CN105861380A - 一株大肠埃希氏菌JLTrp及其在发酵生产L-色氨酸中的应用 - Google Patents

一株大肠埃希氏菌JLTrp及其在发酵生产L-色氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株大肠埃希氏菌JLTrp及其在发酵生产L‑色氨酸中的应用；大肠埃希氏菌JLTrp，菌种保藏编号为CGMCC NO.7.217其应用于发酵生产L‑色氨酸，包括以下步骤：将成熟菌种接种至发酵罐内，在温度34‑36℃，pH采用补充液氨分段控制，溶氧分段控制，压力0.03‑0.08MPa，风量0.3VVM‑2.0VVM，过程中残糖控制0.01‑0.5%下培养制取L‑色氨酸。本发明的菌株，大大提高了菌种稳定性，减少了条件不足导致的有机酸的生成，使得菌种活力得到提高，并逐步降低培养条件，大大降低了能耗。本发明中大肠埃希氏菌JLTrp可用于发酵生产L‑色氨酸，其产率和转化率均有较大的提高，具有显著进步。

Description

一株大肠埃希氏菌JLTrp及其在发酵生产L-色氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及工业微生物育种技术领域，具体涉及及其在发酵生产L-色氨酸中的应用。
背景技术
L- 色氨酸是一种重要的营养剂，广泛应用于氨基酸输液、营养补充剂、食品和饲料添加剂方面， 是继蛋氨酸、 赖氨酸、苏氨酸之后的一种重要的饲料添加剂。近年来，随着国内外饲料工业和医药工业的不断发展，L- 色氨酸成为一种需求较大的产品。在这种情况下，国内外大量企业致力于L-色氨酸的研发，发酵水平不断提高。但是由于菌种对原料、通风量及工艺要求较高，在生产过程中由于菌种遗传性不稳定，致使产酸不稳定，水平仅为2.0-2.5%，转化率偏低仅为12-15%，同时原料及能耗较大，导致生产成本偏高，面对市场盈利空间小。本公司现有用于生产L- 色氨酸的菌种存在遗传不稳定问题，因抗生素引起大肠杆菌外膜非特异性孔道蛋白OprF缺陷，导致合成外膜亲水性的非特异性孔道蛋白的三聚体结构发生改变，因而使细胞膜具有更好的选择透过性，避免发酵过程因条件异常产生的有机酸对细胞内基质的破坏，影响菌体活力，同时因对工艺条件要求较高，致使菌种在传代培养或发酵条件受限时，菌种发生变异，不仅影响产量而且代谢途径发生改变，产生并非我们所期望的代谢产物，导致糖酸转化率偏低，能耗增加。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一株大肠埃希氏菌JLTrp及其及其在发酵生产L-色氨酸中的应用。
本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是：大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2016年5月8日，保藏编号为CGMCCNo. 7.217。
一株大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO.7.217，保藏日期为2016年5月8日。
所述大肠埃希氏菌JLTrp可应用在发酵生产L-色氨酸中。
所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，包括以下步骤：
步骤一、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度34-36℃，pH6.8-7.2，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
步骤二、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤一得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度34-36℃，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%；
所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、 FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B10.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水；
所述液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
所述空罐灭菌的压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述实罐灭菌的灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述步骤一中的接种方法为压差法。
有益效果
1、针对现有技术中的不足，在申请人与天津科技大学、中国氨基酸技术服务中心的共同努力下，将大肠杆菌Escherichia coli K-12 W3110变种 经过诱变筛选等复杂工艺，最终得到本申请中已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7.217的大肠埃希氏菌JLTrp；该菌株具有独特的生理和生化特性，该特性在中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌JLTrp的检测报告中存有体现，检测报告号：NO.(2015）。本领域技术人员利用其生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和利用；且该菌株对30种抗生素的敏感性，对测试的21种抗生素表现为敏感或中度敏感，具体可参见表1，利用该菌株对30种抗生素的敏感性，其在科研领域和工业生产中也具有较好的应用前景。
2、本发明中的菌株大肠埃希氏菌JLTrp，菌种稳定性大大提高；且该采用该菌株进行发酵，大大减少了条件不足导致的有机酸的生成，活力也大大提高；；将该菌株应用于工业大规模生产L-色氨酸中，在本申请中工艺和培养等条件的相互协调作用下，其产率和转化率均有较大的提高，在技术上取得了突破性的进展，具有显著进步；即 L-色氨酸产率由20-25g/L提高到45-50g/L，转化率由12-15%提高到20-25%；且采用本发明菌株进行生产L-色氨酸培养条件逐步降低，大大降低了能耗，大大节省了原料，取得了工业上进步，具有较好的工业应用前景。
生物材料的保藏
大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2016年5月8日，保藏单位及其简称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 7.217。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
一株大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO.7.217，保藏日期为2016年5月8日。
所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，包括以下步骤：
步骤一、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度34℃，pH6.8，溶氧＞25%，压力0.03MPa，风量0.3VVM；
步骤二、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤一得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度34-36℃，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.0，18h-放罐6.4，溶氧分段控制，0-18h10%，18h-放罐15%，压力0.03MPa，风量0.3VVM，过程中残糖控制0.01%；
所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B10.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水；
所述液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
通过该种方式培养，发酵周期为30h，产L-色氨酸率5.0%，转化率22%。（具体计算方法为；产酸率=发酵液中总酸量/发酵液体积；转化率=（发酵液体积L*产酸量g/L）/发酵总耗糖量g）。
实施例2
所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，包括以下步骤：
步骤一、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度35℃，pH7.0，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量1.5VVM；
步骤二、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤一得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度35℃，pH采用补充液氨分段控制，0-18h7.1，18h-放罐6.5，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐30%，压力0.06MPa，风量01.8VVM，过程中残糖控制0.4%；
所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、 FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B10.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水；
所述液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
所述空罐灭菌的压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述实罐灭菌的灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述步骤一中的接种方法为压差法。
通过该种方式培养，发酵周期为31.5h，产L-色氨酸率4.59%，转化率25%。（具体计算方法为；产酸率=发酵液中总酸量/发酵液体积；转化率=（发酵液体积L*产酸量g/L）/发酵总耗糖量g）。
实施例3
所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，包括以下步骤：
步骤一、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度36℃，pH7.2，溶氧38%，压力0.08MPa，风量2.0VVM；
步骤二、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤一得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度36℃，pH值采用补充液氨分段控制，0-18h7.2，18h-放罐6.8，溶氧分段控制，0-18h25%，18h-放罐40%，压力0.08MPa，风量2.0VVM，过程中残糖控制0.5%；
所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖6.0%、酵母粉0.3%、(NH4)2HPO4 0.8%、KCl 0.3%、MgSO4 0.45%、(NH4)2SO4 0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、FeSO40.00042%、MnSO4 0.00036%、维生素B1 0.00039%和生物素0.00012%，其余为水；
所述液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
所述空罐灭菌的压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述实罐灭菌的灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
所述步骤一中的接种方法为压差法。
通过该种方式培养，发酵周期为35h，产L-色氨酸率4.85%，转化率23.5%。（具体计算方法为；产酸率=发酵液中总酸量/发酵液体积；转化率=（发酵液体积L*产酸量g/L）/发酵总耗糖量g）。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
本发明中大肠埃希氏菌JLTrp的筛选和纯化方法如下：
菌悬液的制备：菌体培养，取斜面菌种一环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，36℃振荡培养（120rpm）16-18h取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，36℃振荡培养（120rpm）6-8h细胞菌悬液的制备，取10ml培养液，3500r/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。
所述大肠杆菌出发菌株为氨基酸技术服务中心受让的大肠杆菌，名称为：Escherichia coli K-12 W3110变种。
2、紫外诱变：取10ml菌液于Ф90mm的培养皿中（带有磁棒），将培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌器上；开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖分别照射30s。
3、紫外诱变处理液在含有β-内酰胺类抗生素平板上的选择性生长。β-内酰胺类抗生素优选青霉素、苯唑西林、万古霉素。抗生素浓度为100μg/ml。
选择生长良好的菌种进行培养，制备菌悬液进行硫酸二乙酯（DES）化学诱变。
4、硫酸二乙酯（DES）化学诱变：配制硫酸二乙酯溶液，浓度为处理浓度的2倍与等体积的菌悬液混合诱变结束时加入，过滤灭菌后的硫代硫酸钠中止反应。
5、经硫酸二乙酯（DES）化学诱变后的处理液在含有大环内酯类抗生素平板上的选择性生长。大环内酯类抗生素优选罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平。抗生素浓度为100μg/ml。选择生长良好的菌种进行培养。
6、抗生素抗性的鉴定
将待测菌种斜面一环接于5ml生理盐水中，充分混匀， 3500r/min离心10min，收集菌体，将菌体充分悬浮于5ml生理盐水中；
取1ml菌悬液于平皿中，倾入约15ml熔化并冷却至45-50℃的基本培养基，摇匀，待凝固后即为待测平板；
将待测平板底背面划分为七个区域，在培养基表面分别贴上蘸有青霉素、苯唑西林、万古霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平的滤纸片，观察滤纸片周围菌落的生长情况；
36℃培养24h后显示，除罗红霉素周围无菌落生长外，其他集中均有菌落生长，表明该菌种对青霉素、苯唑西林、万古霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平均有耐药性；
对该菌种进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌JLTrp，保藏于中国科学院微生物研究所。中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌JLTrp进行了形态、生理形态、16RS基因，以及Antibiotics sensitivity检测，检测报告号：NO.(2015）IMCAS 449；结果显示：
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）JLTrp完整的16srDNA序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）进行NCBI blast分析，比对结果与大肠埃希氏菌有100%的相似性。序列比对的结果结合形态和生理生化特征，表明属于菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。
大肠埃希氏菌JLTrp的抗生素抗性检测及检测结果：
本发明所筛选出的大肠埃希氏菌JLTrp，经K-B法实验检测对30种抗生素的敏感性，其中对测试的21种抗生素表现为敏感或中度敏感，具体内容参见表1；
表1：
相关对比实验：
采用本发明中的大肠埃希氏菌JLTrp和原菌株（即诱变前的大肠杆菌Escherichiacoli K-12 W3110 变种），结合本发明中的相关工艺分别进行发酵生产，并计算产酸率和糖转发率；其具体计算方法为；产酸率=发酵液中总酸量/发酵液体积；糖酸转化率=（发酵液体积L*产酸量g/L）/发酵总耗糖量g。结果如表2所示：
表2：
表2结果显示，本发明中的菌株大肠埃希氏菌JLTrp和普通菌株相比较其产酸率和糖酸转化率均有大幅度的提高，具有显著的进步，更适合于工艺生产。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 一株大肠埃希氏菌JLTrp及其在发酵生产L- 色氨酸中的应用
<130> 1
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
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atctgactta acaaaccgcc tgcgtgcgct ttacgcccag taattccgat taacgcttgc 900
accctccgta ttaccgcggc tgctggcacg gagttagccg gtgcttcttc tgcgggtaac 960
gtcaatgagc aaaggtatta actttactcc cttcctcccc gctgaaagta ctttacaacc 1020
cgaaggcctt cttcatacac gcgggcatgg gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat 1080
attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc tcagttccag tgtggctggt 1140
catcctctca gaccagctag ggatcgtcgc ctaggtgagc cgttacccca cctactagct 1200
aatcccatct gggcacatcc gatggcaaga ggcccgaagg tccccctctt tggtcttgcg 1260
acgttatgcg gtattagcta ccgtttccag tagttatccc cctccatcag gcagtttccc 1320
agacattact cacccgtccg ccactcgtca gcaaagaagc aagcttgctt gcgc 1374

Claims (6)

1.一株大肠埃希氏菌JLTrp，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为CGMCC NO.7.217，保藏日期为2016年5月8日。
2.如权利要求1所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、培养成熟的菌种：先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条件下进行培养后得到成熟菌种：培养温度34-36℃，pH6.8-7.2，溶氧＞25%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM；
步骤二、发酵罐培养：先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行实罐灭菌；实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤一得到的成熟菌种接种至发酵罐内，在以下条件下进行培养以制取L-色氨酸：培养温度34-36℃，pH值采用补充液氨分段控制，0-18h7.0-7.2，18h-放罐6.4-6.8，溶氧分段控制，0-18h10-25%，18h-放罐15-40%，压力0.03-0.08MPa，风量0.3VVM-2.0VVM，过程中残糖控制0.01-0.5%；
所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.4-6.0%、酵母粉0.05-0.3%、(NH4)2HPO4 0.1-0.8%、KCl 0.05-0.3%、MgSO4 0.08-0.45%、(NH4)2SO4 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、FeSO4 0.00014-0.00042%、MnSO4 0.00006-0.00036%、维生素B10.000065-0.00039%和生物素0.00001-0.00012%，其余为水；
所述液体种子培养基各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、(NH4)2HPO4 0.5%、KCl 0.08%、MgSO4 0.16%、(NH4)2SO4 0.12%、柠檬酸0.16%、FeSO4 0.00028%、MnSO4 0.00012%、维生素B1 0.00013%、生物素0.00003%，其余为水。
4.如权利要求3所述所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，其特征在于：所述空罐灭菌的压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
5.如权利要求3所述所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，其特征在于：所述实罐灭菌的灭菌压力为0.12MPa，温度121℃，时间为15min。
6.如权利要求3所述所述大肠埃希氏菌JLTrp在发酵生产L-色氨酸中的应用，其特征在于：所述步骤一中的接种方法为压差法。
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