CN106520744A - 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法。该方法包括以下步骤：(1)斜面培养；(2)种子培养；(3)发酵培养。本发明一方面改变发酵培养基中各营养组分：发酵培养基中含有Tween‑80 0.1‑1g/ml％、NH4Cl 0.1‑1g/ml％、脲 0.01‑1g/ml％，并采用葡萄糖‑Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料；另一方面控制细菌生长环境：发酵过程中通过添加氨水将pH控制在6.8‑7.5，温度控制在25‑35℃，通氧量保持1‑3vvm，从而达到大幅度提高腈水合酶发酵生产中酶活性的目的。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，尤其涉及一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法。
背景技术
腈水合酶是生产烟酰胺的重要生物催化媒介。目前关于利用微生物中的腈水合酶在生物催化烟酰胺的报道有很多：如公开号为CN1424402A的发明专利报道了采用丙酸棒杆菌产生的腈水合酶将3-氰基吡啶转化成烟酰胺，在转化过程中，当产物浓度≥5％时用ultra flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-氰基吡啶和水，等产物的累积浓度≥10％以后一次性出罐；再如公开号为CN1154364A的发明专利报道了采用固定化的红球菌属rhodochrous微生物，再多段连续槽形反应器中进行3-氰基吡啶的催化水合反应，其反应液中3-氰基吡啶的含量在10～20％重量之间；再如公开号为CN1952114A的发明专利报道了一种产腈水合酶的谷氨酸棒杆菌，经过固定化处理后在水溶液中转化3-氰基吡啶，最终在反应物总重量中所加入的3-氰基吡啶的重量为10～25％。上述的三个专利生物催化工艺的不足之处在于生物催化剂一次性加入，随着反应时间的延长，细胞受底物和产物的抑制效果逐渐增加，反应速度下降，腈水合酶活性降低，只能被动的在较低产物浓度时选择放料，最终难以得到高浓度的烟酰胺产物。
发明内容
本发明的目的是针对现有枯草芽孢杆菌腈水合酶活性较低的不足，提供一种能提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，使单位体积发酵液具有更高催化能力，强化腈水合酶活性，有效降低发酵成本，提高烟酰胺产率。
为了实现上述的发明目的，采用的技术方案如下：
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养
将菌种接到灭过菌的斜面固体培养基中25-35℃培养2-6天，接入装液量为50ml的500ml带凹口三角摇瓶中，25-35℃摇床培养24-72h，摇床转速100-300rpm，作为一级种子备用；
(2)种子培养
将培养好的一级种子按5-15％的接种量接入50ml的二级种子培养摇瓶中，25-35℃摇床培养24-72h，摇床转速100-300rpm；
(3)发酵培养
在5L发酵罐中加入2-4L发酵培养基，121℃实罐消毒10-30min，以5-15％的接种量将200-400ml种子液转入发酵罐内，在通气量1-3vvm，罐压0.01-0.1Mpa，搅拌转速100-300rpm，温度25-35℃的条件下，发酵周期72-120h；在培养过程中，每隔2-5h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，控制pH值在6.8-7.5，通过补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，在发酵培养过程中，通过添加氨水控制pH值在6.8-7.5。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述氨水的浓度(ω)为10％-30％，添加量为发酵液体积的0.5％-2.5％。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，在发酵培养过程中采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述斜面固体培养基成分为：葡萄糖1-5g/ml％、NaCl 0.1-0.3g/ml％、KH2PO4 0.1-0.3g/ml％、蛋白胨0.2-0.7g/ml％、酵母浸粉0.2-0.7g/ml％、琼脂粉1-5g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述种子培养基成分为：葡萄糖1-3g/ml％、KH2PO4 0.01-0.1g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.01-0.1g/ml％、MgSO4·7H2O 0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-0.5g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述发酵培养基成分为：葡萄糖1-5g/ml％、诱导剂IND 0.5-5ml/L、KH2PO4 0.01-1g/ml％、K2HPO4·3H2O0.01-1g/ml％、MgSO4·7H2O0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-1g/ml％、脲0.01-1g/ml％、NH4Cl0.1-1g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％、Tween-80 0.1-1g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述葡萄糖的浓度为100-500g/L。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法中，可选的，所述诱导剂IND的浓度为5-20ml/L。
与现有技术相比，有益效果是：本发明一方面改变发酵培养基中各营养组分：发酵培养基中含有Tween-800.1-1g/ml％、NH4Cl0.1-1g/ml％、脲0.01-1g/ml％，并采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料；另一方面控制细菌生长环境：发酵过程中通过添加氨水将pH控制在6.8-7.5，温度控制在25-35℃，通氧量保持1-3vvm，从而达到大幅度提高腈水合酶发酵生产中酶活性的目的。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。
本发明各实施例中使用的葡萄糖浓度为100-500g/L，诱导剂IND浓度为5-20ml/L，并且以下原料葡萄糖、诱导剂IND、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、谷氨酸、脲、NH4Cl、酵母浸粉、Tween-80均为市售。以上原料的是否有特殊要求比如纯度等级；某些试剂只能使用某一公司出品：分析纯级别，对厂家无要求。
实施例1
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌种接到灭过菌的斜面固体培养基中25℃培养6天，接入装液量为50ml的500ml带凹口三角摇瓶中，25℃摇床培养72h，摇床转速300rpm，作为一级种子备用；(2)种子培养：将培养好的一级种子按10％的接种量接入50ml的二级种子培养摇瓶中，25℃摇床培养72h，摇床转速300rpm；(3)发酵培养：在5L发酵罐中加入2L发酵培养基(质量为2.05吨)，121℃实罐消毒30min，以10％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量3vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速300rpm，温度25℃的条件下，发酵周期72h；在培养过程中，每隔2h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加30ml的氨水(ω:20％)控制pH值在6.8-7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：斜面固体培养基成分为：葡萄糖5g/ml％、NaCl 0.3g/ml％、KH2PO4 0.3g/ml％、蛋白胨0.7g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、琼脂粉3g/ml％，p H控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；种子培养基成分为：葡萄糖3g/ml％、KH2PO4 0.05g/ml％、K2HPO4·3H2O0.05g/ml％、MgSO4·7H2O0.05g/ml％、谷氨酸0.5g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；发酵培养基成分为：葡萄糖5g/ml％、诱导剂IND 5ml/L、KH2PO40.4g/ml％、K2HPO4·3H2O0.2g/ml％、MgSO4·7H2O0.05g/ml％、谷氨酸0.8g/ml％、脲0.6g/ml％、NH4Cl 0.5g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、Tween-800.5g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
实施例2
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌种接到灭过菌的斜面固体培养基中30℃培养5天，接入装液量为50ml的500ml带凹口三角摇瓶中，30℃摇床培养72h，摇床转速100rpm，作为一级种子备用；(2)种子培养：将培养好的一级种子按15％的接种量接入50m L的二级种子培养摇瓶中，30℃摇床培养72hh，摇床转速200rpm；(3)发酵培养：在5L发酵罐中加入3L发酵培养基(质量为3.08吨)，121℃实罐消毒30min，以15％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量2vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速300rpm，温度25℃的条件下，发酵周期96h；在培养过程中，每隔2h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加30ml的氨水(ω:30％)控制pH值在6.8-7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：斜面固体培养基成分为：葡萄糖4g/ml％、NaCl 0.2g/ml％、KH2PO4 0.3g/ml％、蛋白胨0.6g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、琼脂粉4g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；种子培养基成分为：葡萄糖2g/ml％、KH2PO4 0.05g/ml％、K2HPO4·3H2O0.06g/ml％、MgSO4·7H2O0.04g/ml％、谷氨酸0.3g/ml％、酵母浸粉0.6g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；发酵培养基成分为：葡萄糖5g/ml％、诱导剂IND4ml/L、KH2PO40.8g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.2g/ml％、MgSO4·7H2O 0.03g/ml％、谷氨酸0.8g/ml％、脲0.5g/ml％、NH4Cl 0.4g/ml％、酵母浸粉0.5g/ml％、Tween-800.8g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
实施例3
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌种接到灭过菌的斜面固体培养基中35℃培养4天，接入装液量为50ml的500ml带凹口三角摇瓶中，35℃摇床培养72h，摇床转速200rpm，作为一级种子备用；(2)种子培养：将培养好的一级种子按8％的接种量接入50ml的二级种子培养摇瓶中，35℃摇床培养72h，摇床转速200rpm；(3)发酵培养：在5L发酵罐中加入4L发酵培养基(质量为4.1吨)，121℃实罐消毒30min，以8％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量2vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速200rpm，温度35℃的条件下，发酵周期120h；在培养过程中，每隔3h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加80ml的氨水(ω:10％)控制pH值在6.8-7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：斜面固体培养基成分为：葡萄糖5g/ml％、NaCl 0.3g/ml％、KH2PO4 0.25g/ml％、蛋白胨0.7g/ml％、酵母浸粉0.6g/ml％、琼脂粉3g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；种子培养基成分为：葡萄糖2g/ml％、KH2PO4 0.08g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.08g/ml％、MgSO4·7H2O 0.03g/ml％、谷氨酸0.42g/ml％、酵母浸粉0.4g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min；发酵培养基成分为：葡萄糖4g/ml％、诱导剂IND 3ml/L、KH2PO40.9g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.8g/ml％、MgSO4·7H2O 0.03g/ml％、谷氨酸0.6g/ml％、脲0.3g/ml％、NH4Cl 0.8g/ml％、酵母浸粉0.8g/ml％、Tween-800.3g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
使用实施例1～3的枯草芽孢杆菌发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行培养，其结果如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌培养实验结果
培养基 培养时间 菌体生长量 酶活
实施例2 72h 62.08g/L 6983U/ml
实施例3 72h 61.45g/L 6774U/ml
实施例4 72h 60.37g/L 6565U/ml

Claims (9)

1.一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌种接到灭过菌的斜面固体培养基中25-35℃培养2-6天，接入装液量为50ml的500ml带凹口三角摇瓶中，25-35℃摇床培养24-72h，摇床转速100-300rpm，作为一级种子备用；(2)种子培养：将培养好的一级种子按5-15％的接种量接入50ml的二级种子培养摇瓶中，25-35℃摇床培养24-72h，摇床转速100-300rpm；(3)发酵培养：在5L发酵罐中加入2-4L发酵培养基，121℃实罐消毒10-30min，以5-15％的接种量将200-400ml种子液转入发酵罐内，在通气量1-3vvm，罐压0.01-0.1Mpa，搅拌转速100-300rpm，温度25-35℃的条件下，发酵周期72-120h；在培养过程中，每隔2-5h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，控制pH值在6.8-7.5，通过补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
2.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，在发酵培养过程中，通过添加氨水控制pH值在6.8-7.5。
3.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述氨水的ω浓度为10％-30％，添加量为发酵液体积的0.5％-2.5％。
4.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，在发酵培养过程中采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料。
5.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述斜面固体培养基成分为：葡萄糖1-5g/ml％、NaCl 0.1-0.3g/ml％、KH2PO40.1-0.3g/ml％、蛋白胨0.2-0.7g/ml％、酵母浸粉0.2-0.7g/ml％、琼脂粉1-5g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
6.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述种子培养基成分为：葡萄糖1-3g/ml％、KH2PO4 0.01-0.1g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.01-0.1g/ml％、MgSO4·7H2O 0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-0.5g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
7.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖1-5g/ml％、诱导剂IND 0.5-5ml/L、KH2PO4 0.01-1g/ml％、K2HPO4·3H2O 0.01-1g/ml％、MgSO4·7H2O 0.01-0.05g/ml％、谷氨酸0.05-1g/ml％、脲0.01-1g/ml％、NH4Cl 0.1-1g/ml％、酵母浸粉0.1-1g/ml％、Tween-800.1-1g/ml％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
8.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为100-500g/L。
9.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法，其特征在于，所述诱导剂IND的浓度为5-20ml/L。
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