CN101831414A

CN101831414A - 一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺

Info

Publication number: CN101831414A
Application number: CN 201010181328
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 吴丹; 程婧; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2030-05-25
Also published as: CN101831414B

Abstract

本发明公开了一种利用温度两阶段控制策略和恒溶氧补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的发酵生产工艺，属于发酵工程技术领域。本发明采用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以5-10％的接种量接种后进行分批发酵，溶氧上升到80-100％左右，开始流加补料液，菌体进行指数生长，菌体生长阶段控制温度33-37℃，溶氧维持在20-30％；当菌体OD600达到15-30左右，添加0.75-1.5％(质量体积分数)甘氨酸；当菌体OD₆₀₀达到45-60时，将温度降为23-27℃并连续补加0.2-0.4g·l^-1·h^-1乳糖，同时采用梯度递减的方式补加补料液；发酵培养30-35小时左右，胞外α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活达到200-280U/mL。采用此策略进行发酵实现了α-环糊精葡萄糖基转移酶的高效胞外表达，大大提高了生产强度。本发明原料来源广泛、工艺简单易行，适于大规模生产；有效的胞外表达，大大减少了宿主菌杂蛋白的污染，提高蛋白纯化效率。本发明为α-环糊精葡萄糖基转移酶的大规模生产奠定了基础。

Description

一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺

技术领域

一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺，属于发酵工程技术领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶，EC 2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精(CDs)的胞外酶，可以分成α-，β-和γ-三种类型。环糊精具有独特的疏水环状圆桶型的分子结构，可以对各种有机化合物进行包接复合和分子识别，从而改变和保护客体化合物的理化性质。因此环糊精在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。但目前环糊精的生产由于转化率低、提纯制备以及分离困难等原因导致成本太高，它们的许多应用受到了很大的限制。为了有效降低环糊精的生产成本，大幅度提高CGT酶产量起着至关重要的作用。目前，国外对CGT酶的研究较多也比较深入，而我国对此酶的研究尚处于起步阶段。国内的研究集中在CGT酶的生产方面，主要包括筛选和诱变野生菌、产酶发酵条件优化等方面，基因工程菌的研究不多。现在国内能生产CGT酶的企业只有少数几家，产量不高，而且全部为环糊精生产企业，基本上是自给自足。

产CGT酶的微生物种类众多，现在工业上生产环糊精所使用的CGT酶来自芽孢杆菌属，但它们产CGT酶的能力普遍较低。为了克服野生菌株较低CGT酶生产能力，运用基因工程的方法将有关CGT酶基因在大肠杆菌中表达已成为当今研究的热点。本实验室成功构建含有周质分泌型信号肽的表达载体pET20b(+)/cgt并转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，通过在摇瓶发酵条件优化以及在3L发酵罐上发酵条件的优化，成功实现了α-CGT酶的高效胞外表达，为其大规模生产奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胞外生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产工艺，以解决现有发酵工艺中酶活不高，难以实现工业化应用的问题。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

(1)菌株：

大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)为出发菌株(成成，李兆丰，李彬，刘花，陈坚，吴敬，利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶，生物加工过程，2009，7(3)56-63)；

(2)种子培养阶段：

将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度35℃，初始pH值7.10，培养时间10小时；

(3)发酵培养：

批式培养阶段：将种子培养液按5-10％的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速或通入富氧空气使溶氧维持20-30％，控制温度为33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，培养5-6小时；

分批发酵阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h^-1的比生长速率生长，通过控制搅拌转速或通入富氧空气维持溶氧在20-30％，温度维持在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时一次性添加质量分数为0.75-1.5％的甘氨酸；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到45-60时，将温度降为23-27℃，诱导阶段以16-20g.L^-1.h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速，同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1，通过控制搅拌转速或通入富氧空气维持溶氧在20-30％，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，诱导20小时。

所述大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)的构建方法为：将来源于Paenibacillusmacerans JFB05-01(菌种保藏在国家典型微生物保藏中心，保藏号：CCTCC M203062)的α-CGT酶基因(陈坚，吴敬，李兆丰，李彬，成成.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达[P].中国专利，申请号200810024162.3,2008.)插入商业化的质粒pET-20b(+)的信号肽序列下游，构建了表达载体pET-20b(+)/cgt，并将其转化商业化的宿主菌E.coli BL21(DE3)。

所述种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10。

所述发酵培养基的组成为：甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L。

所述微量元素液为：以5M HCl为母液，FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂ 2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L。

所述补料液为：甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。

所述种子培养基还含有100mg/L氨苄青霉素。

所述发酵培养基还含有100mg/L氨苄青霉素。

所述两阶段温度控制工艺，在菌体培养阶将温度控制在33-37℃以利于菌体快速生长繁殖，在诱导培养阶段将温度控制在23-27℃以利于目的产物的分泌。

所述恒溶氧控制工艺，在整个发酵过程中通过控制搅拌转速或通入氧气使溶氧维持在20-30％。

所述pH控制工艺，分别在批式培养阶段、分批发酵阶段、诱导培养阶段将pH控制在6.5-7.5。

所述补料分批发酵工艺，采用指数流加的方式，流加速率F通过方程下式

得到，方程中X和S分别为细胞和底物浓度(g/L)，μ为为比生长速率(h^-1)，V为发酵液体积(L)，S_F为补加底物的浓度(g/L)，Y_X/S为细胞对底物的得率系数(g/g)，(VX)₀为培养体系的初始细胞量(g)，t为流加时间(h)。

所述诱导培养工艺，诱导阶段以16-20g·L^-1·h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速；同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1。

所述发酵液中甘油、乳糖、乙酸、乳酸含量的测定方法采用HPLC：Sugar SH1011，柱温50℃，进样量：5μL，差示折光检测器温度：30℃，流速：0.8mL/min，流动相：0.01N H₂SO₄。

α-环糊精葡萄糖基转移酶α-环化活力的测定：将发酵液于4℃、10000r/min离心20min除菌体，收集上清液。将适当稀释的发酵上清液0.1mL加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.0)配制的3％(w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在20℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。对应α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位(U)定义为在上述条件下每分钟生成1μmol的α-环糊精所需的酶量。

本发明采用将两阶段温度控制工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵控制工艺、诱导控制工艺相结合的生产工艺，实现了重组大肠杆菌胞外高效表达α-环糊精葡萄糖基转移酶。该工艺简单易行，适于大规模生产，有效的胞外表达，大大减少了宿主菌杂蛋白的污染，提高蛋白纯化效率。

具体实施方式

实施例1：

E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)的构建

将来源于Paenibacillus macerans JFB05-01(菌种保臧在国家典型微生物保藏中心，保藏号：CCTCC M203062)的α-CGT酶基因(陈坚，吴敬，李兆丰，李彬，成成.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达[P].中国专利，申请号200810024162.3,2008.)插入商业化的质粒pET-20b(+)的信号肽序列下游，构建了表达载体pET-20b(+)/cgt，并将其转化商业化的宿主菌E.coli BL21(DE3)。

实施例2

1、菌株：本实验室自行构建大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)。

2、种子培养：将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，pH 7.10)，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度35℃，初始pH值7.10，培养时间10小时。

3、发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子液(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10)以5％接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L，氨苄青霉素100mg/L)，通过调节转速或通入富氧空气使溶氧维持20％，控制温度为33℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5，培养时间约5个小时；

补料发酵阶段：批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌体以0.2h^-1的比生长速率进行生长，控制温度33℃，调节转速或通富氧空气维持溶氧在20％，当菌体OD₆₀₀达到15，采用一次性添加的方式，加入0.75％甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到45时，将温度降为23℃，调节转速或通富氧空气维持溶氧在20％，以0.3g·L^-1·h^-1的速率流加乳糖，同时以16g·L^-1·h^-1的速度流加补料液，每5h降低10％的补料流速，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5，诱导发酵20小时；

微量元素液组成为，以5M HCl为母液，FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂ 2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L。

发酵培养结束后，最终α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活为200U/mL。

实施例3

3、发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子液(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10)以8％接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L，氨苄青霉素100mg/L)，通过调节转速或通入富氧空气，使溶氧维持25％，控制温度为35℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0，培养时间6个小时；

补料发酵阶段：批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌体以0.2h^-1的比生长速率进行生长，控制温度35℃，通过调节转速或通入富氧空气使溶氧维持在25％，当菌体OD₆₀₀达到20，采用一次性添加的方式，加入1％甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到50时，将温度降为25℃，通过调节转速或通入富氧空气使溶氧维持在25％，以0.2g·L^-1·h^-1的速率流加乳糖，同时以18g·L^-1·h^-1的速度流加补料液，每5h降低10％的补料流速，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.0，诱导发酵20小时；

发酵培养结束后，最终α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活为275U/mL。

实施例4

3、发酵产酶：

分批发酵阶段：将种子液(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，pH 7.10)以10％接种量接入发酵培养基(甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/l，氨苄青霉素100mg/L)，通过调节搅拌转速或通入富氧空气，使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.5，培养时间约6个小时；

补料发酵阶段：批式培养结束后，以指数流加的方式补加以甘油为碳源的补料液(甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O 20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌体以0.2h^-1的比生长速率进行生长，控制温度37℃，通过调节搅拌转速或通入富氧空气使溶氧维持在30％，当菌体OD₆₀₀达到30，采用一次性添加的方式，加入1.5％甘氨酸(质量体积分数)，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.5；

诱导培养阶段：当菌体OD₆₀₀达到60时，将温度降为27℃，通过调节搅拌转速或通入富氧空气使溶氧维持在30％，以0.5g·L^-1·h^-1的速率流加乳糖，同时以20g·L^-1·h^-1的速度流加补料液，每5h降低10％的补料流速，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 7.5，诱导发酵20小时；

发酵培养结束后，最终α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活为220U/mL。

Claims

1.一种生物法生产重组大肠杆菌外源蛋白的生产工艺，其特征在于发酵过程采用将两阶段温度控制工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵工艺、诱导控制工艺相结合的生产工艺。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于以含有重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的大肠杆菌为出发菌株，其生产工艺如下：

(1)分批发酵阶段：通过调节搅拌转速或者通入富氧空气的方式将溶氧维持在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，培养5-6小时；

(2)补料培养阶段：分批发酵阶段结束后待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料液控制菌体以0.2h^-1的比生长速率生长，通过提高搅拌转速或者通入富氧空气维持溶氧在20-30％，温度控制在33-37℃，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，当菌体OD₆₀₀达到15-30时一次性添加质量分数为0.75-1.5％的甘氨酸；

(3)诱导阶段：当菌体OD₆₀₀达到45-60时，将温度降为23-27℃，采用梯度递减的方式流加乳糖，流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1，通过提高搅拌转速或者通入氧气维持溶氧在20-30％，流加质量浓度为25％的氨水控制pH 6.5-7.5，诱导20小时。

3.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于补料培养阶段指数流加速率F由

4.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于诱导阶段以16-20g·L^-1·h^-1为起始速率流加补料液，每3-5h降低10-20％的补料液流速；同时补加乳糖，乳糖流速控制在0.2-0.4g·L^-1·h^-1。

5.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于所述补料液为：甘油500g/L，MgSO₄·7H₂O20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L。

6.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于所述发酵培养基的组成为：甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 13.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 4g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO₄ 0.68g/L，微量元素液10mL/L。

7.根据权利要求6所述的生产工艺，其特征在于所述微量元素液为：以5M HCl为母液，FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L，CuSO₄·5H₂O 1.0g/L，MnSO₄·4H₂O 0.5g/L，Na₂B₄O₇·10H₂O，0.23g/L，CaCl₂ 2.0g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L。

8.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于种子培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCL10g/L，pH7.10。

9.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于种子培养基中还含有浓度为100mg/L的氨苄青霉素。

10.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于发酵培养基中还含有浓度为100mg/L的氨苄青霉素。