CN101323868A - 生物发酵法工业化生产l-色氨酸的方法 - Google Patents

生物发酵法工业化生产l-色氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物发酵法工业化生产L－色氨酸的方法，该方法依次包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和精制。本发明选用微生物发酵法工业化生产L－色氨酸，有利于L－色氨酸的产率、收率和品质。

Description

生物发酵法工业化生产L-色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵法，具体涉及生物发酵法工业化生产L-色氨酸的方法。
背景技术
目前，生物发酵法生产L-色氨酸的研究基于实验室阶段，实验室阶段的技术参数尚不能应用于工业化生产，尤其是菌种的固体培养基及培养方法、发酵液的提取方法、浓缩液的精制方法将影响L-色氨酸的品质、收率和产率。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种生物发酵法工业化生产L-色氨酸的方法，采用该方法应用于工业化生产L-色氨酸，有利于提高L-色氨酸的产率、收率和品质。
本发明的技术解决方案是该发酵法依次包括以下步骤：菌种固体菌种培养、发酵培养、发酵液提取和精制。
其中，菌种固体培养：首先，菌种培养基用2mol/l的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，冷却至50-60℃，倾斜45°摊平，待凝固放置恒温箱培养；然后，用接种环划一环菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培养箱中培养24小时，长好后直接上罐或放置2-5℃水箱中备用。
其中，菌种在固体培养基中培养，菌种来源浙江大学，菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种；菌种固体培养基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂组成，最终浓度为20mg/l，培养基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，其中浓度为20g/l的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50％的乙醇溶液中制得。
其中，发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后，成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发酵代谢产生的L-色氨酸；其中，2.4T液体种子培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T发酵培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖330kg；其中，成熟种子的培养方法包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.2Mpa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热到121℃，0.1Mpa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度35-36℃，pH6.8-7.0，压力0.1Mpa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈圈住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，慢慢旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，移开棉花圈并熄灭，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05-0.1Mpa，接种量10％，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风量0.6-1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速400-700rpm、溶氧20％以上、培养时间12-18小时、最终OD660nm：15-20、最终葡萄糖含量小于10g/l；其中，发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.17Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95-105℃，直接进蒸流加热到121℃，压力0.1Mpa，保温10分钟，冷却降温至36℃，氨调pH6.5等接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度36℃，罐压0.03Mpa，风量0.6-1.1m3/h，pH6.5，搅拌转速400-700rpm，发酵结束时色氨酸生成浓度在20-60g/l、糖浓度1.2g/l；⑤发酵结束后，放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾，发酵液加热至80℃，立即降温至37℃，用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中，发酵液提取依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温55±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35-50℃，微滤压力0.30Mpa，微滤流速80-100l/m2·l，膜孔径0.05-1.0μm，膜厚度10-150μm；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度55-60℃，超滤压力1.0Mpa，超滤流速30-35l/m2.h，膜孔径0.015-0.1μm，膜厚度150-250μm，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度55-60℃，纳滤压力0.5-3.5Mpa，纳滤流速2.5-4.0l/m2.h，膜孔径1-2nm，膜厚度150μm，非对称性膜。
其中，精制依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至5-15℃，5±3℃静止结晶4小时；②离心甩干，冰水淋洗，60℃下进热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明矾；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至5-15℃，按体积比15％加入浓度80％工业醋酸，搅拌有大量晶体折出后停，保温5±3℃结晶4小时，结晶结束时母液浓度2-3g/l；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥4-6小时得精品。
本发明选用生物发酵法经菌种培养、发酵培养、发酵液提取和精制工艺化生产L-色氨酸，有利于L-色氨酸的产率、收率和品质。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
例1：菌种固体培养：首先，菌种培养基用2mol/l的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，冷却至50℃，倾斜45°摊平，待凝固放置恒温箱培养；然后，用接种环划一环菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培养箱中培养24小时，长好后直接上罐或放置2℃水箱中备用。
其中，菌种在固体培养基中培养，菌种来源浙江大学，菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种；菌种固体培养基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂组成，最终浓度为20mg/l，培养基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，其中浓度为20g/l的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50％的乙醇溶液中制得。
其中，发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后，成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发酵代谢产生的L-色氨酸；其中，2.4T液体种子培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T发酵培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖330kg；其中，成熟种子的培养方法包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15Mpa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热到121℃，0.1Mpa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度35℃，pH6.8，压力0.1Mpa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈圈住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，慢慢旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，移开棉花圈并熄灭，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05Mpa，接种量10％，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风量0.6m3/h、pH6.5、搅拌转速400rpm、溶氧20％以上、培养时间12小时，最终OD660nm：15、最终葡萄糖含量小于10g/l；其中，发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95℃，直接进蒸流加热到121℃，压力0.1Mpa，保温10分钟，冷却降温至36℃，氨调pH6.5等接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度36℃，罐压0.03Mpa，风量0.6m3/h，pH6.5，搅拌转速400rpm，发酵结束时色氨酸生成浓度在20g/l、糖浓度1.2g/l；⑤发酵结束后，放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾，发酵液加热至80℃，立即降温至37℃，用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中，发酵液提取依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温55±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35℃，微滤压力0.30Mpa，微滤流速80l/m2.l，膜孔径0.05μm，膜厚度10μm；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度55℃，超滤压力1.0Mpa，超滤流速30l/m2.h，膜孔径0.015μm，膜厚度150μm，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度55℃，纳滤压力0.5Mpa，纳滤流速2.5l/m2.h，膜孔径1nm，膜厚度150μm，非对称性膜。
其中，精制依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至5℃，5±3℃静止结晶4小时；②离心甩干，冰水淋洗，60℃下进热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明矾；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至5℃，按体积比15％加入浓度80％工业醋酸，搅拌有大量晶体折出后停，保温5±3℃结晶4小时，结晶结束时母液浓度2g/l；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥4小时得精品。
例2：其中，菌种固体培养：首先，菌种培养基用2mol/l的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，冷却至55℃，倾斜45°摊平，待凝固放置恒温箱培养；然后，用接种环划一环菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培养箱中培养24小时，长好后直接上罐或放置4℃水箱中备用。
其中，菌种在固体培养基中培养，菌种来源浙江大学，菌株是一种Escherichia coli K-12W3110变种；菌种固体培养基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂组成，最终浓度为20mg/l，培养基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，其中浓度为20g/l的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50％的乙醇溶液中制得。
其中，发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后，成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发酵代谢产生的L-色氨酸；其中，2.4T液体种子培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T发酵培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖330kg；其中，成熟种子的培养方法包括以下步骤：①空罐灭菌：0.18Mpa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热到121℃，0.1Mpa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度35℃，pH6.9，压力0.1Mpa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈圈住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，慢慢旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，移开棉花圈并熄灭，缓缓打开罐上排气阀，调压0.75Mpa，接种量10％，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风量0.9m3/h、pH6.5、搅拌转速550rpm、溶氧20％以上、培养时间15小时、最终OD660nm：18、最终葡萄糖含量小于10g/l；其中，发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.16Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热泪盈眶到100℃，直接进蒸流加热到121℃，压力0.1Mpa，保温10分钟，冷却降温至36℃，氨调pH6.5等接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度36℃，罐压0.03Mpa，风量0.8m3/h，pH6.5，搅拌转速550rpm，发酵结束时色氨酸生成浓度在40g/l、糖浓度1.2g/l；⑤发酵结束后，放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾，发酵液加热至80℃，立即降温至37℃，用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中，发酵液提取依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温55±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度43℃，微滤压力0.30Mpa，微滤流速90l/m2.l，膜孔径0.75μm，膜厚度80μm；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度58℃，超滤压力1.0Mpa，超滤流速33l/m2.h，膜孔径0.75μm，膜厚度200μm，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度58℃，纳滤压力2.0Mpa，纳滤流速3.3l/m2.h，膜孔径1.5nm，膜厚度150μm，非对称性膜。
其中，精制依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至10℃，5±3℃静止结晶4小时；②离心甩干，冰水淋洗，60℃下进热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明矾；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至10℃，按体积比15％加入浓度80％工业醋酸，搅拌有大量晶体折出后停，保温5±3℃结晶4小时，结晶结束时母液浓度2.5g/l；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥5小时得精品。
例3：其中，菌种固体培养：首先，菌种培养基用2mol/l的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，冷却至60℃，倾斜45°摊平，待凝固放置恒温箱培养；然后，用接种环划一环菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培养箱中培养24小时，长好后直接上罐或放置5℃水箱中备用。
其中，菌种在固体培养基中培养，菌种来源浙江大学，菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种；菌种固体培养基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂组成，最终浓度为20mg/l，培养基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，其中浓度为20g/l的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50％的乙醇溶液中制得。
其中，发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后，成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发酵代谢产生的L-色氨酸；其中，2.4T液体种子培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T发酵培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖330kg；其中，成熟种子的培养方法包括以下步骤：①空罐灭菌：0.2Mpa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热到121℃，0.1Mpa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH0.8-7.0，压力0.1Mpa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈圈住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，慢慢旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，移开棉花圈并熄灭，缓缓打开罐上排气阀，调压0.1Mpa，接种量10％，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风量1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速700rpm、溶氧20％以上、培养时间18小时、最终OD660nm：20、最终葡萄糖含量小于10g/l；其中，发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.17Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热泪盈眶到105℃，直接进蒸流加热到121℃，压力0.1Mpa，保温10分钟，冷却降温至36℃，氨调pH6.5等接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度36℃，罐压0.03Mpa，风量1.1m3/h，pH6.5，搅拌转速700rpm，发酵结束时色氨酸生成浓度在60g/l、糖浓度1.2g/l；⑤发酵结束后，放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾，发酵液加热至80℃，立即降温至37℃，用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中，发酵液提取依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温55±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度50℃，微滤压力0.30Mpa，微滤流速100l/m2.l，膜孔径1.0μm，膜厚度150μm；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度60℃，超滤压力1.0Mpa，超滤流速30-35l/m2.h，膜孔径0.1μm，膜厚度250μm，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度60℃，纳滤压力60℃，纳滤压力3.5Mpa，纳滤流速4.0l/m2.h，膜孔径2nm，膜厚度150μm，非对称性膜。
其中，精制依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至15℃，5±3℃静止结晶4小时；②离心甩干，冰水淋洗，60℃下进热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明矾；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至15℃，按体积比15％加入浓度80％工业醋酸，搅拌有大量晶体折出后停，保温5±3℃结晶4小时，结晶结束时母液浓度3g/l；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥6小时得精品。

Claims (1)

1.生物发酵法工业化生产L-色氨酸的方法，该方法依次包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和精制；其特征在于：菌咱固体培养：首先，菌种培养基用2mol/l的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121℃灭菌15分钟，冷却至50-60℃，倾斜45°摊平，待凝固放置恒温箱培养；然后，用接种环划一环菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37℃±1.0的培养箱中培养24小时，长好后直接上罐或放置2-5℃水箱中备用；
其中，菌种在固体培养基中培养，菌种来源浙江大学，菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种；菌种固体培养基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂组成，最终浓度为20mg/l，培养基中的胰蛋白胨1％、酵母浸出粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，其中浓度为20g/l的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50％的乙醇溶液中制得；
其中，发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后，成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发酵代谢产生的L-色氨酸；其中，2.4T液体种子培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg，MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、TC 6g、糖96kg；其中，22T发酵培养基由水中加入以下组份组成：酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖330kg；其中，成熟种子的培养方法包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.2Mpa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接进蒸汽加热到121℃，0.1Mpa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃，待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度35-36℃，pH0.8-7.0，压力0.1Mpa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈圈住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，慢慢旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，移开棉花圈并熄灭，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05-0.1Mpa，接种量10％，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风量0.6-1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速400-700rpm、溶氧20％以上、培养时间12-18小时、最终OD660nm：15-20、最终葡萄糖含量小于10g/l；其中，发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.17Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热泪盈眶到95-105℃，直接进蒸流加热到121℃，压力0.1Mpa，保温10分钟，冷却降温至36℃，氨调pH6.5等接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度36℃，罐压0.03Mpa，风量0.6-1.1m3/h，pH6.5，搅拌转速400-700rpm，发酵结束时色氨酸生成浓度在20-60g/l、糖浓度1.2g/l；⑤发酵结束后，放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾，发酵液加热至80℃，立即降温至37℃，用压缩空气压至发酵液储存罐；
其中，发酵液提取依次包括以下步骤：首先发酵液微滤，储罐中的发酵液用泵打入加热罐中，加热并保温55±5℃，开启膜过滤器对发酵液进行过滤，微滤温度35-50℃，微滤压力0.30Mpa，微滤流速80-100l/m2.l，膜孔径0.05-1.0μm，膜厚度10-150μm；然后，微滤后的滤液进一步超滤，超滤温度55-60℃，超滤压力1.0Mpa，超滤流速30-35l/m2.h，膜孔径0.015-0.1μm，膜厚度150-250μm，非对称性膜；最后，超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液，纳滤温度55-60℃，纳滤压力0.5-3.5Mpa，纳滤流速2.5-4.0l/m2.h，膜孔径1-2nm，膜厚度150μm，非对称性膜；
其中，精制依次包括粗结晶和精制过程，其中，粗结晶过程为：①将浓缩液打入结晶罐中，迅速搅拌降温至5-15℃，5±3℃静止结晶4小时；②将粗品离心甩干，冰水淋洗，60℃下进热循环干燥箱干燥6小时，控制水份≤5.0％得粗品；其中，精制过程为：①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水中，升温至75℃完全溶解，按粗品重量0.1％加入明矾；②按粗品重量的30％加入303#活性碳，在75℃脱色15分钟，过滤；③脱色液经冷盘管降温至5-15℃，按体积比15％加入浓度80％工业醋酸，搅拌有大量晶体折出后停，保温5±3℃结晶4小时，结晶结束时母液浓度2-3g/l；④将结晶液转入离心机离心，冰水淋洗，湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥4-6小时得精品。
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