CN103642853B - 一种l-苹果酸提取新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域，本发明涉及一种通过酸解、中和、分级膜过滤与离子交换技术在生物发酵液中提取高品质L-苹果酸的工艺。本发明使用磷酸进行酸化，经微滤膜、超滤膜过滤后除去了菌体蛋白、其他大分子杂质以及磷酸钙等固体；使用氢氧化钙和碳酸钙中和发酵液，经磷酸酸化，再经微滤膜、超滤膜过滤，为L-苹果酸在离子交换和冷却蒸发器浓缩结晶创造了决定性条件；通过本发明工艺，一次提取L-苹果酸产品纯度＞99%，总体收率在90%以上，使用的磷酸为中等强度酸，且膜过滤设备自动化程度高、操作稳定、便于产业化推广，具有良好的经济效益、环境效益和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，本发明涉及一种L-苹果酸发酵液下游提取技术的新工艺，具体为一种L-苹果酸提取新工艺。
背景技术
苹果酸，又名2－羟基丁二酸，由于分子中有一个不对称碳原子，有L一苹果酸、D－苹果酸和DL-苹果酸3种异构体。天然存在的苹果酸都是L型的，几乎存在于一切果实中，以仁果类中最多。它可以从山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中提取，也可由延胡索酸经生物发酵制得。它是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。外消旋体可由延胡索酸或马来酸在催化剂作用下于高温高压条件和水蒸气作用制得。
L—苹果酸为天然果汁之重要成份，味道柔和，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂” 。目前在老年及儿童食品中正取代柠檬酸。L—苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种低热量的理想食品添加剂。
L－苹果酸是生物体三羧酸的循环中间体，口感接近天然果汁并具有天然香味，与柠檬酸相比，产生的热量更低，口味更好，因此广泛应用于酒类、饮料、果酱、口香糖等多种食品中，并有逐渐替代柠檬酸的势头。是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。
L－苹果酸中含有天然的润肤成分，能够很容易地溶解粘结在干燥鳞片状的死细胞之间的“胶粘物”，从而可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性，因此在化妆品配方中备受青睐。
L－苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；L－苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外L－苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。
L-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产L-苹果酸，但是传统的发酵法生产L-苹果酸培养时间长、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术L-苹果酸也有了长足的进步，但是L-苹果酸的工业平均转化率为70%-80%，尚有20%-30%富马酸残留，反应液中L-苹果酸的含量较低，仅为100-120g/L，目前国内尚无规模化的L-苹果酸生产方法。本发明提供了一种L-苹果酸发酵液下游提取技术，为L-苹果酸规模化生产提供了一种新的提取工艺，对促进氨基酸行业发展具有非常重要的意义；同样，在L-苹果酸用途广泛和市场紧俏的形势下，该工艺方法表现出巨大的经济效益和发展潜力。
发明内容
本发明提供了一种L-苹果酸提取新工艺，其具体涉及L-苹果酸发酵液下游提取技术；使L-苹果酸在实现规模化生产的同时，确保产品品质和生产与环境的和谐。
本发明提供一种L-苹果酸提取新工艺，是通过以下技术步骤实现的：
1 发酵液的制备：将L-苹果酸产生菌株接种到种子罐培养，然后发酵培养；
2发酵液的酸解和过滤：将制备的L-苹果酸发酵液转移到带有搅拌的储存罐中，在55-75℃下，边搅拌边加入磷酸，调节PH至1.5左右，停止添加，酸解后，静置6h以上；将酸解液经微滤膜、超滤膜过滤除去菌体和磷酸钙，得到L-苹果酸母液；
3苹果酸母液的中和与酸解：在50-80℃下，将得到的L-苹果酸母液先加入石灰乳中和80%-90%的酸，再加入碳酸钙进行中和，调节PH至4.1-4.4，过滤，得到苹果酸钙；加1-3倍体积水将L-苹果酸钙调成浆状，加入磷酸，调节PH至1.5，酸解得到酸解液；过滤，除去磷酸钙，对滤液进行脱色处理，得到L-苹果酸的洗脱液。
4离子交换与低温浓缩结晶：将（3）步骤中获得的L-苹果酸洗脱液，经离子交换树脂后，收取流出液；将流出液经冷却式蒸发器低温浓缩至有白色晶体出现后，将料液迅速转入结晶器中，缓慢降温结晶。
5、结晶后的料液经离心分离、洗涤、烘干后，获得L-苹果酸成品，纯度达99%以上。
L-苹果酸离心分离和洗涤产生的母液和洗涤水，可经过步骤（4）浓缩结晶和步骤（5）进行多次提取，获得不同纯度的产品和末次母液。
所述发酵液制备优选为：将霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均约为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.02g ，MgSO4 0.02g，KH2PO4 0.1g，pH值6.0。然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH2PO4 0.1g/L，K2HPO4 0.1g/L， (NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；
所述微滤膜过滤中使用无机陶瓷材质微滤膜，其截留分子量为5000~200000MW，孔径0.1~100μm，操作温度为25~50℃，工作压力：进压为2~4bar，出压为0~2bar。
所述超滤过滤，选用PAN、PC、PP、PE复合膜中的一种，其截留分子量为1000~5000MW，孔径5~200nm，操作温度为25~45℃，工作压力：进压为7~9bar，出压为1~4bar。
本发明具有以下几个方面的优点：
1、本发明提供了L-苹果酸发酵液，使用磷酸进行酸化，酸化后过滤得到的磷酸钙可被硫酸酸解后，再次使用，还可防止L-苹果酸被硫酸碳化。
2、本发明提供了发酵液经微滤膜、超滤膜过滤后除去了菌体蛋白和其他大分子杂质，再次经少许活性炭脱色后，获得了无色透明的L-苹果酸透析液，避免了过多的杂质在离子交换过程中的负面影响。
2、膜过滤设备自动化程度高、可控性强、操作简便；发酵液膜过滤参数稳定，透析液性能稳定；为高品质L-苹果酸提取创造了基础条件。
3、经过离子交换的料液，使用冷却式蒸发器50~60℃低温短时间浓缩即可达到结晶浓度，有效避免了杂质的再次产生。
4、本发明最终L-苹果酸产品为白色结晶粉末，纯度可达99%以上，比旋光度、透光率、氯化物含量等相关指标符合相关标准要求。
5、本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液按照一定比例混合，二者之间具备一定的协同作用，比常规的米曲霉发酵方法，能够大大提高苹果酸的产量，采用最优比例3∶1混合，其他条件不变的前提下，产量可提高30％左右，针对两种霉菌的种子培养及发酵培养，摸索最佳的培养成分配方，能够获得最佳的生产效率，最终获得 L-苹果酸产量为150.3 g/L，且残糖含量最小为0.7g/L。
具体实施方式
实施例1
1.发酵液酸解：制备 L-苹果酸发酵液150L：将霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae)，黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均约为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为34℃，摇床转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.02g ，MgSO4 0.02g，KH2PO4 0.1g，pH值6.0。然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH2PO4 0.1g/L，K2HPO4 0.1g/L， (NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 2 g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；
所述米曲霉优选为米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584（例如参见CN2011102578402），所述黄曲霉优选为黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 13697（参见参考文献：Organic acids: old metabolites, new themes Israel Goldberg ET AL, Journal of Chemical Technology and Biotechnology）;
在60℃下，边搅拌边加入磷酸，调节PH至1.5左右，然后经微滤膜、超滤膜过滤，微滤膜过滤中使用无机陶瓷材质微滤膜，其截留分子量为5000~200000MW，孔径0.1~100μm，操作温度为25~50℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。超滤过滤，选用PAN复合膜，其截留分子量为1000~5000MW，孔径5~200nm，操作温度为30℃，工作压力：进压为8bar，出压为3bar。
除去发酵液中的菌体蛋白、大分子生物多糖、发酵过程产生的色素、磷酸钙以及其他大分子或固态杂质；获得超滤透析苹果酸母液，用石灰乳和碳酸钙进行中和，调节PH至4.3，过滤，得到苹果酸钙，再用2倍的水将L-苹果酸钙调成浆状，再进行过滤得到L-苹果酸的透析滤液；对滤液进行活性炭脱色处理，得到无色透明的L-苹果酸透析液。
2、离子交换与低温浓缩结晶：将（1）步骤中浓缩的L-苹果酸透析液，经离子交换树脂后，收取流出液；将流出液经蒸发器低温浓缩至有白色晶体出现后，将料液迅速转入结晶器中，缓慢降温结晶；所述离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂，粒径为0.8mm；所述蒸发器，蒸发温度控制55℃，蒸发量1m3/h，蒸发浓缩临界点判断为少许有白色结晶出现后即刻停止蒸发；降温结晶过程温度下降速度0.5℃/min，最终结晶温度8℃，恒温结晶0.5h。
3、结晶后的料液经离心分离、烘干后，获得一次提取L-苹果酸成品19.29Kg；一次提取母液经降膜蒸发器再次浓缩后，离心、洗涤、干燥，获得二次提取成品3.21Kg和末次母液。
上述L-苹果酸产品经检测，一次提提取产品纯度99.5%，二次提取产品纯度98.2%，；折纯后制备L-苹果酸22.5Kg，熔点为90－100℃，比旋光度为－2.19、硫酸盐含量（以SO4计算）小于0.03%，氯化物含量小于0.005%，透光率、重金属含量等相关指标符合相关标准要求。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种L-苹果酸提取新工艺，包括如下步骤：
（1）苹果酸发酵液用磷酸进行酸化，调节pH为1.5，酸化后静置6h，经微滤膜和超滤膜过滤除去杂质得到L-苹果酸母液；所述发酵液150L的制备方法为：霉菌混合菌液按照10％的体积比的接种量接入种子罐中进行培养，温度34℃，转速为180r/min，培养16小时得到液体A，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，NaNO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.02g ，MgSO4 0.02g，KH2PO4 0.1g，pH值6.0；然后按照液体A∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度34℃，培养6d；
所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖80g/L，加玉米浆10g/L，碳酸钙75g/L，KH2PO4 0.1g/L，K2HPO4 0.1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 2g/L，NaCl 0.2g/L，pH值6.0；
所述霉菌混合菌液为：米曲霉(Aspergillus oryzae)和黄曲霉(Aspergillus flavus)两种菌液体积比为3∶1，两种菌液中菌体的浓度均为1×108CFU/mL；所述米曲霉为米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584，所述黄曲霉为黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC13697；
（2）将步骤（1）得到的L-苹果酸母液用碳酸钙中和至pH为4.1-4.4，过滤得到苹果酸钙；加1-3倍体积水将L-苹果酸钙调成浆状，加入磷酸，调节pH至1.5，酸解得到酸解液；过滤，对滤液进行脱色处理，得到L-苹果酸洗脱液；
（3）将步骤（2）获得的L-苹果酸洗脱液，经离子交换树脂后，再经冷却式蒸发器低温浓缩至有白色晶体出现后，将料液迅速转入结晶器中，缓慢降温结晶；所述离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂，粒径为0.3-1.2mm；所述蒸发器的蒸发温度控制50-60℃，蒸发量0.5-1.5m3/h；降温结晶过程温度下降速度0.2-1℃/min，最终结晶温度0-20℃，恒温结晶0.5-1h；
（4）产品分离洗涤干燥。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述步骤（1）微滤膜过滤中使用无机陶瓷材质微滤膜，其截留分子量为5000-200000MW，孔径0.1-100μm，操作温度为25-50℃，工作压力：进压为2-4bar，出压为0-2bar；所述超滤过滤，选用PAN、PC、PP、PE复合膜中的一种，其截留分子量为1000-5000MW，孔径5-200nm，操作温度为25-45℃，工作压力：进压为7-9bar，出压为1-4bar。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于：所述步骤（4）产品分离洗涤干燥产生的母液和洗涤水，再次经过低温浓缩结晶进行多次提取，获得不同纯度的产品和末次母液；末次母液加入菌体蛋白浓缩液，干燥制备含有L-苹果酸的营养蛋白饲料。
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