 一種のスポロラクトバチルスであって、前記スポロラクトバチルスは、中国典型培養物保蔵センターに受託番号CCTCC NO: M 2013389で寄託したスポロラクトバチルス・テラエ(HKM−1)である。
- 請求項1に記載のスポロラクトバチルス・テラエ(HKM−1)を用いた発酵によるD−乳酸の製造方法。
- ヘキソースを炭素源とし、イースト、コーンスティープリカーパウダー、ペプトン、及びピーナッツミールの一種又は多種を窒素源とした発酵によってD−乳酸を生成することを特徴とする、請求項2に記載のD−乳酸の製造方法。
- 前記ヘキソースがブドウ糖、麦芽糖、乳糖、ショ糖の一種又は多種であることを特徴とする、請求項3に記載のD−乳酸の製造方法。
- 請求項2〜4のいずれか1項に記載のD−乳酸の製造方法であって、下記のステップ1)〜3)を含むことを特徴とする、D−乳酸の製造方法。
ステップ1)斜面培養
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM−1)の菌種を20g/Lの寒天培地を含有する固体斜面培地に接種し、40〜45℃の条件下で24〜48h培養する。
ステップ2)種培養
斜面培養をした前記スポロラクトバチルス・テラエ(HKM−1)を無菌条件下で種培地に接種し、35〜45℃の条件下で24〜36h静置培養後、中和剤を投入して発酵液のpHを制御し、種培養液を調製する。
ステップ3)発酵培養
接種量を5〜20%の体積比で発酵培地に移し、35℃〜45℃の環境下で48〜72h培養する。 - 前記ステップ2)に記載の種培地1Lあたり、ブドウ糖100〜120g、イースト8〜12g、ペプトン3〜8g、炭酸カルシウム30〜60gを含有することを特徴とする、請求項5に記載のD−乳酸の製造方法。
- 前記ステップ3)に記載の発酵培地の組成及びその含有量が、炭素源40〜120g/L、窒素源添加量5〜20g/Lであることを特徴とする、請求項5に記載のD−乳酸の製造方法。
- 前記ステップ3)に記載の発酵培地の組成及びその含有量が、炭素源40〜120g/L、コーンスティープリカーパウダー10〜20g/L、イースト3〜10g/L、ペプトン3〜10g/L、ピーナッツミール5〜20g/Lであることを特徴とする、請求項5に記載のD−乳酸の製造方法。
- 前記ステップ3)に記載の発酵工程は流加式工程であって、前記流加式工程は、発酵液における総還元糖の含有量が20〜30g/Lより少ない時に、総還元糖の含有量を30〜70g/Lに維持させ、或いは50〜70g/Lになるように炭素源を添加することを特徴とする、請求項8に記載のD−乳酸の製造方法。
- 前記中和剤は、NaOH、NH4OH及びCa(OH)2の一種又は多種を含み、前記発酵液のpHは5.0〜7.0の範囲内に制御されていることを特徴とする、請求項5に記載のD−乳酸の製造方法。
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