CN107312735A - 一种酵母菌和乳酸菌混合同步发酵制备微生态制剂的方法及应用 - Google Patents
一种酵母菌和乳酸菌混合同步发酵制备微生态制剂的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酵母菌和乳酸菌混合同步发酵制备微生态制剂的方法及应用。具体技术方案如下:培养基配方:糖蜜2.5%,酵母膏0.8%,柠檬酸氢二铵0.2%,乙酸钠0.5%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.02%,pH6.0。混合发酵方法:按发酵培养基的体积百分比1%‑3%接入菌种,发酵温度25‑31℃,搅拌转数100‑150rpm,发酵17‑23h。发酵液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾干得到复合微生态制剂。本发明方法制备的复合微生态制剂有效活菌浓度高,保质期长,水质净化效果突出,减少了常规复合微生态制剂制备过程需要多罐发酵,发酵后混合等过程,降低了染菌概率,利用工业下脚料作为主要发酵原料降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域中的微生物发酵方法,涉及一种产朊假丝酵母和植物乳杆菌混合发酵的方法及制备的微生态制剂在水产养殖中的应用。
背景技术
随着水产养殖业集约化经营模式的提高,残存饵料的腐烂、生物代谢物和生物残体沉积,使池塘有机污染严重,导致有害藻类和病菌的大量繁殖,水质恶化。此外,人类生活污水、各种工业废水、农业退水等的超量排放,进一步污染了养殖用水水源,养殖环境恶化。而抗生素和化学药品的滥用带来了药物在鱼虾体内大量富集残留和病原菌的抗药性等问题,导致水产品质量的下降,既危害了人类健康,也污染了环境。
养殖中后期随着饵料投入量的增加,普遍出现亚硝态氮和氨氮含量偏高现象。亚硝态氮和氨氮中的非离子氨对养殖生物均有很强的毒性。亚硝态氮直接影响养殖生物血液的携带氧能力,是诱发爆发性疾病的主要环境因子,其含量的高低直接关系到水质的好坏和养殖能否成功。非离子氨进入养殖生物体内,对酶水解反应和膜稳定性会产生明显影响,表现为呼吸困难、不摄食、免疫力下降等,养殖生物生长受到抑制甚至中毒死亡。
采用微生物技术修复养殖环境,是水产养殖业健康可持续发展的必然趋势。酵母菌和乳酸菌是水产养殖中常用的菌种,酵母菌主要用于饲料添加,乳酸菌除了用于饲料添加外对水体中亚硝态氮有较强的去除能力。由酵母菌和乳酸菌组成的复合微生态制剂大多是由单一菌剂分别发酵后按一定比例混合而成,此种方法工作量较大,且植物乳杆菌为兼性厌氧菌,单独培养需要特殊装置。酵母菌和乳酸菌有共生作用可以混合发酵,CN101805696B公布了一种除臭酵母菌和乳酸菌共培养方法,该方法步骤为:温度在20-35℃下,先在发酵罐中通气搅拌培养酵母菌2-8h,随后补加乳酸菌菌液,培养18-24h后再次补加乳酸菌菌液培养8-14h,该方法在发酵过程中接种3次增加了染菌风险,所得的菌剂用于垃圾场、餐饮场所、厕所除臭。CN101715877A中酵母菌和乳酸菌放在塑料桶中共培养5-7d,时间周期较长,且发酵过程中需要放气,所得制剂主要用于提高动物免疫力和消化吸收能力。
针对上述方法存在的不足,本发明对酵母菌和乳酸菌混合发酵进行了改进,所得到的微生态制剂能有效降解水体中亚硝态氮、氨氮和pH。
发明内容
本发明的目的是为养殖水体净化提供一种酵母菌和乳酸菌混合发酵制备微生态制剂的方法,在保证有效活菌浓度的前提下简化生产工艺,降低生产成本。
为实现上述目的,本发明公开了如下的技术内容:
一种酵母菌和乳酸菌混合发酵制备微生态制剂的方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(a)菌种活化:将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养基中,25-30℃振荡培养20-24h,将植物乳杆菌CGMCC1.511接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃瓶中,30-34℃静置培养24-30h;产朊假丝酵母菌达2.0×108~5.0×108CFU/mL,植物乳杆菌达到5.0×108~8.0×108CFU/mL;所用的YPD培养基指的是:酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL;MRS培养基指的是:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL;
(b)培养基的制备:培养基由下列组分按质量百分比组成,糖蜜1.5-2.5%,酵母膏0.5-0.8%,乙酸钠0.3-0.5%,柠檬酸氢二铵0.1-0.2%,西红柿汁5-10%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.01-0.02%,pH6.0,115℃灭菌20min;
(c)深层混合发酵:用(b)中制备的培养基,同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌种,接种量按发酵液的体积百分比1%-3%接入,菌种体积比为1:1,培养温度25-31℃,搅拌转数100-150rpm,发酵时间17-23h;
(d)复合微生态制剂的制备:将(c)中的发酵液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾干得到复合微生态制剂,晾干后复合微生态制剂的含水率为8-12%;
(e)包装保存:采用带有塑料内衬的编织袋密封包装,常温保存。
本发明优选发酵温度28℃,搅拌转数100rpm,发酵20h。 优选的发酵培养基配方为(w/w):糖蜜2.5%,酵母膏0.8%,乙酸钠0.5%,柠檬酸氢二铵0.2%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.02%,pH6.0。
本发明中酵母菌为产朊假丝酵母是好氧型真菌,乳酸菌为植物乳杆菌是兼性厌氧细菌,利用菌株生长繁殖的特点,将产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌同时接种到200L发酵罐中,产朊假丝酵母菌生长繁殖消耗罐中余氧,为植物乳杆菌生长形成一个厌氧环境,使植物乳杆菌快速繁殖,在pH降到4.0以下停止发酵。
本发明更进一步公开了采用该方法制备的酵母菌和乳酸菌混合微生态制剂在有效降低水体中pH值方面的应用。特别是在有效去除养殖水体中亚硝态、氨氮方面的应用。实验结果证明:复合微生态制剂能高效去除水体中亚硝态氮、氨氮,去除率分别达90%、84%,对pH有明显的降低作用,这样使得养殖池水质清爽、鱼虾摄食活跃。提高了养殖池内鱼虾的存活率。
本发明重点考察了酵母菌和乳酸菌混合同步发酵内容,主要解决了降低成本、缩短发酵周期、降低染菌风险等问题。
本发明公开的酵母菌和乳酸菌混合同步发酵制备微生态制剂的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
(1)本发明以廉价的工业生产下脚料为主要原料,优化混合菌的液体培养基,提供适合产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌快速生长的培养基及混合发酵方法,生产工艺简单、发酵时间短、成本低,发酵后有效活菌浓度高,产朊假丝酵母菌达2.0×107CFU/mL,植物乳杆菌达到5.13×109CFU/mL,水质净化效果优良对养殖水体中亚硝态、氨氮的去除率分别为90%和84%,能有效降低水体中pH值。
(2)本发明的方法在发酵过程中解决了染菌风险,缩短了发酵周期。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明,这里所述实施例的方案,不限制本发明,本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化,所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内,本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中产朊假丝酵母菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心:CGMCC2.281),植物乳杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心:CGMCC1.11),菌种处于公开状态,科学工作者可以向保藏机构索取。
实施例1
酵母菌和乳酸菌混合发酵制备复合微生态制剂
(a)菌种活化:将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养基中,25℃振荡培养24h,将植物乳杆菌CGMCC1.11接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃瓶中, 30℃静置培养30h。所用的YPD培养基指的是:酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL;MRS培养基指的是:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL。
(b)发酵培养基:糖蜜1.5%,酵母膏0.5%,乙酸钠0.3%,柠檬酸氢二铵0.1%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.01%,初始pH6.0,115℃灭菌20min。
(c)深层发酵:按发酵培养基的体积百分比3%同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌菌种,菌种体积比为1:1,培养温度25℃,发酵23h,发酵后产朊假丝酵母菌的有效活菌浓度为1.05×107cfu/ml,植物乳杆菌的有效活菌浓度为3.8×109cfu/ml,发酵液pH3.58。
(d)复合微生态制剂制备:以凹凸棒土为载体,将菌液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾至含水率低于12%,得到复合微生态制剂。采用带有塑料内衬的编织袋密封包装,常温保存。
实施例2
酵母菌和乳酸菌混合发酵制备复合微生态制剂
(a)菌种活化:将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养基中,30℃振荡培养20h,将植物乳杆菌CGMCC1.11接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃输液瓶中,34℃静置培养24h。所用的YPD培养基指的是:酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL;MRS培养基指的是:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL。
(b)发酵培养基:糖蜜2.0%,酵母膏0.6%,乙酸钠0.4%,柠檬酸氢二铵0.1%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.02%,初始pH6.0,115℃灭菌20min。
(c)深层发酵:按发酵培养基的体积百分比2%同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌菌种,菌种体积比为1:1,培养温度31℃,发酵17h,发酵后产朊假丝酵母菌的有效活菌浓度为6.5×106cfu/ml,植物乳杆菌的有效活菌浓度为4.3×109cfu/ml,发酵液pH3.76。
(d)复合微生态制剂制备:以凹凸棒土为载体,将菌液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾至含水率低于12%,得到复合微生态制剂。采用带有塑料内衬的编织袋密封包装,常温保存。
实施例3
酵母菌和乳酸菌混合发酵制备复合微生态制剂
(a)菌种活化:将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养基中,25℃振荡培养24h,将植物乳杆菌CGMCC1.11接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃输液瓶中,34℃静置培养24h。所用的YPD培养基指的是:酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL;MRS培养基指的是:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL。
(b)发酵培养基:糖蜜2.5%,酵母膏0.8%,乙酸钠0.5%,柠檬酸氢二铵0.2%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.02%,初始pH6.0,115℃灭菌20min。
(c)深层发酵:按发酵培养基的体积百分比1%同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌种,菌种体积比为1:1,培养温度28℃,搅拌转数100rpm,发酵20h,发酵后产朊假丝酵母菌的有效活菌浓度为2.0×107cfu/mL,植物乳杆菌的有效活菌浓度为5.13×109cfu/mL,发酵液pH3.20。
(d)复合微生态制剂制备:以凹凸棒土为载体,将菌液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾至含水率低于12%,得到复合微生态制剂。采用带有塑料内衬的编织袋密封包装,常温保存。
实施例4:酵母菌和乳酸菌混合发酵复合微生态制剂的应用
表1 天津西青区二基地示范池水质测定结果
复合微生态制剂用于对虾精养池,养殖池面积50亩,使用量为500g/亩·次,使用周期10-15d,全池泼洒。6月13日测定值为使用前初始值,6月14日开始使用,持续试验2个月到8月14日。从表1可知,复合微生态制剂能高效去除水体中亚硝态氮、氨氮,去除率分别达90%、84%,对pH有明显的降低作用,养殖池水质清爽、鱼虾摄食活跃。
Claims (5)
1.一种酵母菌和乳酸菌混合发酵制备微生态制剂的方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(a)菌种活化:将产朊假丝酵母菌CGMCC2.281接种到灭菌YPD培养中,25-30℃振荡培养20-24h,将植物乳杆菌CGMCC1.511接种到装有90%MRS灭菌培养基的玻璃瓶中,30-34℃静置培养24-30h;产朊假丝酵母菌达2.0×108~5.0×108CFU/mL,植物乳杆菌达到5.0×108~8.0×108CFU/mL;所述的YPD培养基指的是:酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL;MRS培养基指的是:蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温801.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL;
(b)培养基的制备:培养基由下列组分按质量百分比组成,糖蜜1.5-2.5%,酵母膏0.5-0.8%,乙酸钠0.3-0.5%,柠檬酸氢二铵0.1-0.2%,西红柿汁5-10%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.01-0.02%,pH6.0,115℃灭菌20min;
(c)深层混合发酵:用(b)中制备的培养基,同时接入产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌种,接种量按发酵液的体积百分比1%-3%接入,菌种体积比为1:1,培养温度25-31℃,搅拌转数100-150rpm,发酵时间17-23h;
(d)复合微生态制剂的制备:将(c)中的发酵液与凹凸棒土按质量比1:2混合,晾干得到复合微生态制剂,晾干后复合微生态制剂的含水率为8-12%;
(e)包装保存:采用带有塑料内衬的编织袋密封包装,常温保存。
2.权利要求1所述的混合发酵制备微生态制剂的方法,其特征在于:发酵温度28℃,搅拌转数100rpm,发酵20h。
3.权利要求1所述的混合发酵制备微生态制剂的方法,其特征在于发酵培养基配方为(w/w):糖蜜2.5%,酵母膏0.8%,乙酸钠0.5%,柠檬酸氢二铵0.2%,西红柿汁5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸锰0.02%,pH6.0。
4.权利要求1所述的混合发酵制备微生态制剂的方法,其特征在于:将产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌同时接种到200L发酵罐中,产朊假丝酵母菌生长繁殖消耗罐中余氧为植物乳杆菌生长形成一个厌氧环境,使植物乳杆菌快速繁殖,在pH降到4.0以下停止发酵。
5.采用权利要求1所述的方法制备的酵母菌和乳酸菌混合微生态制剂在有效降低水体中pH值和亚硝态、氨氮方面的应用;其中亚硝态去除率为90%,氨氮去除率为84%。
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