CN111996136A - 一种荧光假单孢杆菌发酵培养基、培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种荧光假单孢杆菌发酵培养基、培养方法与应用。本发明的荧光假单孢杆菌发酵培养基中包含尿素及钼酸钠，所述钼酸钠与所述尿素的质量比为(1‑5)：(10‑30)。此外，还以葡萄糖、甘油和大豆油为碳源，以玉米浆为氮源，并包括：氯化钠、亮氨酸、碳酸钙和消泡剂。以该培养基进行荧光假单孢杆菌的发酵培养，可显著提高荧光假单孢杆菌的细胞活性，且使得莫匹罗星的发酵产量有了明显的提高。此外，本发明培养方法成本低，培养发酵工艺简便，利用推广应用，适于工业化生产莫匹罗星。

Description

一种荧光假单孢杆菌发酵培养基、培养方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种荧光假单孢杆菌发酵培养基、培养方法与应用。
背景技术
莫匹罗星(Mupirocin)是由荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescens)发酵产生。其作用机制是抑制细菌异亮氨酸-转运核糖核酸合成酶的第一步氨基酰化反应，即抑制异亮氨酰腺苷酸的生物合成，从而导致转运核糖核酸的缺失。
莫匹罗星在需氧革兰阳性球菌上会产生很好的抗菌活性，特别是对于能感染皮肤的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，对一些革兰氏阴性菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏球菌同样具有生长抑制作用。莫匹罗星在临床应用的范围逐步拓展，且其副作用较小，经济实惠，因此，在浅层皮肤细菌抗感染的治疗方面，此产品已经成为最佳的治疗药物之一，具有广泛的市场发展前景。
目前莫匹罗星的生产方法主要是生物发酵方法，但是目前荧光假单孢杆菌的生产能力仍有待进一步提高。尤其是在工业化扩大生产中，如何在保证生产成本低的情况下，获得更佳的生产效率，仍是需要进一步摸索解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可有效提升荧光假单孢杆菌活性和莫匹罗星产量的培养基。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种荧光假单孢杆菌发酵培养基，所述发酵培养基中包含钼酸钠及尿素，所述钼酸钠与所述尿素的质量比为(1-5)：(10-30)。
本发明发现，当在培养荧光假单孢杆菌时加入钼酸钠及尿素，并将两者以特定质量比组合后，可使得该菌的细胞活性有明显的提高，并进一步提高发酵效价，使得莫匹罗星的产量得以提升。
本发明中，所述钼酸钠与所述尿素的质量比为(1-3)：(14-16)，优选为2:15，以获得更好地协同提升发酵效价的效果。
本发明中，所述钼酸钠的添加量为所述发酵培养基重量的0.01％—0.1％，优选为0.01％—0.05％，更优选为0.02％。
本发明中，尿素的添加量为所述发酵培养基重量的0.1％-1％，优选为0.1％—0.3％，更优选为0.15％，以既能节约生产成本又能有效提高效价。
本发明中，以葡萄糖、甘油和大豆油为碳源，还以玉米浆为氮源，且所述的发酵培养基还包括：氯化钠、亮氨酸、碳酸钙和消泡剂。
本发明的培养基可更好地配合钼酸钠和尿酸，共同发挥促进荧光假单孢杆菌活性和生产效率的作用。
本发明中，以质量百分比计包括：葡萄糖：1.5-2.5％，甘油：0.4-0.6％，氯化钠：0.3-0.5％，玉米浆：0.3-0.5％，亮氨酸0.08-0.12％，碳酸钙：0.25-0.35％，大豆油：0.8-1.2％，泡敌：0.015-0.025％。
优选以质量百分比计包括：葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.4％，玉米浆：0.4％，亮氨酸0.1％，碳酸钙：0.3％，大豆油：1％，泡敌：0.02％。
本发明进一步优选的发酵培养基以质量百分比计包括：钼酸钠0.02％，尿素0.15％，葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.4％，玉米浆：0.4％，亮氨酸0.1％，碳酸钙：0.3％，大豆油：1％，泡敌：0.02％，余量为水。
本发明培养基中各组分浓度适宜，配比合理，可维持理想的渗透压，既提升了培养效果，又节约了成本，避免原料浪费。
本发明还提供了一种荧光假单孢杆菌的发酵方法，其使用上述的发酵培养基进行所述荧光假单孢杆菌的发酵培养。
本发明中，所述发酵方法为二级发酵；一级发酵时采用种子培养基，二级发酵时采用上述的发酵培养基。
具体发酵方法包括如下步骤：
(1)在发酵培养基灭菌之前，将钼酸钠和尿素与发酵培养基其他组分混合均匀，充分溶解，然后进行灭菌；
(2)进行摇瓶种子液培养，成熟后接入种子罐中，待种子罐生长成熟后再转入含上述发酵培养基的发酵罐。
优选，灭菌方式为：采用温度为120-125℃的蒸汽灭菌30-40分钟。
在实际生产中可将发酵培养基混合均匀，充分溶解，在发酵罐中的进行培养基灭菌并冷却到25℃，并进行无菌保压，之后将种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养。
本发明中，所述种子培养基为：葡萄糖：1.5-2.5％，甘油：0.4-0.6％，氯化钠：0.045-0.055％，氯化钾：0.045-0.055％，碳酸钙或碳酸锰：0.3-0.5％，硫酸镁：0.035-0.045％，豆油：0.15-0.25％；
优选为：葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.05％，氯化钾：0.05％，碳酸钙：0.4％，硫酸镁：0.04％，豆油：0.2％；
本发明中，二级发酵时的培养条件为：温度24-26℃，罐压0.045-0.055Mp，通气量0.5-0.8vvm，搅拌转速为130-250转，溶氧维持在30％以上；
优选为：温度25℃，罐压0.05Mp，通气量0.5vvm，搅拌转速为250转，溶氧发酵罐维持在30％以上，以获得更好的培养效果。
本发明另提供一种上述发酵培养基或发酵方法在荧光假单孢杆菌培养或荧光假单孢杆菌发酵制备莫匹罗星中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明采用在培养基中添加很少的钼酸钠和尿素，进行荧光假单孢杆菌发酵培养，发酵罐发酵24h开始测细胞活性，在24小时测起步效价，在24小时测得细胞活性实验罐(发酵培养基添加有钼酸钠和尿素)比对照罐(发酵培养基不添加钼酸钠和尿素)的细胞活性(利用MTT染色法测定)明显提高，可高出80％。实验罐的起步效价可达1031ug/ml，比对照罐起步效价要高出124.6％。说明，荧光假单孢杆菌的细胞活性有明显增加，且使得发酵产量有了明显的提高。
此外，本发明培养方法成本低，培养发酵工艺简便，利用推广应用，适于工业化生产莫匹罗星。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种本发明的荧光假单孢杆菌发酵培养基及以其培养发酵生产莫匹罗星的方法。
发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：钼酸钠0.02％，尿素：0.15％，葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.4％，玉米浆：0.4％，亮氨酸0.1％，碳酸钙：0.3％，大豆油：1％，泡敌：0.02％，余量为水。
培养发酵生产莫匹罗星的方法为：
(1)生产莫匹罗星的菌种(BNCC231887)经过实验验证后，斜面经由种子瓶，培养24h，镜检：杆状、菌量多、染色深、无杂菌，pH为7.0，获得成熟种子液，进行下一步发酵。斜面培养基为营养琼脂培养基。
(2)在15升种子罐中加入种子培养基10L，灭菌后冷却到25℃，并进行无菌保压，然后在火焰的保护下，将步骤(1)获得的种子液接入种子罐中进行种子培养，接种量为100ml，种子罐培养条件为：温度25℃，罐压0.05Mp，通气量0.8vvm，培养18h，搅拌转速为300rpm，种子罐溶氧一般维持在30％以上，种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.05％，氯化钾：0.05％，碳酸钙：0.4％，硫酸镁：0.04％，豆油：0.2％，其余为水。种子培养基灭菌后pH：6.5。
(3)将上述各组分混合均匀的发酵培养基30L在50升发酵罐中进行灭菌(发酵培养基灭菌后pH：6.5)后冷却到25℃，进行无菌保压，将步骤(2)中种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养。转种量为10％。发酵罐培养条件为：温度25℃，罐压0.05Mp，通气量0.5vvm，搅拌转速为250rpm，发酵罐溶氧一般维持在30％以上。
本实施例还采用对照发酵培养基以上述培养发酵生产莫匹罗星的方法进行试验作为对照组。具体对照发酵培养基与本实施例发酵培养基的区别仅在于不加入钼酸钠和尿素。
发酵结果：发酵24h用HPLC测定本实施例的莫匹罗星效价为1031ug/ml，对照罐的莫匹罗星效价为459ug/ml；发酵120小时，用HPLC测定本实施例的莫匹罗星放罐效价为6562ug/ml，对照组放罐效价为5321ug/ml，本发明该实施例组比对照组提高了23％。本发明该实施例组发酵细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为3.5347，而对照组只有1.9634。
细胞活性测试方法为：MTT染色法。
实施例2
本实施例提供一种本发明的荧光假单孢杆菌发酵培养基及以其培养发酵生产莫匹罗星的方法。
发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：钼酸钠0.02％，尿素0.15％，葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.4％，玉米浆：0.4％，亮氨酸0.1％，碳酸锰：0.3％，大豆油：1％，泡敌：0.02％，余量为水。
培养发酵生产莫匹罗星的方法为：
(1)生产莫匹罗星的菌种(BNCC231887)经过实验验证后，斜面经由种子瓶，培养24h，镜检：杆状、菌量多、染色深、无杂菌，pH为7.0，获得成熟种子液，进行下一步发酵。斜面培养基为营养琼脂培养基。
(2)在500升种子罐中加入种子培养基300L，灭菌后冷却到25℃，并进行无菌保压，然后在火焰的保护下，将步骤(1)获得的种子液接入种子罐中进行种子培养，接种量为500ml，种子罐培养条件为：温度25℃，罐压0.05Mp，通气量0.8vvm，培养24h，搅拌转速为300rpm，种子罐溶氧一般维持在30％以上，种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.05％，氯化钾：0.05％，碳酸锰：0.4％，硫酸镁：0.04％，豆油：0.2％，其余为水。种子培养基灭菌后pH：6.5。
(3)将上述各组分混合均匀的发酵培养基4000L在5000升发酵罐中进行灭菌(发酵培养基灭菌后pH：6.5)后冷却到25℃，进行无菌保压，将步骤(2)中种子罐中的种子液转入发酵罐中进行培养。转种量为10％。发酵罐培养条件为：温度25℃，罐压0.05Mp，通气量0.8vvm，搅拌转速为130rpm，发酵罐溶氧一般维持在30％以上。
本实施例还采用对照发酵培养基以上述培养发酵生产莫匹罗星的方法进行试验作为对照组。具体对照发酵培养基与本实施例发酵培养基的区别仅在于不加入钼酸钠和尿素。
发酵结果：发酵24h用HPLC测定本实施例的莫匹罗星效价为1123ug/ml，对照罐的莫匹罗星效价为436ug/ml；发酵120小时，用HPLC测得本实施例的莫匹罗星放罐效价为6621ug/ml，对照组放罐效价为5296ug/ml，本发明该实施例组比对照组提高25％。本发明该实施例组发酵的细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为3.6353，而对照组只有2.0356。
细胞活性测试方法为：MTT染色法。
实施例3
本实施例提供一种本发明的荧光假单孢杆菌发酵培养基及以其培养发酵生产莫匹罗星的方法。
具体发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：钼酸钠0.01％，尿素0.1％，葡萄糖：1.5％，甘油：0.4％，氯化钠：0.3％，玉米浆：0.3％，亮氨酸0.08％，碳酸钙：0.25％，大豆油：0.8％，泡敌：0.015％，余量为水。
培养发酵生产莫匹罗星的方法与实施例1相同，区别仅在于：
种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：葡萄糖：1.5％，甘油：0.4％，氯化钠：0.045％，氯化钾：0.045％，碳酸钙：0.3％，硫酸镁：0.035％，豆油：0.15％，其余为水。种子培养基灭菌后pH：6.0。
步骤(3)中采用本实施例3中的上述发酵培养基。发酵培养基灭菌后pH：6.0。
发酵罐培养条件为：温度24℃，罐压0.045Mp，通气量0.6vvm，搅拌转速为200转，溶氧维持在30％以上。
发酵结果：发酵24h用HPLC测定本实施例的莫匹罗星效价为714ug/ml，发酵120小时，用HPLC测得莫匹罗星放罐效价为5921ug/ml。对该实施例组发酵的细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为3.0214。
实施例4
本实施例提供一种本发明的荧光假单孢杆菌发酵培养基及以其培养发酵生产莫匹罗星的方法。
具体发酵培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：钼酸钠0.1％，尿素1％，葡萄糖：2.5％，甘油：0.6％，氯化钠：0.5％，玉米浆：0.5％，亮氨酸0.12％，碳酸钙：0.35％，大豆油：1.2％，泡敌：0.025％，余量为水。
培养发酵生产莫匹罗星的方法与实施例1相同，区别仅在于：
种子培养基的原料配方以质量百分比计组成如下：葡萄糖：2.5％，甘油：0.6％，氯化钠：0.055％，氯化钾：0.055％，碳酸钙：0.5％，硫酸镁：0.045％，豆油：0.25％，其余为水。种子培养基灭菌后pH：7.5。
步骤(3)中采用本实施例4中的上述发酵培养基。发酵培养基灭菌后pH：7.0。
发酵罐培养条件为：温度26℃，罐压0.055Mp，通气量0.8vvm，搅拌转速为180转，溶氧维持在30％以上。
发酵结果：发酵24h用HPLC测定本实施例的莫匹罗星效价为695ug/ml，发酵120小时，用HPLC测得莫匹罗星放罐效价为5753ug/ml。对该实施例组发酵的细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为2.7621。
对比例1
本对比例按照实施例1的方法培养发酵生产莫匹罗星，区别仅在于，发酵培养基的具体配方中不添加尿素。
发酵结果：发酵120小时，莫匹罗星放罐效价为5421ug/ml，发酵细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为2.4524。
对比例2
本对比例按照实施例1的方法培养发酵生产莫匹罗星，区别仅在于，发酵培养基的具体配方中：钼酸钠的添加量为0.07％，尿素的添加量为0.1％。
发酵结果：发酵120小时，莫匹罗星放罐效价为5568ug/ml，发酵细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为2.6012。
对比例3
本对比例按照实施例4的方法培养发酵生产莫匹罗星，区别仅在于，发酵培养基的具体配方中：将0.5％的玉米浆用0.5％的酵母粉替代。
发酵结果：发酵120小时，莫匹罗星放罐效价为5659ug/ml，发酵细胞活性由开始24小时开始测得细胞活性到120小时细胞活性一直在增长，最高测得吸光值为2.7921。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种荧光假单孢杆菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中包含钼酸钠及尿素，所述钼酸钠与所述尿素的质量比为(1-5)：(10-30)。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述钼酸钠与所述尿素的质量比为(1-3)：(14-16)。
3.根据权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征在于，所述钼酸钠的添加量为所述发酵培养基重量的0.01％-0.1％，优选为0.01％-0.05％，更优选为0.02％；
和/或，所述尿素的添加量为所述发酵培养基重量的0.1％-1％，优选为0.1％-0.3％，更优选为0.15％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵培养基，其特征在于，以葡萄糖、甘油和大豆油为碳源，还以玉米浆为氮源，且所述的发酵培养基还包括：氯化钠、亮氨酸、碳酸钙和消泡剂。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，以质量百分比计包括：葡萄糖：1.5-2.5％，甘油：0.4-0.6％，氯化钠：0.3-0.5％，玉米浆：0.3-0.5％，亮氨酸0.08-0.12％，碳酸钙：0.25-0.35％，大豆油：0.8-1.2％，泡敌：0.015-0.025％。
6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，以质量百分比计包括：葡萄糖：2％，甘油：0.5％，氯化钠：0.4％，玉米浆：0.4％，亮氨酸0.1％，碳酸钙：0.3％，大豆油：1％，泡敌：0.02％。
7.一种荧光假单孢杆菌的发酵方法，其特征在于，使用如权利要求1-6任一项所述的发酵培养基进行所述荧光假单孢杆菌的发酵培养。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法为二级发酵；一级发酵时采用种子培养基，二级发酵时采用如权利要求1-6任一项所述的发酵培养基。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖：1.5-2.5％，甘油：0.4-0.6％，氯化钠：0.045-0.055％，氯化钾：0.045-0.055％，碳酸钙或碳酸锰：0.3-0.5％，硫酸镁：0.035-0.045％，豆油：0.15-0.25％；
和/或，二级发酵时的培养条件为：温度24-26℃，罐压0.045-0.055Mp，通气量0.5-0.8vvm，搅拌转速为130-250转，溶氧维持在30％以上。
10.权利要求1-6任一项所述的发酵培养基或权利要求7-9任一项所述的发酵方法在荧光假单孢杆菌培养或荧光假单孢杆菌发酵制备莫匹罗星中的应用。
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