CN110093327A - 一种l-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种L‑草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到生物发酵罐中；采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5‑7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃，发酵3‑4天，得谷氨酸还原酶和葡萄糖还原酶，本发明不仅缩短了生产工艺的周期，还节约了能耗和原料的使用量，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L‑草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法。
背景技术
酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。酶属生物大分子，分子质量至少在1万以上，大的可达百万。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。
目前，市场上的草铵膦大都是外消旋混合物，如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，能使草铵使用量降低50％，这对于提高原子经济性，降低使用成本，减轻环境压力具有重要意义。目前如制作L-草铵膦的不对称合成法多用于实验室，但不对称合成法工艺步骤多，收率低，所用的不对称合成试剂大多较昂贵，导致成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。而生物酶法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点。
本发明公开了大肠杆菌共产双还原酶的一种高效发酵工艺，该双酶联合转氨酶可催化酮酸生成L草铵膦，而且其发酵菌种具有很好的遗传稳定性，可以基本满足化工生产的需求。对应的酶活也均达到生产需要的标准。与现有的单酶发酵技术相比，本发明在等量碳源和氮源供给的情况下，可获得相同规模的酶量，既节省了生产的周期，又节省了生产的成本。同时，由于工业甘油的价格低廉，利用甘油作为发酵的碳源能进一步降低生产成本，也凸显了双还原酶发酵工艺的发展潜力。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，不仅缩短了化工生产工艺的周期，简化了生产工艺，还节约了能耗和原料的使用量，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L-草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高，并且减少了多种菌株供酶催化反应，实现了一菌多酶催化反应，高效实用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：
1)将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到生物发酵罐中；
2)采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5-7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃，发酵3-4天，得谷氨酸还原酶和葡萄糖还原酶。
进一步的，步骤1)中，富含大肠杆菌的二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的，生物发酵罐为10L全自动不锈钢发酵罐，其径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角。
进一步的，步骤2)中，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体。
进一步的，诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min，诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为400-900r/min，当溶氧低于设定的30％时，转速开始加快，以维持在30％左右。
进一步的，所述补料包括如下质量份数的原料：酵母粉70-80份、蛋白胨20-30份、甘油200-400份。
进一步的，所述补料包括如下质量份数的原料：玉米浆90-110份、蛋白胨20-30份、甘油200-400份。
进一步的，所述补料包括如下质量份数的原料：酵母粉75份、蛋白胨25份、甘油300份。
进一步的，所述补料包括如下质量份数的原料：玉米浆100份、蛋白胨25份、甘油400份。
(三)有益效果
本发明提供了一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，保证了菌种中目标遗传物质的稳定性，而且还克服了遗传信息表达的产物彼此间的干扰抑制作用，与现有的单酶发酵技术相比，本发明在等量碳源和氮源供给的情况下，可获得相同规模的酶量，不仅缩短了生产工艺的周期，同时还减少了碳源、氮源和一些无机盐的消耗，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L-草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高。发酵实践证明，当补料配方为酵母粉75份、蛋白胨25份、甘油300份时，在其他条件相同情况下，能获得较高的酶活和菌的浓度，完全能达到生产工艺的标准。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：
将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到10L生物发酵罐中，该径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角，该二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的。采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵6h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃。诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min；诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为900r/min。根据发酵的实际情况，对补料速度进行调节，发酵的平均补料速度控制在1.4ml/min。配制2L补料的配方：75g/L的酵母粉、25g/L的蛋白胨和400g/L的甘油，正常发酵4天，大肠杆菌的生长达到平稳期，发酵液中菌的浓度达到最大，测得的OD值为208，对应的谷氨酸和葡萄糖还原酶的酶活分别为2820U和1472U。
实施例2：
一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：
将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到10L生物发酵罐中，该径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角，该二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的。采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃。诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min；诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为400r/min。根据发酵的实际情况，对补料速度进行调节，发酵的平均补料速度控制在1.4ml/min。配制2L补料的配方：75g/L的酵母粉、25g/L的蛋白胨和300g/L的甘油，正常发酵4天，大肠杆菌的生长达到平稳期，发酵液中菌的浓度达到最大，测得的OD值为219，对应的谷氨酸和葡萄糖还原酶的酶活分别为2844U和1540U。
实施例3：
一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：
将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到10L生物发酵罐中，该径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体，该二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的。采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃。诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min；诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为600r/min。根据发酵的实际情况，对补料速度进行调节，发酵的平均补料速度控制在1.4ml/min。配制2L补料的配方：75g/L的酵母粉、25g/L的蛋白胨和200g/L的甘油，正常发酵3天，大肠杆菌的生长达到平稳期，发酵液中菌的浓度达到最大，测得的OD值为215，对应的谷氨酸和葡萄糖还原酶的酶活分别为1798U和1531U。
实施例4：
一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，包括以下步骤：
将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到10L生物发酵罐中，该径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角，该二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的。采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵6h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃。诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min；诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为900r/min。根据发酵的实际情况，对补料速度进行调节，发酵的平均补料速度控制在1.4ml/min。配制2L补料的配方：100g/L的玉米浆、25g/L的蛋白胨和400g/L的甘油，正常发酵4天，大肠杆菌的生长达到平稳期，发酵液中菌的浓度达到最大，测得的OD值为1850，对应的谷氨酸和葡萄糖还原酶的酶活分别为1527U和1241U。
综上，本发明实施例具有如下有益效果：相比于传统的单酶发酵工艺，本发明实施例1-4提供的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺不仅缩短了生产工艺的周期，还节约了能耗和原料的使用量，大大减少了生产的成本，对于后续催化合成L-草铵膦减少菌株的使用，催化效率更高，能获得较高的酶活和菌的浓度，完全能达到生产工艺的标准。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将富含大肠杆菌的二级种子液在火焰环境下接入到生物发酵罐中；
2)采用间歇加入的方式向发酵罐中加入补料，控制空气进气流量在3vvm，发酵液的pH值为6.9，罐压为0.05MP，发酵的培养温度为35℃，发酵5-7h后补加补料，当菌的OD长到50以上时，开始降温诱导并加入诱导剂IPTG，发酵的诱导温度为18℃，发酵3-4天，得谷氨酸还原酶和葡萄糖还原酶。
2.如权利要求1所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，步骤1)中，富含大肠杆菌的二级种子液是由一级种子液在摇床37℃下培养5个小时得到的，生物发酵罐为10L全自动不锈钢发酵罐，其径高比为1：3，总容积为10L，装液系数为70％，操作无死角。
3.如权利要求1所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，步骤2)中，发酵用空气经空气过滤器除菌处理后进入发酵罐体。
4.如权利要求1所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，步骤2)中，诱导之前，初始补料速度为1.2ml/min，之后每小时增加0.2ml/min，最高补料速度不超过2.0ml/min，诱导之后，初始补料速度为0.8ml/min，之后每两个小时增加0.1ml/min，最高不超过1.8ml/min，发酵过程始终都在搅拌条件下进行，搅拌速度为400-900r/min。
5.如权利要求1-4任一项所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，所述补料包括如下质量份数的原料：酵母粉70-80份、蛋白胨20-30份、甘油200-400份。
6.如权利要求1-4所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，所述补料包括如下质量份数的原料：玉米浆90-110份、蛋白胨20-30份、甘油200-400份。
7.如权利要求5所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，所述补料包括如下质量份数的原料：酵母粉75份、蛋白胨25份、甘油300份。
8.如权利要求6所述的L-草铵膦产双还原型复合酶的发酵工艺方法，其特征在于，所述补料包括如下质量份数的原料：玉米浆100份、蛋白胨25份、甘油400份。
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