CN107815446A - 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺 - Google Patents
一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，该工艺采用补料分批发酵，过程包括：细胞快繁阶段：将菌种接种至基础发酵培养基；温度为30～37℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.2～0.5；产酶阶段：细胞浓度达到OD600＝70～90时，加入乳糖诱导工程菌产酶，直至发酵结束；培养温度为15～25℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.01～0.1。本发明工艺将补料分批发酵人为分成两个阶段并控制各阶段的培养条件，使得重组腈水合酶基因工程菌实现高密度发酵，不仅提高了产腈水合酶的工程菌的菌浓度，还提高了腈水合酶的酶活。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺。
背景技术
腈水合酶(EC 4.2.1.84)是一类广泛存在于自然界的微生物酶(迄今已报道的腈水合酶几乎全部来源于细菌)，催化腈化合物生成相应的酰胺，腈水合酶的发现和应用是工业生物技术领域中的经典代表作之一，具有化学催化剂无法比拟的优势，从而被广泛应用于酰胺化学品的合成中。腈水合酶最早被用于催化丙烯腈生产丙烯酰胺，日本是生物法合成丙烯酰胺技术的最早实践和拥有者，而且生产工艺技术也最为先进。历经三次菌种革新，由三代菌种R.rhodochrous J1，实现了生产丙烯酰胺的能力由4000吨/年提升到20000吨/年(Nagasawa T.Shimizu H.Yamada H.The superiority of the third-generationcatalyst,Rhodococcus rhodochrous J1nitrile hydratase,for industrialproduction of acrylamide[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.1993,40:189-195)。我国从上世纪80年开始进行微生物生产丙烯酰胺的研究，已取得了重大突破。上海农药研究所沈寅初院士课题组从泰山的土壤中发现了腈水合酶菌株Nocardia sp.86-163，和日本Rhodococcus Rhodochrous J1的产酶水平基本上处于同一高度(张云桦，方仁萍，沈寅初.一株产丙烯腈水合酶菌株的的研究[J].工业微生物，1998,28:1-5)(沈寅初，张国凡，韩建生.微生物生产丙烯酰胺[J].工业微生物，1994,24:24-32)。生物催化法生产烟酰胺是腈水合酶应用的另一大实例，瑞士龙沙(Lonza)集团已在我国广州南沙市建立一条年产9000吨的烟酰胺生产线，采用R.Rhodochrous J1全细胞作为催化剂，应用细胞固定化技术进行生产。
目前，应用于工业化生产的腈水合酶都是通过野生菌来表达、用野生菌细胞进行发酵生产。但野生菌发酵周期长、产酶质量不稳定。随着生物技术的迅猛发展，采用分子克隆构建腈水合酶基因工程菌，有望解决上述实际问题。重组异源蛋白的工业化生产，除了需要构建出高效稳定表达外源基因产物的工程菌外，大规模培养工程菌的技术和工艺显得日趋重要。因为，在工程菌的大规模发酵过程中，重组异源蛋白产物的产量取决于外源基因的表达水平以及菌体密度。在外源基因表达水平不变的前提下，提高工程菌的发酵密度可以大幅度提高产量，降低成本。但目前，工业化应用的产腈水合酶的微生物都是经过低密度发酵获得的，一般菌体密度(以干重计)在10g/L以下，这导致生产腈水合酶的设备投资大、效率低下、成本高昂。
发明内容
本发明提供了一种全新的高密度发酵工艺，特别适用于重组腈水合酶基因工程菌的大规模生产，该发酵工艺可显著提高基因工程菌的浓度和重组腈水合酶的酶活力。
具体技术方案如下：
一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，所述补料分批发酵的过程包括：
(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；
(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；
所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
具体的，本发明以两种菌株为例，即：表达博得特氏菌DSM 12804(Bordetellapetrii DSM 12804)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP；以及表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229。
上述重组腈水合酶基因工程菌中的重组腈水合酶分别来源于博得特氏菌(Bordetella petrii)DSM 12804和锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)SI859A；重组腈水合酶基因的碱基序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，工程菌采用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为宿主菌，以pET-30a(+)作为载体。
本发明工艺所涉及的腈水合酶是在大肠杆菌中表达的胞内酶，为了高效、大规模地获取表达腈水合酶的大肠杆菌细胞，同时利用基因工程菌具有精确的基因开关的特点，我们将发酵过程分为两个阶段、分别加以控制：即细胞快繁阶段和产酶阶段。
其中，在细胞快繁阶段，采用指数流加方式连续补加补料培养基，使基因工程菌以一恒定的比生长速率快速生长；而在产酶阶段，采用恒速流加的方式继续连续补加补料培养基，使基因工程菌的主要生理代谢活动适合腈水合酶的高效表达，这一阶段菌体快速生长和繁殖虽然较为缓慢、但并未停止，从而进一步提高发酵密度。
大肠杆菌发酵最适温度是37℃，最适pH6.8～7.2，当条件最适菌体生长时，大肠杆菌很快就会进入指数生长期。当基础培养基营养物质被耗尽后，生长进入衰亡期，但如果在基础培养基营养物质被耗尽前流加营养物质(补料培养基)，大肠杆菌的指数生长期会大大延长，从而获得高细胞密度。然而，随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加，这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降，但同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。因此，降低温度、降低比生长速率，更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。
作为优选，步骤(1)中，所述温度为32～35℃，溶氧量为20～30％；步骤(2)中，所述温度为18～20℃，溶氧量为30～50％。
作为优选，步骤(1)中，控制所述基因工程菌的比生长速率为0.2～0.3；步骤(2)中，控制所述基因工程菌的比生长速率0.01～0.04。
作为优选，步骤(1)中，以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5～15％。
作为优选，步骤(2)中，以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量为5～15g/L。
作为优选，步骤(1)中，发酵培养的时间为8～16h；步骤(2)中，发酵培养的时间为48～96h。
作为优选，所述菌种活化的过程，包括：将基因工程菌菌株接种至固体培养基上进行活化培养；
所述活化培养的温度为35～37℃，时间为8～16h；所述固体培养基为：LB-Kan固体培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7.0，20g/L琼脂粉，卡那霉素浓度为50μg/mL。
作为优选，所述种子培养的过程，包括：将活化后的菌种接种至一级种子培养基中，进行一级培养；再接种至二级种子培养基中进行二级培养；所述一级培养的温度为35～37℃，时间为8～24h；所述二级培养的温度为35～37℃，时间为3～12h。
作为优选，所述一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7.0，卡那霉素浓度为50μg/mL；
所述二级种子培养基为12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，卡那霉素浓度为50μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明工艺通过将补料分批发酵人为分成两个阶段并控制各阶段的培养条件，尤其是工程菌比生长速率的控制以及发酵过程中培养基的组成，使得重组腈水合酶基因工程菌实现高密度发酵，不仅提高了产腈水合酶的工程菌的菌浓度(以干重计达到60-80g/L)，还提高了腈水合酶的酶活，获得了腈水合酶酶活最高超过6500U/mL的发酵液。
(2)本发明工艺大大减少了设备投资，使用小吨位发酵罐产酶，即可满足大规模工业化的腈水合酶需求，简化了发酵设备、降低了对公用工程的要求。
(3)本发明工艺节能减排效果明显：对水、电、汽需求量降低，三废产生量大大降低。
(4)本发明工艺降低了腈水合酶的生产成本，提高了生产效率，彻底解决了酰胺生产过程中生物催化剂制备成本高的问题。
附图说明
图1为实施例3发酵过程中腈水合酶诱导表达后的SDS-PAGE电泳图；
M：低分子量标准蛋白质；W：全细胞蛋白；S：可溶蛋白；I：不溶蛋白。
图2为本发明实施例5发酵过程控制参数变化曲线。
图3为本发明实施例5发酵细胞生长和产酶过程曲线。
图4为本发明实施例6发酵过程控制参数变化曲线。
图5为本发明实施例6发酵细胞生长和产酶过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。
实施例1菌种与酶活的测定
(1)菌种构建
本实施例所采用的菌株为：表达博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP。基因工程菌构建具体方法见：申请公布号为CN104498466A，名为“腈水合酶及其应用”的发明专利申请文献。该基因工程菌中腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229，基因工程菌中腈水合酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。基因工程菌的构建方法如下：
采用细菌基因组提取试剂盒提取锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229的基因组。再根据锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列设计引物Ama_Alpha F和Ama_Act R，以锰氧化橙单胞菌ATCC BAA-1229基因组为模板，PCR扩增全长腈水合酶基因。在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点BamHI、HindIII(下划线所示)。
Ama_Alpha F序列：5′-CGGGATCCATGACGGGATCGCACGGCAG-3′；
Ama_Act R序列：5′-CCCAAGCTTTCAGTCGTGTGGGTTCGGCAGG-3；
PCR反应体系和反应条件如下：
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
1)预变性：95℃2min；
2)变性：95℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃15s；共循环30次；
3)延伸：72℃10min；
4)4℃保存2.0h。
用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带，大小为1700bp左右(如图1所示)。用DNA回收纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照该试剂盒说明书。选择pET28a(+)作为表达载体，将载体pET28a(+)和腈水合酶基因经BamHI和HindIII双酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒进行酶切产物的回收。
双酶切体系和反应条件：
采用核酸电泳初步确定两者的浓度，以基因/质粒(mol/mol,2:1)进行混合，加入T4DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pENHase-1229。然后，将重组质粒转化入感受态E.coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓度100μg/ml卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，经37℃静止培养，挑取单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pENHase-1229及重组菌株的正确性，最终获得耐热腈水合酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pENHase-1229。
(2)酶活测定
发酵过程中监测酶活，可将发酵液12000×g离心1min，去上清，再用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬细胞，测定其中的腈水合酶酶活。
在通常情况下，腈水合酶酶活采用标准反应体系进行测定，反应体系为0.5mL，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)含100mM 3-氰基吡啶，添加适量细胞悬液起始反应。25℃振荡反应2min，立即添加0.5mL纯乙腈终止反应，12000×g离心1min，上清液采用高效液相色谱法(HPLC)测定体系中所生成的烟酰胺量。
腈水合酶活力定义：1单位(U)为在25℃条件下1min催化形成1μmol烟酰胺所需要的酶量。
HPLC法采用安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1100，USA)，色谱柱：Varianpursuit C18反向色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相：10mM磷酸钾盐缓冲液(pH 2.8)：乙腈＝92:8(v/v)，流速设定为0.5mL/min，UV检测器，波长230nm。
实施例2基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的10L发酵
(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达博得特氏菌DSM12804(Bordetella petrii DSM 12804)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP菌种在LB-Kan-琼脂固体培养基表面(平皿或茄子瓶)上划线，平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养12小时；
(2)种子培养：将活化后的菌种再接种到40mL的一级种子培养基中，37℃下振荡培养12小时，得到一级种子液；然后，将一级种子液移入400mL二级种子培养基中，35℃下振荡培养4小时，得到二级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/LKH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。
(3)补料分批发酵：
(A)细胞快繁阶段：先配制5L基础培养基置于发酵罐中，初始pH＝6.54，121℃灭菌20min，降温到35℃，pH变为6.23，用氨水将pH调到6.8，将440mL二级种子液接入发酵罐，进行发酵，控制发酵温度35℃，通过通气与搅拌控制溶氧维持在20～30％之间。另配3L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料，补料速率按照如下公式计算：
其中，F(t)为所述补料培养基的流加速率，单位为L/h；X0为每升发酵液中的大肠杆菌基因工程菌的细胞干重，单位g/L；V0为发酵体系的初始体积，单位L；Sf为补料培养基中甘油的浓度，单位为g/L；S0为调整流加速率时发酵液中甘油的浓度，单位g/L；μset为设定的比生长速率，单位h-1，YX/S为甘油对大肠杆菌基因工程菌细胞干重的得率系数，单位为g/g；t为流加补料培养基的时间，单位为h。
经测算，YX/S＝0.4g/g，调节补料速率时，发酵液甘油残留量为0，即S0＝0.0g/L；为简化操作，每一小时改变流加速率，改变后的流加速率根据公式计算得出。
上述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
上述补料培养基为：400g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
(B)产酶阶段：发酵12h后，测得发酵液的OD600＝78.1，将发酵液温度降至18℃，加入诱导剂乳糖8g/L，继续发酵到68h，期间溶氧维持在20～30％；补料速率为0.05L/h。
上述补料培养基为：400g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
发酵结束后，得到OD600＝186，细胞干重为58.1g/L，腈水合酶酶活为1920U/mL的发酵液。
实施例3基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229的15L发酵
(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229菌种在LB-Kan-琼脂固体培养基表面(平皿或茄子瓶)上划线，平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养12小时；
(2)种子培养：将活化后的菌种再接种到50mL的一级种子培养基中，37℃下振荡培养12小时，得到一级种子液；然后，将一级种子液移入500mL二级种子培养基中，35℃下振荡培养4小时，得到二级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/LKH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。
(3)补料分批发酵：
(A)细胞快繁阶段：先配制7L基础培养基置于发酵罐中，初始pH＝6.56，121℃灭菌20min，降温到35℃，pH变为6.21，用氨水将pH调到7.0，将550mL二级种子液接入发酵罐，进行发酵，控制发酵温度37℃，通过通气与搅拌控制溶氧维持在20～30％之间。另配4L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料，补料速率按照实施例2的方法计算和控制。
上述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
上述补料培养基为：500g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
(B)产酶阶段：发酵12h后，测得发酵液的OD600＝76.7，将发酵液温度降至20℃，加入诱导剂乳糖5g/L，继续发酵到58h，期间溶氧维持在20～30％；补料速率为0.07L/h。所述补料培养基为：500g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
发酵结束后，得到OD600＝190，细胞干重为62.5g/L，腈水合酶酶活为5345U/mL发酵液。发酵过程的腈水合酶大部分以可溶蛋白形式过表达，占细胞总蛋白25％以上，蛋白表达SDS-PAGE见图1所示。
实施例4基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229的100L发酵
(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229菌种在LB-Kan-琼脂固体培养基表面(平皿或茄子瓶)上划线，平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养12小时；
(2)种子培养：将活化后的菌种再接种到500mL的一级种子培养基中，37℃下振荡培养12小时，得到一级种子液；10L发酵罐配5L二级培养基，121℃灭菌20min，降温到35℃后接入一级种子液，并加入2.5mL100mg/L的卡那霉素溶液；35℃培养3小时，期间溶氧维持在30％以上，此为二级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/LKH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。
(3)补料分批发酵：
(A)细胞快繁阶段：先配制50L基础培养基置于100L发酵罐中，初始pH＝6.48，121℃灭菌20min，降温到35℃，pH变为6.19，用氨水将pH调到7.0，移入二级种子液，开始发酵，控制发酵温度35℃。另配30L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料，补料速率按照实施例2的方法计算和控制。
上述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
上述补料培养基为：600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
(B)产酶阶段：发酵8h后，测得发酵液的OD600＝75.0，将发酵液温度降至18℃，加入诱导剂乳糖10g/L，继续发酵到58h，期间溶氧维持在20～30％；补料速率为0.45L/h。
上述补料培养基为：600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
发酵结束后，得到OD600＝195，细胞干重为65.9g/L，腈水合酶酶活为5465U/mL发酵液。
实施例5基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229的2000L发酵
(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229菌种在LB-Kan-琼脂固体培养基表面(茄子瓶)上划线，茄子瓶倒置于37℃恒温培养箱，培养16小时；
(2)种子培养：20L发酵罐配15L一级培养基，121℃灭菌20min，降温到37℃后接入茄子瓶种子，并加入7.5mL 100mg/L的卡那霉素溶液，37℃培养18小时。200L发酵罐配150L二级培养基，121℃灭菌20min，降温到37℃后移入一级种子液，并加入75mL 100mg/L的卡那霉素溶液，37℃培养3.5小时，期间溶氧维持在30％以上，此为二级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/LKH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。
(3)补料分批发酵：
(A)细胞快繁阶段：先配制1000L基础培养基置于2000L发酵罐中，初始pH＝6.53，121℃灭菌30min，降温到35℃，pH变为6.39，用氨水将pH调到7.0，移入二级种子液，开始发酵，控制发酵温度35℃，期间溶氧维持在30％以上。另配800L补料培养基，121℃灭菌30min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料，补料速率按照实施例2的方法计算和控制。
上述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
上述补料培养基为：300g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
(B)产酶阶段：发酵11h后，测得发酵液的OD600＝72.1，将发酵液温度降至18℃，加入诱导剂乳糖10g/L，继续发酵到95.8h，期间溶氧维持在20～40％；补料速率为8.3L/h。
上述补料培养基为：300g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
发酵结束后，得到OD600＝190，细胞干重65.7g/L，腈水合酶酶活3893U/mL发酵液。发酵过程的主要控制参数如图2所示，细胞生长和产酶过程见图3。
实施例6基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229的2000L发酵
(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达锰氧化橙单胞菌SI859A(Aurantimonas manganoxydans SI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229菌种在LB-Kan-琼脂固体培养基表面(茄子瓶)上划线，茄子瓶倒置于37℃恒温培养箱，培养16小时；
(2)种子培养：20L发酵罐配15L一级培养基，121℃灭菌20min，降温到37℃后接入茄子瓶种子，并加入7.5mL 100mg/L的卡那霉素溶液，37℃培养18小时。200L发酵罐配150L二级培养基，121℃灭菌20min，降温到37℃后移入一级种子液，并加入75mL 100mg/L的卡那霉素溶液，37℃培养3.5小时，期间溶氧维持在30％以上，此为二级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，5M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/LKH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素浓度为50μg/mL。
(3)补料分批发酵：
(A)细胞快繁阶段：先配制1000L基础培养基置于2000L发酵罐中，初始pH＝6.50，121℃灭菌30min，降温到35℃，pH变为6.37，用氨水将pH调到7.0，移入二级种子液，开始发酵，控制发酵温度35℃，期间溶氧维持在30％以上。另配700L补料培养基，121℃灭菌30min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料，补料速率按照实施例2的方法计算和控制。
上述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
上述补料培养基为：400g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
(B)产酶阶段：发酵10h后测得OD600＝78.6，进行降温诱导，降温到18℃，加入诱导剂乳糖10g/L，继续发酵到91h，期间溶氧维持在40～60％；补料速率为8.5L/h。
上述补料培养基为：400g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
发酵结束后，得到OD600＝233，细胞干重75.9g/L，腈水合酶酶活6520U/mL发酵液。发酵过程的主要控制参数如图4所示，细胞生长和产酶过程见图5。
对比例1
Kim BY等人(Kim BY,Kim JC,Lee HH,et al.(R and D Center,Tong SuhPetrochemical Corp.Ltd.,P.O.Box 50,Nam-Ulsan,South Korea；Department ofBioscience and Biotechnology,Hankuk University of Foreign Studies,Kyunggi-do449-791,South Korea).Fed-batch fermentation for production of nitrilehydratase by Rhodococcus rhodochrous M33.Biotechnology and BioprocessEngineering,2001,6(1):11-17.)通过分批补料发酵，对红球菌(Rhodococcusrhodochrous M33)进行高密度发酵，发酵时长120～140h，OD600＝120左右，细胞干重24～32g/L，腈水合酶酶活1600～2880U/mL，而且该酶活测定是以丙烯腈为底物测定的，一般的腈水合酶以烟腈为底物的酶活要低于以丙烯腈为底物的酶活。
由此可见，本发明方法获得的腈水合酶单位发酵体积的酶活力要远高于对比例1，说明本发明的方法更适用于工业大规模生产腈水合酶。
对比例2
将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229甘油保藏菌种接于5mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10～14h。取2mL培养液转接至100mL含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养至菌体密度(OD600)达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18～37℃下诱导12～18h。
培养结束后，测得OD600＝5.7，细胞干重1.0g/L，腈水合酶酶活130U/mL发酵液。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 博得特氏菌(Bordetella petriiDSM 12804)
<400> 1
atgctcgaag ttctttgcat ggggttgcgc cgggagcgca atctgcaagg tggcattggc 60
cttcagtgtc gatgccgagt tgaagtcgct gtaccccttt tttcaaccac acaggagaac 120
cgcaccatgg ggcaatcaca cacacacgac caccatcacg acgggtacca ggcaccgcct 180
gaagacattg cgctgcgggt gaaggccttg gagtctctgc tcgtcgagaa aggtttggtc 240
gacccggcgg ccatggacgc tgtggtccaa acctatgaac acaaggtggg ccctcggaac 300
ggcgccaagg ttgttgccaa ggcctgggtg gacccggcat acaaggcgcg cttgctggcg 360
aatggcagcg ctggcattgc cgaactgggc ttctctggag tgcagggaga agacacagtc 420
attctggaaa acacccccgc cgtgcacaac gtcttcgtct gcaccctgtg ctcttgctac 480
ccatggccgt cactgggctt gccgccggcc tggtacaagg ccgcacccta ccggtcgcgc 540
atggtgagcg acccgcgtgg ggtcctggcg gagttcggtt tggtgatccc caccaacaag 600
gaaatccgcg tctgggacac cacagccgaa ttgcgctaca tggtgctgcc ggaaaggccc 660
gcaggaaccg aaggctacag cgaagaacaa ctggccgaac tcgtcacccg cgattcgatg 720
atcggcactg gcctgcccac ccaacccaaa ccttcccact aaggagatca tcatgaacgg 780
cattcacgac actggcggag cacatggtta tggcccggtt tacagggagc cgaatgagcc 840
catccttcat ggcgagtggg agggtcgggt cctggcattg tttccggcgc ttttcgcaaa 900
cggcaacttc aacatcgatg agtttcgaca cggcatcgag cgcatgaacc ccatcgacta 960
cctgaaggga acctactacg aacactggat ccattccatc gaaaccttgc tggtcgaaaa 1020
gggtgtgctc acggcaacgg aactcgcgac cggcaaggca tctggcaaga cagcgacacc 1080
ggtgctgacg ccggtcatgg tggacggact gctcagtaac ggagcttctg ccgcccgcaa 1140
ggagggggtg caggcgcggt tcgctgtggg cgacaaggtt cgcgtcctca acaagcaccc 1200
ggtgggccat acccgcatgc cgcgctacac gcggggcaaa gtggggacag tggtcatcga 1260
ccatggtgtg ttcgtgacgc cggacaccgc ggcacacgga aagggcgagc acccccagca 1320
cgtttacacc gtgagtttca cgtcggtcga actgtggggg caagacgctt cctcgccgaa 1380
ggacacgatt cgcgtcgact tgtgggatga ctacctggag ccagcgtga 1429
<210> 2
<211> 1701
<212> DNA
<213> 锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans SI859A)
<400> 2
atgacgggat cgcacggcag ggacggtgat caccacggcc atcaccacga ccgtgatcac 60
gacaaccatc tcgacccgat gaccgcgcgg gtcatggcgc tggagacgat cctcaccgaa 120
aagggcatgg tcgacccgga cgccctcgac gccatcatcg acacctacga gaccaaggtc 180
gggccgcgca acggcgccag cgtcgtcgcc aaggcctgga gcgacccgga ctacgccgac 240
tggctggcgc gcgacgcaac cgccgccatt gcctcgcttg gcttcaccgg ccgccagggc 300
gagcacatgc aggcggtgtt caacaccccg gagcgccaca acctcgtcgt ctgcaccctg 360
tgctcctgct atccgtggtc agtgctcggc ctgccgccgg tctggtacaa gtcgccgccc 420
tatcgctcgc gcgccgtctc cgatccgcgc ggcgtcctgc gcgaattcgg cgtcgcgctg 480
ccggacggcg tctcggtgcg agtctgggac tccaccgccg agctgcgcta cctcgtcgtg 540
cccgagcgcc cggcgggtac cgagggactg tccgaggcgg cgctggcggc gctcgtcacc 600
cgcaagtcca tgatcggtac cgagcgtgac ctgagcccgc atgccgcgcc ggagacggcg 660
gcatgaacgg cccccacgat ctcggcggtc ggcacggctt cgggccgatc gcgccgaagg 720
cagacgagcc gctgttccat gcgccctggg agcgccgcgc cctcgccctg acgctcgcgc 780
cggtgcgatg ggccattggt cgatcgacga aagccgcgcc gcccgtgagg atcgccaccc 840
ggccgactat tacggttcgt cctattacga gatctggacc caagggcctt gagacgctgc 900
tcgtgcgcca cggcctcatc agccatcgcg aattgcgcgc cgggcggccc ctcgacctga 960
ccgtgccgcc gaaccgcatc gtgaaggccg atgccgtcgc gccggccctt gccaagggca 1020
gtccggccaa ccgcgatccc gaaggcagca cgcccgtttt cgcgccgggc gacagggtcc 1080
gcacgctgaa cctgcagccg cgccatcaca tccgcctgcc cgcctatgcc cgcgagaagg 1140
ccggcaccat cgaaaccgtt cagggtttcc atgtcttcgc ggatgccagc gccaagggcg 1200
acgaccatgt cgcgcactgg ctctacacgg tggtcttcga cgcattcacg ctgtggggcg 1260
gcgacgcttc gcccaacgac accgtctcca tcgatgcctg ggagccctat cttgcgcacg 1320
cctgagaccg gcatcgccgc atcgcccggc ctgccacgcg atgcggcggg tgaacccgtc 1380
ttcttcgcgc cctggcaggc caaggccttc gccatgaccg tcgcgctgaa cgagcgcggc 1440
atccttgcct ggaccgactg ggctgccgcg ctcggccgcg cctgcgccag cctgcccgcc 1500
gccggcccct cgcccgaagc aacagcggat gcctatttca ccgcatggct cgtcgcgctc 1560
gaagaaatcc tcacggcacg ggcgctggta agcgccaatg ccgtcgacgc ggcgcaggcc 1620
gtctggcacc gcgccgccga ggccacgccc cacggcacgc cgatccgctt cgaggccggc 1680
ctgccgaacc cacacgactg a 1701
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gacgggatcg cacggcag 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttt cagtcgtgtg ggttcggcag g 31
Claims (10)
1.一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，所述补料分批发酵的过程包括：
(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；
(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；
所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；
所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
2.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，表达所述重组腈水合酶的基因工程菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
3.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述温度为32～35℃，溶氧量为20～30％；步骤(2)中，所述温度为18～20℃，溶氧量为30～50％。
4.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，控制所述基因工程菌的比生长速率为0.2～0.3；步骤(2)中，控制所述基因工程菌的比生长速率0.01～0.04。
5.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5～15％。
6.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量为5～15g/L。
7.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养的时间为8～16h；步骤(2)中，发酵培养的时间为48～96h。
8.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，所述菌种活化的过程，包括：将基因工程菌菌株接种至固体培养基上进行活化培养；
所述活化培养的温度为35～37℃，时间为8～16h；所述固体培养基为：LB-Kan固体培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7.0，20g/L琼脂粉，卡那霉素浓度为50μg/mL。
9.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，所述种子培养的过程，包括：将活化后的菌种接种至一级种子培养基中，进行一级培养；再接种至二级种子培养基中进行二级培养；所述一级培养的温度为35～37℃，时间为8～24h；所述二级培养的温度为35～37℃，时间为3～12h。
10.如权利要求9所述的高密度发酵工艺，其特征在于，所述一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7.0，卡那霉素浓度为50μg/mL；
所述二级种子培养基为12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物，16.43g/L K2HPO4·3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，卡那霉素浓度为50μg/mL。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
| CN110093327A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-06 | 安徽国星生物化学有限公司 | 一种l-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法 |
| CN112080456A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-15 | 江南大学 | 一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法 |
| CN114085802A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-02-25 | 广东金骏康生物技术有限公司 | 重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法 |
| CN114456997A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-05-10 | 哈尔滨国生生物科技股份有限公司 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
| CN114672531A (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-28 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种通过阶段溶氧控制提高大肠杆菌蛋白表达量的方法 |
| CN117511921A (zh) * | 2023-07-21 | 2024-02-06 | 江西海文生物科技有限公司 | 一种腈水合酶工程菌发酵工艺 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409385A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法 |
| CN104498466A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-04-08 | 浙江大学 | 腈水合酶及其应用 |
| CN104561064A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 杭州师范大学 | 一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用 |
| CN104087560B (zh) * | 2013-12-05 | 2016-10-19 | 安徽大学 | 一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法 |
| CN106520744A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-03-22 | 安徽瑞邦生物科技有限公司 | 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法 |
| CN106701725A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-24 | 安徽瑞邦生物科技有限公司 | 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用 |
| CN106755166A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 江南大学 | 高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法 |
-
2017
- 2017-10-16 CN CN201710962094.4A patent/CN107815446B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103409385A (zh) * | 2013-08-07 | 2013-11-27 | 江南大学 | 一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法 |
| CN104087560B (zh) * | 2013-12-05 | 2016-10-19 | 安徽大学 | 一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法 |
| CN104498466A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-04-08 | 浙江大学 | 腈水合酶及其应用 |
| CN104561064A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 杭州师范大学 | 一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用 |
| CN106755166A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 江南大学 | 高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法 |
| CN106520744A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-03-22 | 安徽瑞邦生物科技有限公司 | 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的方法 |
| CN106701725A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-24 | 安徽瑞邦生物科技有限公司 | 一种提高枯草芽孢杆菌腈水合酶活性的发酵培养基及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 吴彬等: "利用指数流加补料高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶重组大肠杆菌", 《微生物学通报》 * |
| 徐红梅等: "腈水合酶/酰胺酶体系制备蛋氨酸羟基类似物", 《精细化工》 * |
| 李民等: "重组大肠杆菌高密度发酵研究进展", 《生物工程进展》 * |
| 马武生等: "产腈水合酶菌Nocardia sp .HD9611 的发酵条件优化的研究", 《工业微生物》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
| CN110093327A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-06 | 安徽国星生物化学有限公司 | 一种l-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法 |
| CN112080456A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-15 | 江南大学 | 一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法 |
| CN114672531A (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-28 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种通过阶段溶氧控制提高大肠杆菌蛋白表达量的方法 |
| CN114085802A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-02-25 | 广东金骏康生物技术有限公司 | 重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法 |
| CN114456997A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-05-10 | 哈尔滨国生生物科技股份有限公司 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
| CN114456997B (zh) * | 2022-03-07 | 2024-05-28 | 哈尔滨国生生物科技股份有限公司 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
| CN117511921A (zh) * | 2023-07-21 | 2024-02-06 | 江西海文生物科技有限公司 | 一种腈水合酶工程菌发酵工艺 |
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|---|---|
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