CN106701725A - 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用 - Google Patents

一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用。其特点是发酵培养基成分为：葡萄糖1～5g/v％、诱导剂IND 0.5～5ml/L、KH2PO4 0.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O 0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl 0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween‑80 0.1～1g/v％。本发明的优点是单位体积发酵液具有高催化能力高，强化枯草芽孢杆菌腈水合酶活性，提高烟酰胺产率，有效降低发酵成本，大大提高催化效益。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种提高腈水合酶活性的枯草芽孢杆菌发酵培养基。
背景技术
烟酰胺是一种水溶性维生素且是维生素B族中的一员，腈水合酶是一些微生物在进行肟或脲代谢过程中产生的一种蛋白质，日本学者发现这一物质具有降解有毒物质乙腈的功效，并命名为“腈水合酶”，由于具有高度的选择性(区域选择性和立体选择性)，通过酶促反应可以将腈类物质转化成酰胺、醇、酯、氨基化合物、烯胺等价值更高、应用范围更广的一些化合物。腈水合酶是生产烟酰胺的重要生物催化媒介。目前关于利用微生物中的腈水合酶在生物催化烟酰胺的报道有很多，枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，属于革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。枯草芽孢杆菌作为益生菌，具有如下的优点：枯草芽孢杆菌是一类重要的益生菌生产菌株，相对于其他类型益生菌(如乳酸菌)，芽孢杆菌一般对营养要求简单，代谢速度快，而且易于分离、培养和保藏，对工业化生产技术条件不苛刻，此外芽孢杆菌生产的芽孢对热、紫外线、电离辐射和低pH(2～3)等不良环境有极强的抵抗能力；能合成维生素B1、B2、B6、盐酸等多种B族维生素。
现有腈水合酶产生菌枯草芽孢杆菌在培养过程中由于培养条件掌握不好，随着反应时间的延长，细胞受底物和产物的抑制效果逐渐增加，反应速度下降，造成腈水合酶活较低，单位体积发酵液催化能力低，发酵成本高，最终难以得到高浓度的烟酰胺产物，使得烟酰胺产率较低，影响经济效益。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，单位体积发酵液具有更高催化能力，强化枯草芽孢杆菌腈水合酶活性，提高烟酰胺产率，有效降低发酵成本，大大提高催化效益。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，其特点是发酵培养基成分为：葡萄糖1～5g/v％、诱导剂IND 0.5～5ml/L、KH2PO40.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O 0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween-800.1～1g/v％。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基中，可选的，所述葡萄糖浓度为100～500g/L。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基中，可选的，所述诱导剂IND浓度为5～20ml/L。
本发明的另一目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，其特点是该培养基用于枯草芽孢杆菌的发酵培养，在5L发酵罐中加入2～4L发酵培养基，121℃实罐消毒10～30min，以5～15％的接种量将200～400ml种子液转入发酵罐内，在通气量1～3vvm，罐压0.01～0.1Mpa，搅拌转速100～300rpm，温度25～35℃的条件下，发酵周期72～120h左右；培养过程中，每隔2～5h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，控制pH值在6.8～7.5，通过补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用中，可选的在发酵培养过程中采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料。
在上述的提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用中，可选的在发酵过程中需要控制细菌生长环境：通过添加氨水将pH控制在6.8～7.5，温度控制在25～35℃，通氧量保持1～3vvm。
与现有技术相比，本发明的优点是单位体积发酵液具有催化能力高，强化枯草芽孢杆菌腈水合酶活性，提高烟酰胺产率，有效降低发酵成本，大大提高催化效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
本发明各实施例中使用的葡萄糖浓度为100-500g/L，诱导剂IND浓度为5-20ml/L，并且以下原料葡萄糖、诱导剂IND、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、谷氨酸、脲、NH4Cl、酵母浸粉、Tween-80均为市售。以上原料的是否有特殊要求比如纯度等级；某些试剂只能使用某一公司出品：分析纯级别，对厂家无要求。
实施例1
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，成分为：葡萄糖1～5g/v％、诱导剂IND 0.5～5ml/L、KH2PO40.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O 0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl 0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween-800.1～1g/v％。
一种将上述培养基用于枯草芽孢杆菌的发酵培养，在5L发酵罐中加入2～4L发酵培养基，121℃实罐消毒10～30min，以5～15％的接种量将200～400ml种子液转入发酵罐内，在通气量1～3vvm，罐压0.01～0.1Mpa，搅拌转速100～300rpm，温度25～35℃的条件下，发酵周期72～120h左右，培养过程中，每隔2～5h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况；控制pH值在6.8～7.5，通过补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
进一步的，在发酵培养过程中采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料。
进一步的，在发酵过程中需要控制细菌生长环境中通过添加氨水将PH控制在6.8～7.5；温度控制在25～35℃；通氧量保持1～3vvm。
实施例2
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，包括以下步骤：发酵培养：在5L发酵罐中加入2L发酵培养基(质量为2.05吨)，121℃实罐消毒30min，以10％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量3vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速300rpm，温度25℃的条件下，发酵周期72h；在培养过程中，每隔2h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加30ml的氨水(ω:20％)控制pH值在6.8～7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基成分为：葡萄糖5g/v％、诱导剂IND 5ml/L、KH2PO40.4g/v％、K2HPO4·3H2O 0.2g/v％、MgSO4·7H2O 0.05g/v％、谷氨酸0.8g/v％、脲0.6g/v％、NH4Cl 0.5g/v％、酵母浸粉0.5g/v％、Tween-800.5g/v％，pH控制为6.8～7.5，121℃灭菌10-30min。
实施例3
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，包括以下步骤：发酵培养：在5L发酵罐中加入3L发酵培养基(质量为3.08吨)，121℃实罐消毒30min，以15％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量2vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速300rpm，温度25℃的条件下，发酵周期96h；在培养过程中，每隔2h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加30ml的氨水(ω:30％)的控制pH值在6.8～7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基成分为：葡萄糖5g/v％、诱导剂IND 4ml/L、KH2PO40.8g/v％、K2HPO4·3H2O 0.2g/v％、MgSO4·7H2O 0.03g/v％、谷氨酸0.8g/v％、脲0.5g/v％、NH4Cl 0.4g/v％、酵母浸粉0.5g/v％、Tween-800.8g/v％，pH控制为6.8-7.5，121℃灭菌10-30min。
实施例4
一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，包括以下步骤：发酵培养：在5L发酵罐中加入4L发酵培养基(质量为4.1吨)，121℃实罐消毒30min，以8％的接种量将400ml种子液转入发酵罐内，在通气量2vvm，罐压0.05Mpa，搅拌转速200rpm，温度35℃的条件下，发酵周期120h；在培养过程中，每隔3h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况，通过添加80ml的氨水(ω:10％)的控制pH值在6.8～7.5，补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
其中：一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基：葡萄糖4g/v％、诱导剂IND 3ml/L、KH2PO40.9g/v％、K2HPO4·3H2O 0.8g/v％、MgSO4·7H2O0.03g/v％、谷氨酸0.6g/v％、脲0.3g/v％、NH4Cl 0.8g/v％、酵母浸粉0.8g/v％、Tween-800.3g/v％，pH控制为6.8～7.5，121℃灭菌10-30min。
使用实施例2～4的枯草芽孢杆菌发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行培养，其结果如表1所示。
表1枯草芽孢杆菌培养实验结果
培养基 培养时间 菌体生长量 酶活
实施例2 72h 62.08g/L 6983U/ml
实施例3 72h 61.45g/L 6774U/ml
实施例4 72h 60.37g/L 6565U/ml

Claims (7)

1.一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，其特征在于，该发酵培养基成分为：葡萄糖1～5g/v％、诱导剂IND 0.5～5ml/L、KH2PO4 0.01～1g/v％、K2HPO4·3H2O 0.01～1g/v％、MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/v％、谷氨酸0.05～1g/v％、脲0.01～1g/v％、NH4Cl0.1～1g/v％、酵母浸粉0.1～1g/v％、Tween-80 0.1～1g/v％。
2.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，其特征在于，所述的葡萄糖浓度为100～500g/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，其特征在于，所述的诱导剂IND浓度为5～20ml/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基，其特征在于，发酵培养基成分为：葡萄糖5g/v％、诱导剂IND 5ml/L、KH2PO4 0.4g/v％、K2HPO4·3H2O0.2g/v％、MgSO4·7H2O 0.05g/v％、谷氨酸0.8g/v％、尿素0.6g/v％、NH4Cl 0.5g/v％、酵母浸粉0.5g/v％、Tween-80 0.5g/v％，pH控制为6.8～7.5，121℃灭菌10-30min。
5.一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，其特征在于，该培养基用于枯草芽孢杆菌的发酵培养，在5L发酵罐中加入2～4L如权利要求1所述的发酵培养基，121℃实罐消毒10～30min，以5～15％的接种量将200～400ml种子液转入发酵罐内，在通气量1～3vvm、罐压0.01～0.1Mpa、搅拌转速100～300rpm、温度25～35℃的条件下，发酵周期72～120h左右；培养过程中，每隔2～5h取样，测定菌体生长量、发酵液pH变化、葡萄糖含量以及酶活变化情况；控制pH值在6.8～7.5，通过补加葡萄糖-Co2+耦合溶液使其浓度保持在3～5g/L之间，当酶活出现降低时结束培养，收获菌体待用。
6.根据权利要求5所述的一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，其特征在于，在发酵培养过程中采用葡萄糖-Co2+耦合补加工艺，添加葡萄糖和诱导剂IND二者配成的补料。
7.根据权利要求5所述的一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基的应用，其特征在于，在发酵过程中需要控制细菌生长环境：通过添加氨水将pH控制在6.8～7.5，温度控制在25～35℃，通氧量保持1～3vvm。
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