CN114196713A - 一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，以葡萄糖为发酵底物，以大肠杆菌工程菌为生产菌，其特征在于，所述葡萄糖为分段流加，且呼吸商为0～1.5；本申请通过控制葡萄糖分段流加，并控制呼吸商，从而使得氨基葡萄糖的发酵产量得到提高，底物葡萄糖的转化率也提高，可达到60%，同时氨基葡萄糖的发酵二氧化碳排放含量降低，该方法可在其他发酵过程中应用，对我国碳排放减排战略具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法。
背景技术
氨基葡萄糖（2-amino-2-deoxy-D-glucose，GlcN）是一种重要的氨基己糖，由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，分子式为C6H13O5N，易溶于水及亲水性溶剂。GlcN广泛存在于真菌细胞壁及虾蟹的外骨骼中，是甲壳素与壳聚糖的组成成分。在自然界中，细菌、酵母、真菌、植物及动物体内也广泛存在GlcN。GlcN也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分，在人与动物的关节软骨组织中起着重要作用，并大量存在于人类眼睛晶状体中。早在 20个世纪60年代，GlcN 就已被大量用于骨关节炎的治疗。研究表明，它能够有效作用于软骨组织治疗风湿性关节炎，有消炎护肝的功效。GlcN在食品保健领域也有着广泛的应用，在一些欧美国家 GlcN被视为天然无害的食品及保健品配料而得到大量推广，而目前国内相关产品较少。目前，生产GlcN的方法主要有3种，即酸水解法、酶解法及微生物发酵法。微生物发酵法生产GlcN具有以下优点：消除了地域季节对原料来源的限制，产品无鱼腥味；生产周期短，强度高；对环境污染较小；不产生过敏反应目前，国内外对微生物发酵法生产GlcN的研究相对较少，相关产业尚未形成工业化生产规模。所以，着重对微生物代谢产GlcN的合成途径、霉菌发酵产GlcN及工程菌发酵产GlcN等方面进行了概述，并对微生物发酵法生产GlcN的研究方向进行了展望，以期对相关研究起到积极的推动作用。现有的氨基葡萄糖发酵生产在以葡萄糖为碳源表达或合成产物时，会有很大一部分碳源用于合成一些副产物，如乙酸、谷氨酸等浓度积累到一定程度时，对菌体的生长及产物合成影响较大。另外产生较多的副产物会明显降低产物的转化率，间接提高了二氧化碳的排放量。目前国内氨基葡萄糖发酵工艺主要通过限制补糖或以溶氧水平来反馈过程补料及工艺调控，该工艺控制存在滞后的问题，并且产物的产量及转化率不稳定，依据溶氧水平来反馈补料或者供氧调控容易造成补糖不足或者偏多、供氧调整偏高或者偏低的问题。补糖不足影响菌体生长，补糖过多导致菌体合成副产物增多，产物转化率低。供氧偏低影响菌体生长以及产物合成速率，供氧偏高导致菌体生长偏快，产物转化率低。
大肠杆菌中 GlcN合成代谢途径是：在氨基葡萄糖的代谢途径中，首先是葡萄糖进入到细胞中，进入细胞中的葡萄糖会在葡萄糖磷酸异构酶作用下转变为含有磷酸的6-磷酸葡萄糖，生物体内细胞内含有的氨基葡萄糖合酶会将6-磷酸葡萄糖变为氨基葡萄糖，在下一步的反应中氨基葡萄糖乙酰化酶对氨基葡萄糖其作用，将它转化为N-乙酰氨基葡萄糖。在整个大肠杆菌合成代谢途径中，大肠杆菌等微生物均会有呼吸过程作用，会排放出一定量的CO2。我国发酵行业巨大，CO2碳排放是关于温室气体排放的一个总称或简称。近年来，全球变暖已成为全世界关心的环保问题，造成全球变暖的主要原因是大量的温室气体产生，而温室气体的主要组成部分就是二氧化碳，而二氧化碳的大量排放是现代人类的生产生活造成的，归根到底是大量使用各种化石能源（煤炭、石油、天然气）造成的。根据《京都议定书》的规定，各国纷纷制定了减排二氧化碳的计划。
近年来，中国积极节能减排、不断自我加压，以更切实有效的行动，积极应对气候变化。实现碳达峰、碳中和是一场广泛而深刻的经济社会系统性变革，要把碳达峰、碳中和纳入生态文明建设整体布局，拿出抓铁有痕的劲头，如期实现2030年前碳达峰、2060年前碳中和的目标。发酵行业是关乎我国民生的一个重要行业，与食品、医药、原料等息息相关，CO2排放在发酵行业中具有普遍现象，因此要实现以上目标，在发酵过程中减少CO2排放是一个重要的环节。
本发明利用在线检测调控技术，在N-乙酰氨基葡萄糖发酵生产过程中取得了良好的效果。专利CN112592944 A 公开了“一种氨基葡萄糖生产方法”，是通过在线监测发酵液中氧消耗速率、比二氧化碳释放率将数值控制一定范围，实现氨基葡萄糖的生产方法，该专利并没有实现如何控制CER,OURRQ等生理参数指标。与本发明有着本质不同，而且该发明专利对二氧化碳排放量没有提出解决措施，本发明通过在线流加葡萄糖底物浓度并及时测定发酵液中另一种重要中间产物——谷氨酸含量，从而实现CER,OUR,RQ，在提高氨基葡萄糖发酵产量的同时，提高了底物葡萄糖的转化率，降低了副产物的浓度，从而实现降低了单罐发酵过程中的二氧化碳排放量，实现了氨基葡萄糖发酵生产的减排降能，对解决当前我国碳达峰和碳中和具有重要的参考价值。本发明通过流加底物葡萄糖，同时测定发酵液中重要副产物谷氨酸的含量，实现了控制大肠杆菌生理代谢参数OUR，CER及RQ，在大肠杆菌为生产菌种的氨基葡萄糖发酵过程，实现了分段控制RQ(呼吸商)在相应一定的范围，提高氨基葡萄糖的生产水平及底物葡萄糖的转化率，且降低了整个发酵过程中的二氧化碳的排放总量，为我国当前碳达峰和碳中和在发酵行业中提出了一种解决方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，使得氨基葡萄糖的发酵产量得到提高，底物葡萄糖的转化率也提高，可达到60%，同时氨基葡萄糖的发酵二氧化碳排放含量降低，该方法可在其他发酵过程中应用，对我国碳排放减排战略具有实际应用价值。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，以葡萄糖为发酵底物，以大肠杆菌工程菌为生产菌，进行发酵，所述葡萄糖为分段流加，且RQ为0～1.5;
所述RQ是呼吸商的简称；
所述发酵条件为温度37℃±0.5℃，压力0.02～0.08MPa，通风比0.5～2VVM，转速100～500rpm，培养周期为48-55h，pH6.3~7.3；
所述葡萄糖为质量分数为60%的葡萄糖水溶液；
大肠杆菌工程菌接种量为3%～20%。
所述分段流加为分为四段流加，且每段流加速度不同。
所述四段流加分为一段流加：发酵起始后1～3h，葡萄糖流加速度为40~60L/h，RQ为0.05～0.8；二段流加：发酵起始后3～12h，葡萄糖流加速度为120~200L/h，RQ为0.8～1.1；三段流加：发酵起始后12～48h，葡萄糖流加速度为300~400L/h，RQ为0.8～1.5；四段流加：发酵起始后48-55h，葡萄糖流加速度为200~250L/h，RQ为0.8～1.2。
发酵过程中控制发酵液中谷氨酸含量不超过0.2g/L。
发明具有以下有益技术效果：
1.以大肠杆菌基因工程菌为氨基葡萄糖生产菌，通过流加葡萄糖底物并监测发酵液中副
产物谷氨酸的产量，实现一种氨基葡萄糖的生产菌呼吸熵RQ在一定合理范围。
2.由于RQ=CER/OUR，因发酵过程中底物葡萄糖流加速率不同，菌体生理代谢不同，通过控制底物葡萄糖流加速率，利用质谱仪在线监控可反馈发酵过程中的葡萄糖的底物浓度及副产物谷氨酸浓度，从而提高氨基葡萄糖发酵产量和提高底物葡萄糖的转化率。
3.葡萄糖浓度为60%(质量体积比)，葡萄糖流加速度分段控制：1-3小时，补糖流速为：40~60L/h；3.5-12小时 120~200L/h； 12-48小时 300~400L/h，48-55小时（放罐） 200~250L/h，通过反馈控制，质谱仪在线测定生产菌株的代谢生理参数OUR，CER，及RQ，间接计算出CO2排放量，因此，根据该方法，可以计算发酵罐在发酵周期内的CO2排放量。
4.氨基葡萄糖发酵过程中，谷氨酸是氨基葡萄糖生产菌的重要代谢产物之一，也是反映氨基葡萄糖发酵水平的重要参数。谷氨酸在发酵液中的含量与CO2排放量呈相关性，根据葡萄糖底物浓度流加控制策略，建立了基于呼吸商RQ与谷氨酸含量策略从而降低整个发酵期的CO2排放量。
发酵液中的谷氨酸含量全程控制在0-0.2之间，即有利于氨基葡萄糖的发酵，又可控制发酵过程中的二氧化碳排放量。
附图说明
图1为实施实例1在线质谱仪测定的菌体生理代谢参数OUR,CER在线值。
图2为实施实例1在线质谱仪根据生理代谢参数CER在线值计算得到的二氧化碳排放量。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
1）种子活化：从保存-80℃超低温冰箱取出菌株甘油管，从甘油管中吸取0.1ml保存液稀释（以稀释长出单菌落为准的稀释度）涂平板：于37℃条件下培养12小时，获得种子单菌落；
2）摇瓶培养：从单菌落平板上挑取单菌落至摇瓶培养基中，摇瓶培养温度为37℃±0.5℃，转速为250rpm，培养时间12小时，当OD660nm达到2.0时接种到种子罐，接种量为0.2%。
3）种子扩大培养：种子扩大培养在种子罐中进行，种子罐培养条件包括培养温度为37℃±
0.5℃，罐压为0.06MPa，通风比为1.5VVM，转速为300rpm，培养周期为24小时，当OD660nm达到2.0时接种到发酵罐中，接种量控制在10%。
4）发酵罐培养：发酵罐温度37℃±0.5℃，罐压为0.05MPa，通风比为1.5VVM，转速为200rpm。发酵过程中通过补加液氨将发酵液pH控制在 7.0。
5）葡萄糖补料控制大肠杆菌生理代谢参数和CER，OUR与RQ：配置质量浓度60%的葡萄糖，0小时通过补料罐压入灭好菌的葡萄糖液，根据微生物的生长消耗特征，通过分段补入葡萄糖控制RQ，CER，OUR在一定范围，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量，降低含量对二氧化碳排放影响，从而获得减少氨基葡萄糖整个发酵过程二氧化碳排放量的控制方法。
实验过程中，通过分段流加葡萄糖，控制RQ在一定范围，以半小时为间隔，采集发酵55小时内，其二氧化碳排放量、OUR、CER，结果见表1。从结果中可知，在发酵初期 0小时和0.5小时，RQ=0，CER为0，二氧化碳排放量为0，主要是由于发酵种子移入到发酵罐中，由于菌体量少，菌体处于延迟期，代谢活力很低，几乎检测不到二氧化碳排放量。随着发酵时间的进行，在1小时~3小时，补糖流速为控制为60L/h ，RQ为0.05~0.8之间，CER 0.2~4.5 mmol/Lh，二氧化碳排放量在之间0.05~0.7%之间，高于空气中二氧化碳0.03%含量。在3.5小时~12小时时间段，控制补糖流速为200L/h ，RQ为0.8~1.1之间，二氧化碳排放量在之间4~5%之间，为对照空气中二氧化碳0.03%含量的100倍以上，该阶段，发酵处于对数生长期，菌体大量繁殖，代谢呼吸，消耗大量氧气，产出的二氧化碳大量排出。12小时-48小时，控制补糖流速为400L/h，RQ维持为0.8~1.5，48-放罐阶段，控制补糖流速为250L/h， RQ维持为0.8~1.2之间，调节菌体代谢活力，减少二氧化碳排放量的同时保证氨基葡萄糖的生产发酵水平。本发明经过数据统计与专利CN112592944 A进行比较见表2，由于专利CN112592944 A，未提及CER范围，根据RQ=CER/OUR，关系，推导出该专利CER为5~80mmol/Lh，根据该数据比较，计算出二氧化碳排放量减少3倍，氨基葡萄糖发酵水平维持在148g/L，转化率为58%，全程发酵液中谷氨酸含量低于0.18g/L。
表1 实施例1二氧化碳排放量与RQ阶段控制之间数据统计
表1
表2 本发明与CN112592944 A专利中实施例1的二氧化碳减排对比结果
表2
从二氧化碳排放量可看出，本发明尾气中二氧化碳含量远远低于CN112592944 A所述结果,葡萄糖转换率高，且氨基葡萄糖放罐效价为140g-160g/L，并且具有明细的CO2减排效益。
实施例2
1）种子活化：从保存-80℃超低温冰箱取出菌株甘油管，从甘油管中吸取0.1~0.2ml保存液稀释（以稀释长出单菌落为准的稀释度）涂平板：于30~40℃条件下培养12小时，获得种子单菌落；
2）摇瓶培养：从单菌落平板上挑取单菌落至摇瓶培养基中，摇瓶培养温度为37℃±0.5℃，转速为200rpm，培养时间6~24小时，当OD660nm达到1.5~3.0时接种到种子罐，接种量为0.1-2%。
3）种子扩大培养：种子扩大培养在种子罐中进行，种子罐培养条件包括培养温度为37℃±0.5℃，罐压为0.04MPa，通风比为1.5VVM，转速为400rpm，培养周期为6~48
小时，当OD660nm达到2.5~3.0时接种到发酵罐中，接种量12%。
4）发酵罐培养：发酵罐温度37℃±0.5℃，罐压为0.05MPa，通风比为1.5VVM，转速为50~300rpm。发酵过程中通过补加液氨将发酵液pH控制在6.3~7.3。
5）葡萄糖补料控制大肠杆菌生理代谢参数和CER，OUR与RQ：配置质量浓度60%的葡萄糖，0小时通过补料罐压入灭好菌的葡萄糖液，根据微生物的生长消耗特征，通过分段补入葡萄糖控制RQ，CER，OUR在一定范围，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量，降低含量对二氧化碳排放影响，从而获得减少氨基葡萄糖整个发酵过程二氧化碳排放量的控制方法。
本实施实例RQ具体控制方法为：在1小时~3小时，补糖流速为控制为50L/h ，RQ为0.04~0.9之间，CER 0.2~4.5 mmol/Lh，二氧化碳排放量在之间0.05~0.7%之间，高于空气中二氧化碳0.03%含量。在3.5小时~12小时时间段，控制补糖流速为160L/h ，RQ为0.8~1.1之间，二氧化碳排放量在之间4~5%之间，为对照空气中二氧化碳0.03%含量的100倍以上，该阶段，发酵处于对数生长期，菌体大量繁殖，代谢呼吸，消耗大量氧气，产出的二氧化碳大量排出。12小时-48小时，控制补糖流速为300L/h，RQ维持为0.8~1.5，48-55小时，控制补糖流速为220L/h， RQ维持为0.8~1.2之间，调节菌体代谢活力，减少二氧化碳排放量的同时保证氨基葡萄糖的生产发酵水平。全程测定谷氨酸含量低于0.12g/L，最终计算出二氧化碳排放量减少3.2倍，氨基葡萄糖发酵水平维持在156g/L，转化率在57%。
实施例3
1）种子活化：从保存-80℃超低温冰箱取出菌株甘油管，从甘油管中吸取0.1~0.2ml保存液稀释（以稀释长出单菌落为准的稀释度）涂平板：于30~40℃条件下培养12小时，获得种子单菌落；
2）摇瓶培养：从单菌落平板上挑取单菌落至摇瓶培养基中，摇瓶培养温度为37℃±0.5℃，转速为200rpm，培养时间6~24小时，当OD660nm达到1.5~3.0时接种到种子罐，接种量为0.1-2%。
3）种子扩大培养：种子扩大培养在种子罐中进行，种子罐培养条件包括培养温度为37℃±0.5℃，罐压为0.04MPa，通风比为1.5VVM，转速为400rpm，培养周期为6~48
小时，当OD660nm达到2.5~3.0时接种到发酵罐中，接种量12%。
4）发酵罐培养：发酵罐温度37℃±0.5℃，罐压为0.05MPa，通风比为1.5VVM，转速为50~300rpm。发酵过程中通过补加液氨将发酵液pH控制在6.3~7.3。
5）葡萄糖补料控制大肠杆菌生理代谢参数和CER，OUR与RQ：配置质量浓度60%的葡萄糖，0小时通过补料罐压入灭好菌的葡萄糖液，根据微生物的生长消耗特征，通过分段补入葡萄糖控制RQ，CER，OUR在一定范围，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量，降低含量对二氧化碳排放影响，从而获得减少氨基葡萄糖整个发酵过程二氧化碳排放量的控制方法。
本实施实例RQ具体控制方法为：在1小时~3小时，补糖流速为控制为50L/h ，RQ为0.04~0.9之间，CER 0.2~4.5 mmol/Lh，二氧化碳排放量在之间0.05~0.7%之间，高于空气中二氧化碳0.03%含量。在3.5小时~12小时时间段，控制补糖流速为180L/h ，RQ为0.8~1.1之间，二氧化碳排放量在之间4~5%之间，为对照空气中二氧化碳0.03%含量的100倍以上，该阶段，发酵处于对数生长期，菌体大量繁殖，代谢呼吸，消耗大量氧气，产出的二氧化碳大量排出。12小时-48小时，控制补糖流速为300L/h，RQ维持为0.8~1.5，48-55小时，控制补糖流速为200L/h， RQ维持为0.8~1.2之间，调节菌体代谢活力，减少二氧化碳排放量的同时保证氨基葡萄糖的生产发酵水平。全程监测发酵液中的谷氨酸含量低于0.15g/L，最终计算出二氧化碳排放量减少3.6倍，氨基葡萄糖发酵水平维持在162g/L，转化率在59%。
实施例4
1）种子活化：从保存-80℃超低温冰箱取出菌株甘油管，从甘油管中吸取0.1~0.2ml保存液稀释（以稀释长出单菌落为准的稀释度）涂平板：于30~40℃条件下培养12小时，获得种子单菌落；
2）摇瓶培养：从单菌落平板上挑取单菌落至摇瓶培养基中，摇瓶培养温度为37℃±0.5℃，转速为200rpm，培养时间6~24小时，当OD660nm达到1.5~3.0时接种到种子罐，接种量为0.1-2%。
3）种子扩大培养：种子扩大培养在种子罐中进行，种子罐培养条件包括培养温度为37℃±0.5℃，罐压为0.04MPa，通风比为1.5VVM，转速为400rpm，培养周期为6~48
小时，当OD660nm达到2.5~3.0时接种到发酵罐中，接种量12%。
4）发酵罐培养：发酵罐温度37℃±0.5℃，罐压为0.05MPa，通风比为1.5VVM，转速为50~300rpm。发酵过程中通过补加液氨将发酵液pH控制在6.3~7.3。
5）葡萄糖补料控制大肠杆菌生理代谢参数和CER，OUR与RQ：配置质量浓度60%的葡萄糖，0小时通过补料罐压入灭好菌的葡萄糖液，根据微生物的生长消耗特征，通过分段补入葡萄糖控制RQ，CER，OUR在一定范围，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量，降低含量对二氧化碳排放影响，从而获得减少氨基葡萄糖整个发酵过程二氧化碳排放量的控制方法。
本实施实例RQ具体控制方法为：在1小时~3小时，补糖流速为控制为55L/h ，RQ为0.04~0.9之间，CER 0.2~4.5 mmol/Lh，二氧化碳排放量在之间0.05~0.7%之间，高于空气中二氧化碳0.03%含量。在3.5小时~12小时时间段，控制补糖流速为180L/h ，RQ为0.8~1.1之间，二氧化碳排放量在之间4~5%之间，为对照空气中二氧化碳0.03%含量的100倍以上，该阶段，发酵处于对数生长期，菌体大量繁殖，代谢呼吸，消耗大量氧气，产出的二氧化碳大量排出。12小时-48小时，控制补糖流速为250L/h，RQ维持为0.8~1.5，48-55小时，控制补糖流速为240L/h， RQ维持为0.8~1.2之间，调节菌体代谢活力，减少二氧化碳排放量的同时保证氨基葡萄糖的生产发酵水平。全程监测发酵液中的谷氨酸含量低于0.13g/L，最终计算出二氧化碳排放量减少3.9倍，氨基葡萄糖发酵水平维持在166g/L，转化率在60%。
下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果：
1.1试验地点：山东润德生物科技有限公司氨基葡萄糖发酵车间。
1.2实验检测： N-乙酰氨基葡萄糖测定: HPLC法 参考【王英锋,晏利芝,郭雪清.HPLC示差折光分析法测定D-氨基葡萄糖盐酸盐中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖，首都师范大学学报(自然科学版) 2008,29(1):40-42】，菌体生理参数—质谱仪在线测定尾气，利用Biostar在线计算OUR,CER及RQ。60%葡萄糖液补加流速控制利用流量计控制。
1.3供试材料： 氨基葡萄糖生产菌-大肠杆菌工程菌（E. coli -RD），胰蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸镁，硫酸铵，KH2PO4均购于国药集团化学试剂有限公司。
1.4实验实施：见实施实例1-4
本申请除各处理不同外，其它实施均一致。
2结果与分析
对照组：1.1-1.3条件完全相同，但对照组是山东润德生物科技有限公司生产上控制方式，是根据溶解氧（DO）值进行控制，方法是通过补糖速率保证溶氧值不低于30%，与本发明通过补糖与RQ控制进行对比，结果如下表。
通过与对照相比，实验实施后氨基葡萄糖的发酵水平最高达到166 g/L，提高了36.1%，葡萄糖转化率提高了19个百分点，二氧化碳排放量减少了3.9倍。
Claims (4)
1.一种降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，以葡萄糖为发酵底物，以大肠杆菌工程菌为生产菌，进行发酵，其特征在于，所述葡萄糖为分段流加，且RQ为0～1.5;
所述RQ是呼吸商的简称；
所述发酵条件为温度37℃±0.5℃，压力0.02～0.08MPa，通风比0.5～2VVM，转速100～500rpm，培养周期为48-55h，pH6.3~7.3；
所述葡萄糖为质量分数为60%的葡萄糖水溶液；
大肠杆菌工程菌接种量为3%～20%。
2.如权利要求1所述的降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，所述分段流加为分为四段流加，且每段流加速度不同。
3.如权利要求1或2所述的降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，其特征在于，所述四段流加分为一段流加：发酵起始后1～3h，葡萄糖流加速度为40~60L/h，RQ为0.05～0.8；二段流加：发酵起始后3～12h，葡萄糖流加速度为120~200L/h，RQ为0.8～1.1；三段流加：发酵起始后12～48h，葡萄糖流加速度为300~400L/h，RQ为0.8～1.5；四段流加：发酵起始后48-55h，葡萄糖流加速度为200~250L/h，RQ为0.8～1.2。
4.如权利要求3所述的降低氨基葡萄糖发酵过程中二氧化碳排放量方法，其特征在于，发酵过程中控制发酵液中谷氨酸含量不超过0.2g/L。
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