CN106754522A - 一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法 - Google Patents

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王贤玉
张丽佳
左纯子
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Abstract

本发明一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：枯草芽孢杆菌种子培养基的制备、枯草芽孢杆菌菌种活化培养、枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备、对活化后的枯草芽孢杆菌种子液的扩培养和用扩培养的种子液制备枯草芽孢杆菌发酵液；所述发酵培养基的成分为糖蜜9.8g/L、(NH4)2SO4 0.2g/L、豆饼粉20g/L、葡萄糖4g/L和氯化钠4g/L，培养基灭菌前调节至pH 7.2±0.1。本发明利用枯草芽孢杆菌的生长所需营养的特性，采用糖蜜等提供营养，可以缩短枯草芽孢杆菌的继代间隔时间，加快枯草芽孢杆菌发酵时间，同时具有设备常规、操作简便、高效的特点，改良了工业化生产方法，节省了生产成本。

Description

一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌作为一种益生菌，可以应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。枯草芽孢杆菌具有安全高效，无药物残留，无毒副作用等特点，同时可通过调节机体肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，减少抗生素的使用，更能促进畜禽生长发育和机体免疫力。从动物生产和饲料工业特点看，芽孢杆菌比其他有益微生物有更多的优点，因而其研究和应用受到广泛重视。
近年来随着发酵技术的全面展开，枯草芽孢杆菌的发酵培养得到了前所未有的发展。枯草芽孢杆菌发酵是一种复杂的生化过程，其发酵好坏涉及诸多因素，除了菌种的生产性能，还与培养基的配比、原料的质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件以及过程控制等密切相关。其中营养成分控制，控制培养基的酸碱度，控制培养温度以及通气条件的控制等条件都是制约其发酵的主要原因。目前枯草芽孢杆菌发酵主要采取液体发酵方式，其使用的培养基营养消耗大，价格成本高，而且枯草芽孢杆菌及其制剂的价格低廉，市场竞争力大，都成为了制约研究枯草芽孢杆菌发展的主要因素。
发明内容
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，利用枯草芽孢杆菌的生长所需营养的特性，采用糖蜜等提供营养，可以缩短枯草芽孢杆菌的继代间隔时间，加快枯草芽孢杆菌发酵时间。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
（1）枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：在容器中装入NA培养基经121℃高压灭菌30min，冷却至室温，所述NA培养基的成分为蛋白胨20g/L、牛肉粉3g/L和氯化钠5g/L， pH为7.2±0.1；
（2）枯草芽孢杆菌菌种活化培养：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至步骤（1）制备的枯草芽孢杆菌种子培养基，37℃，100～120rpm摇床震荡培养16～20h，制成种子液；
（3）枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备：所述发酵培养基的成分为糖蜜9.8g/L 、(NH4)2SO40.2g/L、豆饼粉20g/L、葡萄糖4g/L和氯化钠4g/L，培养基灭菌前调节至pH 7.2±0.1；
（4）对活化后的枯草芽孢杆菌种子液的扩培养：将步骤（2）制备的枯草芽孢杆菌种子液按0.1～0.2%的比例接入到已装有步骤（3）所述发酵培养基的一级发酵罐中，再加入发酵培养基质量0.2～0.3%的消泡剂，在37℃，通气量0.4～0.6m3/h，转数100～120prm，空气压力0.05～0.1MPa，控制体系pH为7.2±0.1，条件下培养14～16h；
（5）用扩培养的种子液制备枯草芽孢杆菌发酵液：将上述步骤（4）制备的枯草芽孢杆菌扩培养的种子液接入到已装有步骤（3）所制发酵培养基的二级发酵罐中，再加入消泡剂，在37℃，通气量0.8～1m3/h，转数120prm，空气压力0.05～0.1MPa，控制体系pH为7.2±0.1，培养20～24h，即得枯草芽孢杆菌菌液。
糖蜜是工业制糖过程中，蔗糖结晶后，剩余不能结晶、但仍含有较多糖的液体残留物，其加工后可以作为某些食品的原料和动物饲料。其具有价格低廉，营养价值高，易溶于水，利于微生物消化吸收等特点，同时适口性好，易于成型，可为微生物制剂提供一定的物质基础。因此，本发明利用糖蜜为主的发酵培养基来培养枯草芽孢杆菌，既降低了原料成本和生产成本，也大大加快枯草芽孢杆菌发酵时间，改良了工业化生产枯草芽孢杆菌方法。
作为优选，步骤（5）中所述枯草芽孢杆菌扩培养的种子液与发酵培养基的质量比为0.001~0.002：1。
作为优选，步骤（5）中所述消泡剂与发酵培养基的质量比为0.002~0.003：1。
本发明的有益效果为：
1. 本发明采用的发酵培养基中代替一般枯草芽孢杆菌发酵培养基中玉米淀粉、部分金属离子，既降低了原料成本，也减少了玉米淀粉酶解步骤，减少了补料的工作量，进而降低了生产成本。
2. 本发明的发酵培养基的液体粘度降低，增加了发酵罐培养基溶氧量，并含有多种维生素、矿物质、蛋白质及促生长因子等成分，更有适于枯草芽孢杆菌生长的营养需要，同时可以缩短枯草芽孢杆菌的继代间隔时间，加快枯草芽孢杆菌发酵时间。
3. 本发明的培养方法具有设备常规、操作简便、高效的特点，改良了工业化生产方法，所得枯草芽孢杆菌活菌浓度可达到80-100亿/ml。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
（1）枯草芽孢杆菌ESIGMA-945种子培养基的制备：以1000ml三角瓶装有200ml NA培养基（蛋白胨2.0g，牛肉粉0.6g，氯化钠1.0g，加水补足200ml，pH7.2±0.1）经121℃高压灭菌30min，冷却至室温；
（2）枯草芽孢杆菌ESIGMA-945菌种的活化培养：将斜面保存的枯草芽孢杆菌ESIGMA-945菌种，接种至上述步骤（1）制备的枯草芽孢杆菌种子培养基，37℃ 120rpm摇床震荡培养16小时，制成种子液；
（3）枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备：糖蜜9.8g/L+(NH4)2SO40.2g/L+豆饼粉20g/L+葡萄糖4g/L+氯化钠4g/L，培养基灭菌前调节至pH 7.3；
（4）对活化后的枯草芽孢杆菌种子液的扩培养：将上述步骤（2）制备的枯草芽孢杆菌种子液按0.1%的比例接入到已装有20L上述步骤（3）制备发酵培养基的一级发酵罐中，在37℃，通气量1m3/h，转数120prm，空气压力0.08MPa，控制体系pH为7.0～7.3，消泡剂0.3%的条件下培养16h。
（5）用扩培养的种子液制备枯草芽孢杆菌发酵液：将上述步骤（4）制备的枯草芽孢杆菌扩培养的种子液按0.2%的比例接入到已装有150L上述步骤（3）制备发酵培养基的二级发酵罐中，在37℃，通气量1m3/h，转数120prm，空气压力0.1MPa，控制体系pH为7.0～7.3，消泡剂0.3%的条件下培养24h，即得枯草芽孢杆菌菌液，其中含枯草芽孢杆菌活菌浓度可达到80-100亿/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：在容器中装入NA培养基经121℃高压灭菌30min，冷却至室温，所述NA培养基的成分为蛋白胨20g/L、牛肉粉3g/L和氯化钠5g/L， pH为7.2±0.1；
（2）枯草芽孢杆菌菌种活化培养：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至步骤（1）制备的枯草芽孢杆菌种子培养基，37℃，100～120rpm摇床震荡培养16～20h，制成种子液；
（3）枯草芽孢杆菌发酵培养基的制备：所述发酵培养基的成分为糖蜜9.8g/L 、(NH4)2SO40.2g/L、豆饼粉20g/L、葡萄糖4g/L和氯化钠4g/L，培养基灭菌前调节至pH 7.2±0.1；
（4）对活化后的枯草芽孢杆菌种子液的扩培养：将步骤（2）制备的枯草芽孢杆菌种子液按0.1～0.2%的比例接入到已装有步骤（3）所述发酵培养基的一级发酵罐中，再加入发酵培养基质量0.2～0.3%的消泡剂，在37℃，通气量0.4～0.6m3/h，转数100～120prm，空气压力0.05～0.1MPa，控制体系pH为7.2±0.1，条件下培养14～16h；
（5）用扩培养的种子液制备枯草芽孢杆菌发酵液：将上述步骤（4）制备的枯草芽孢杆菌扩培养的种子液接入到已装有步骤（3）所制发酵培养基的二级发酵罐中，再加入消泡剂，在37℃，通气量0.8～1m3/h，转数120prm，空气压力0.05～0.1MPa，控制体系pH为7.2±0.1，培养20～24h，即得枯草芽孢杆菌菌液。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述枯草芽孢杆菌扩培养的种子液与发酵培养基的质量比为0.001~0.002：1。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述消泡剂与发酵培养基的质量比为0.002~0.003:1。
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