CN114349624B - 一种从发酵液中分离提取l-苹果酸钙的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离提取L‑苹果酸钙的方法及应用，步骤如下：（1）酸化；（2）絮凝；（3）板框过滤；（4）超滤；（5）脱色；（6）脱色液碱沉；（7）采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L‑苹果酸钙悬浊液脱水，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2‑4倍，即得L‑苹果酸钙。本提取方法不仅分离提纯效果好，便于操作，所得L‑苹果酸钙的收率和纯度较高，本方法中采用盐酸酸化发酵液，较之常用的硫酸酸化效果更好，酸化过滤后，通过氢氧化钠碱沉L‑苹果酸钙的回收率更高，同时也可避免使用硫酸可能造成的碳化现象，避免生成硫酸钙沉淀，减少环境污染。

Description

一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法及应用
技术领域
本发明属于发酵提取技术领域，尤其是一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法及应用。
背景技术
L-苹果酸钙是优良的有机酸钙，分子含钙量为 23.26%，在目前已有的各种有机钙中几乎是最高的。L-苹果酸钙微溶于水，在水中钙含量可达 280 毫克/100 毫升，是牛奶含钙量的两倍多，适合制成各种含钙量高的钙产品，无任何副作用，酸甜可口，适用于各种年龄人群长期补钙的需要。另外，国内外研究表明，L-苹果酸能直接进入线粒体，参与 TCA 循环，使身体在低氧甚至缺氧的条件下，更加有效果产生人体的能源 AIP，故能迅速恢复细胞的能量代谢，有很好的抗疲劳作用。动物实验还证明 L-苹果酸对记忆的获得、巩固和再现均有明显的改善作用，并能促进空间辨别学习能力，钙及 L-苹果酸都是生理碱性的，有护脑益智作用，L-苹果酸还有保护心、肝、肾等重要器官的作用。L-苹果酸钙的生理功能活性，在已有的各种钙源中是独树一帜的。
目前，现有技术中获得L-苹果酸钙的常规方法一般是通过L-苹果酸纯品+碳酸钙的方法制备得到L-苹果酸钙。例如，专利公开号为CN1394844A的专利公开文献公开的一种L-苹果酸钙的制备工艺，将50%-60%（w/w）的L-苹果酸溶液倒入中和反应器中，边搅拌边均匀加入碳酸钙，加料和搅拌时间控制在2-6 分钟，L-苹果酸与碳酸钙的比例为1：0.65-0.75(w/w)，然后以100-200转/分的转速，打料5-10分钟，再将所得物料过14目筛后经真空干燥即得产品。现有技术中在制备过程中，首先必须要获得纯度高的L-苹果酸，然后才能进行下一步操作。目前，L-苹果酸纯品的价格较贵。目前L-苹果酸主要是通过生物法合成得到，要想从发酵液或转化液中分离L-苹果酸，所需步骤十分繁琐（如专利公开文献CN111892498A中报道的），而且成本也较高。另外，化学法合成的苹果酸为DL型的，虽成本低廉，但不易吸收，有毒性，而且DL型的苹果酸不能用于直接生产L-苹果酸钙。另外，在分离沉淀操作步骤时，L-苹果酸与碳酸钙在反应的过程中，会产生CO2，会排放到空气中，不利于环境保护。
因此有必要从微生物发酵液中开发一种高效、绿色的直接提取L-苹果酸钙的分离工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法及应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，步骤如下：
（1）酸化：含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为0.5-2.0，得到酸化发酵液；
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.0-2.0%的聚合氯化铝，絮凝剂聚合氯化铝预先配制成质量浓度8-10%的水溶液，缓慢倒入发酵液中，60-100rpm 搅拌10-30 min，然后搅拌速度调至400-700 rpm，10-60 min；加入与絮凝剂等质量的硅藻土，搅拌均匀；
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径为300-500目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量1000-3000的超滤膜，除去其中的大分子杂质；
（5）加入质量终浓度为3-6 %的活性炭常温脱色5-8 h，过滤得脱色液；
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.0-7.0，使得体系中的L-苹果酸、氯化钙和氢氧化钠反应生成L-苹果酸钙沉淀和氯化钠，L-苹果酸钙沉淀析出；
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2-4倍，即得L-苹果酸钙。
进一步地，所述步骤（1）中含L-苹果酸钙发酵液按照如下方法制备得到：
采用黑曲霉工程菌株S1149进行苹果酸发酵，收集黑曲霉菌株孢子，按照2×106/mL的接种量接种于苹果酸发酵培养基中，恒温摇床中发酵5天，发酵条件为温度28 ℃，转速200 rpm，获得含80 g/L的L-苹果酸钙发酵液；
其中，所述苹果酸发酵培养基为：葡萄糖100 g/L，酵母粉5 g/L，七水硫酸镁0.1g/L，碳酸钙80 g/L。
进一步地，所述步骤（1）和（6）中低速搅拌的转速均为100-300 r/min。
进一步地，所述步骤（7）中L-苹果酸钙悬浊液脱水时的液相留用，并经过如下处理：
浓缩结晶：将所得液相加入真空旋转蒸发器中，在10 Kpa-20 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和，大于380 g/L，进一步冷却得到氯化钠固体；
溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干得到氯化钠。
如上所述的方法在L-苹果酸钙分离提取方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本提取方法不仅分离提纯效果好，便于操作，所得L-苹果酸钙的收率和纯度较高，回收率≧88.5%，产品纯度>99%。而且，本发明所采用的直接从发酵液中分离出L-苹果酸钙的方法较本领域的常规方法L-苹果酸纯品+碳酸钙方法相比，成本低廉，绿色环保，易于操作。
2、本发明方法所需设备是常规设备，设备投资低、运行成本低。
3、本发明方法提取过程中生成的副产物氯化钠可作为产品进行市场销售，间接降低提取成本和环境污染。
4、本发明的发酵工程菌株S1149，所采用的发酵培养基简单，原料成分少，节约生产成本；因为添加培养基中减少了常用的磷酸盐、氯化钙以及铁离子，并且氮源添加量降低，发酵后杂质中离子含量较低，氮源添加降低后，发酵液黏度降低，有利于后续分离，同时也缩短了提取时间。
5、本发明方法在分离沉淀操作步骤时，由于反应过程中添加的是盐酸、氢氧化钠，而不是碳酸钙，因此本发明方法所得的终产物为氯化钠和苹果酸钙，而且氯化钠能够回收利用，苹果酸钙为最终产品，因此，本发明方法中不会产生CO2，有利于保护环境，同时资源也能够回收循环利用，节约资源。
附图说明
图1为本发明中从L-苹果酸钙发酵液中分离提取L-苹果酸钙的一种方法流程图；
图2为本发明中盐酸酸化+氢氧化钠碱沉法成品酸化处理后的液相图；
图3为本发明中盐酸酸化+碳酸钙沉淀法成品酸化处理后的液相图；
图4为本发明中硫酸酸化+碳酸钙沉淀法成品酸化处理后的液相图；
图5为本发明中L-苹果酸钙粉末颜色对比图；其中，左图为硫酸酸化+碳酸钙法所得L-苹果酸钙粉末图，右图为盐酸酸化+氢氧化钠碱沉所得L-苹果酸钙粉末图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，步骤如下：
（1）酸化：含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为0.5-2.0，得到酸化发酵液；
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.0-2.0%的聚合氯化铝，絮凝剂聚合氯化铝预先配制成质量浓度8-10%的水溶液，缓慢倒入发酵液中，60-100rpm 搅拌10-30 min，然后搅拌速度调至400-700 rpm，10-60 min；加入与絮凝剂等质量的硅藻土，搅拌均匀；
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径为300-500目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量1000-3000的超滤膜，除去其中的大分子杂质；
（5）加入质量终浓度为3-6 %的活性炭常温脱色5-8 h，过滤得脱色液；
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.0-7.0，使得体系中的L-苹果酸、氯化钙和氢氧化钠反应生成L-苹果酸钙沉淀和氯化钠，L-苹果酸钙沉淀析出；
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2-4倍，即得L-苹果酸钙。
较优地，所述步骤（1）中含L-苹果酸钙发酵液按照如下方法制备得到：
采用黑曲霉工程菌株S1149进行苹果酸发酵，收集黑曲霉菌株孢子，按照2×106/mL的接种量接种于苹果酸发酵培养基中，恒温摇床中发酵5天，发酵条件为温度28 ℃，转速200 rpm，获得含80 g/L的L-苹果酸钙发酵液；
其中，所述苹果酸发酵培养基为：葡萄糖100 g/L，酵母粉5 g/L，七水硫酸镁0.1g/L，碳酸钙80 g/L。
较优地，所述步骤（1）和（6）中低速搅拌的转速均为100-300 r/min。
较优地，所述步骤（7）中L-苹果酸钙悬浊液脱水时的液相留用，并经过如下处理：
浓缩结晶：将所得液相加入真空旋转蒸发器中，在10 Kpa-20 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和，大于380 g/L，进一步冷却得到氯化钠固体；
溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干得到氯化钠。
如上所述的方法在L-苹果酸钙分离提取方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
本实施例中所采用的L-苹果酸钙发酵液是按照下述方法制备得到的：采用黑曲霉工程菌株S1149（CN111218408A）进行苹果酸发酵，收集黑曲霉菌株孢子，按照2×106/mL的接种量接种于苹果酸发酵培养基中，恒温摇床中发酵5天，获得含80 g/L的L-苹果酸钙发酵液。所述发酵条件为温度28 ℃，转速200 rpm。
所述苹果酸发酵培养基为：葡萄糖100 g/L，酵母粉5 g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，碳酸钙80 g/L。
实施例1
一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，步骤如下：
（1）酸化：在10L含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为2.0，得到酸化发酵液。
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.0%的聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成8%左右的水溶液，缓慢倒入发酵液中，80 rpm搅拌20 min，然后搅拌速度调至600 rpm，10 min；加入与絮凝剂等量的硅藻土，搅拌均匀。
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径500 目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液。
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量3000的超滤膜，除去其中的大分子杂质。
（5）加入3W/V%的活性炭常温脱色6 h，过滤得脱色液。
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.5，使得体系中的L-苹果酸，氯化钙和氢氧化钠，反应生成L-苹果酸钙沉淀析出和氯化钠。
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，液相留用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的4倍，即得L-苹果酸钙。
（8）浓缩结晶：将步骤（7）所得液相加入真空旋转蒸发器中，在20 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和大于380 g/L。进一步冷却得到氯化钠固体。
（9）溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体，用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干等操作步骤得到氯化钠。
最终得到L-苹果酸钙708g，经HPLC纯度测定为99.02%，回收率为88.5%。
实施例2
一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，步骤如下：
（1）酸化：在10L含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为1.0，得到酸化发酵液。
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.5%的聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成10%左右的水溶液，缓慢倒入发酵液中，100 rpm 搅拌20 min，然后搅拌速度调至500 rpm，30 min；加入与絮凝剂等量的硅藻土，搅拌均匀。
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径300 目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液。
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量2000的超滤膜，除去其中的大分子杂质。
（5）加入6W/V%的活性炭常温脱色5 h，过滤得脱色液。
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.0，使得体系中的L-苹果酸，氯化钙和氢氧化钠，反应生成L-苹果酸钙沉淀析出和氯化钠。
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，液相留用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的3倍，即得L-苹果酸钙。
（8）浓缩结晶：将步骤（7）所得液相加入真空旋转蒸发器中，在10 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和大于400 g/L。进一步冷却得到氯化钠固体。
（9）溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体，用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干等操作步骤得到氯化钠。
最终得到L-苹果酸钙720 g，经HPLC纯度测定为99.3%，回收率为90%。
实施例3
一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，步骤如下：
（1）酸化：在10 L含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为0.5，得到酸化发酵液。
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计2.0%的聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成10%左右的水溶液，缓慢倒入发酵液中，100 rpm搅拌20 min，然后搅拌速度调至500 rpm，60 min；加入与絮凝剂等量的硅藻土，搅拌均匀。
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径300目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液。
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量2000的超滤膜，除去其中的大分子杂质。
（5）加入6W/V%的活性炭常温脱色5 h，过滤得脱色液。
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.5，使得体系中的L-苹果酸，氯化钙和氢氧化钠，反应生成L-苹果酸钙沉淀析出和氯化钠。
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，液相留用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2倍，即得L-苹果酸钙。
（8）浓缩结晶：将步骤（7）所得液相加入真空旋转蒸发器中，在10 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和大于400 g/L。进一步冷却得到氯化钠固体。
（9）溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体，用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干等操作步骤得到氯化钠。
最终得到L-苹果酸钙740 g，经HPLC纯度测定为99.3%，回收率为92.5%。
本发明的相关检测如下：
1、本发明与本领域的常规方法L-苹果酸纯品+碳酸钙方法对比
本领域的常规方法即L-苹果酸纯品+碳酸钙方法首先必须获得L-苹果酸，市场销售L-苹果酸纯品的价格为3.5万/吨，本发明原料成本为5880元/吨，分离设备+能耗为7200元/吨，其他成本为5200 元/吨，合计1.828万元/吨。本领域的常规方法即L-苹果酸纯品+碳酸钙方法是直接以L-苹果酸纯品反应，该方法的生产成本明显大大高于本发明方法。
另外，如果从发酵液中先分离出纯L-苹果酸也需要一系列步骤，如申请号为CN201310630634.0的发明专利公开文献公开了一种L-苹果酸的提取工艺，其工艺过程可以简写为：L-苹果酸发酵液—一次酸化—过滤—中和—二次酸化—过滤—离子交换—脱色—蒸发浓缩—结晶—分离湿品—干燥，该提取方法也较为复杂。
目前现有技术中从发酵液中分离出纯L-苹果酸的方法，所需要的提取的时间一般为6天左右的时间，使用分离出的纯L-苹果酸继续生产L-苹果酸钙的话，需要继续添加碳酸钙，然后再进行结晶、干燥等一系列的操作，又需要2天左右的时间，也就是说，先从发酵液中分离出纯L-苹果酸后再生产L-苹果酸钙的话，总计需要8天左右的时间。另外，L-苹果酸与碳酸钙二者同比例添加在反应的过程中，不能完全反应，会剩余一部分碳酸钙（大概碳酸钙总质量10%的碳酸钙），会影响产品的纯度。
而本发明方法的总计时间为4.5~5天，时间远远短于8天左右的时间，极大地缩短了生产时间，提高了生产效率，同时，本发明方法的各物料在反应时反应完全，提高了产品的纯度和回收率。
综上，可以看出，本发明所采用的直接从发酵液中分离出L-苹果酸钙的方法，成本低廉，绿色环保，易于操作。
2、本发明的发酵工程菌株为黑曲霉工程菌株S1149，一方面，其所采用的发酵培养基简单，原料成分少，节约生产成本；另一方面，由于黑曲霉工程菌株S1149的添加培养基中减少了常用的磷酸盐、氯化钙以及铁离子，并且氮源添加量降低，所以发酵后杂质中离子含量较低，氮源添加降低后，发酵液黏度降低，有利于后续分离，同时也缩短了提取时间。
3、对比实施例如表1、表2。关于表1中的具体步骤，除了添加量不同之外均与实施例1的步骤相同，表2中的具体步骤除了添加量不同之外均与实施例3的步骤相同。
表1 本发明方法中使用到的浓盐酸、聚合氯化铝、氢氧化钠的协同效果表
Figure 844016DEST_PATH_IMAGE001
表2 本发明方法中使用到的浓盐酸、聚合氯化铝、氢氧化钠的协同效果表
Figure 994375DEST_PATH_IMAGE002
通过表1和表2可以看出，本发明中当同时使用浓盐酸、聚合氯化铝和氢氧化钠协同分离时，所得苹果酸钙纯度和收率明显要高于单一处理，或者两因素同时处理时的效果。同时也可以看出，盐酸和氢氧化钠两因素协同处理时，效果比单一因素处理明显优越。
为了探索本发明方法中使用的盐酸酸化+氢氧化钠碱沉方法是否为最优的选择，本发明人还进行了一些对比的试验。具体见表3。
表3 本发明方法较其他对比试验的对比效果表
Figure 995829DEST_PATH_IMAGE003
表3中的三种处理方法的操作方法基本相同，均与本发明“盐酸酸化+氢氧化钠碱沉”的步骤相同，不同之处在于，在其他因素不变的情况下，改变酸化方法（即所使用的盐酸替换为硫酸）或沉淀方法（即所使用的氢氧化钠替换为碳酸钙），然后获得相关的检测结果。通过表3可以看出，本发明方法较硫酸酸化+碳酸钙法处理方法、盐酸酸化+碳酸钙处理方法相比，能够取得非常优异的回收率和产品纯度。
另外，硫酸酸化+碳酸钙、盐酸酸化+碳酸钙在在分离沉淀操作步骤时，也会产生CO2，会排放到空气中，不利于环境保护，而本发明方法在分离沉淀操作步骤时，由于反应过程中添加的是盐酸、氢氧化钠，而不是碳酸钙，因此本发明方法所得的终产物为氯化钠和苹果酸钙，而且氯化钠能够回收利用，苹果酸钙为最终产品，因此，本发明方法中不会产生CO2，有利于保护环境，同时资源也能够回收循环利用，节约资源。
本发明方法与硫酸+碳酸钙和盐酸+碳酸钙方法得到的L-苹果酸钙成品酸化处理后的液相比较：
苹果酸的高效液相分析方法:岛津LC-20AD系统，色谱柱类型: AMINEX HPX-87H,300X7.8MM，色谱条件:柱温65 ℃；流动相: 1000ml水加540μl硫酸；流速:0.6ml/min；UV波长为210nm；苹果酸、丁二酸和富马酸的保留时间分别为9.63、11.37和 13.51 min。结果见图2、图3和图4；由图可知，本发明所得L-苹果酸钙中，丁二酸钙的杂质含量更少，效果优于硫酸+碳酸钙法和盐酸+碳酸钙法所得到的。
本发明所得L-苹果酸钙较硫酸酸化后再加入碳酸钙反应得到L-苹果酸钙的回收率和纯度更高（表3和图2、图3和图4），同时也可避免使用硫酸可能造成的碳化现象（如图5所示，由图5可知，硫酸处理后，得到的L-苹果酸钙颜色较深，影响产品质量），同时避免生成硫酸钙，减少环境污染。另外，如果采用盐酸+碳酸钙的方法，发酵液中加入盐酸后，生成L-苹果酸和氯化钙，如果在该体系中加入碳酸钙，一方面导致钙离子过量，影响后续产品纯度（表3和图2、图3和图4），另外一方面该体系中反应不完全，L-苹果酸钙的得率低（见表3）。
其中，图2中的相关数据信息如表4所示：
表4 图2中的相关数据信息
Figure 788205DEST_PATH_IMAGE004
图3中的相关数据信息如表5所示：
表5 图3中的相关数据信息
Figure 925925DEST_PATH_IMAGE005
图4中的相关数据信息如表6所示：
表6 图4中的相关数据信息
Figure 512764DEST_PATH_IMAGE006
注明：含L-苹果酸钙发酵液，会产生发酵产生的杂质丁二酸钙和富马酸钙。钙盐无法用液相检测，必须转换成酸，才可以液相检测。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (5)

1.一种从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）酸化：含L-苹果酸钙发酵液中，缓慢加入质量分数为36%的浓盐酸酸化，低速搅拌，将pH调至为0.5-2.0，得到酸化发酵液；
（2）絮凝：在步骤（1）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.0-2.0%的聚合氯化铝，絮凝剂聚合氯化铝预先配制成质量浓度8-10%的水溶液，缓慢倒入发酵液中，60-100 rpm 搅拌10-30 min，然后搅拌速度调至400-700 rpm，10-60 min；加入与絮凝剂等质量的硅藻土，搅拌均匀；
（3）板框过滤：将步骤（2）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，滤布孔径为300-500目，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；
（4）超滤：将步骤（3）分离的滤液经过平均分子量1000-3000的超滤膜，除去其中的大分子杂质；
（5）加入质量终浓度为3-6 %的活性炭常温脱色5-8 h，过滤得脱色液；
（6）脱色液碱沉
收集脱色液，缓慢加入氢氧化钠，低速搅拌，调节pH值至6.0-7.0，使得体系中的L-苹果酸、氯化钙和氢氧化钠反应生成L-苹果酸钙沉淀和氯化钠，L-苹果酸钙沉淀析出；
（7）固液分离
采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的L-苹果酸钙悬浊液脱水，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的2-4倍，即得L-苹果酸钙。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，其特征在于：所述步骤（1）中含L-苹果酸钙发酵液按照如下方法制备得到：
采用黑曲霉工程菌株S1149进行苹果酸发酵，收集黑曲霉菌株孢子，按照2×106/mL的接种量接种于苹果酸发酵培养基中，恒温摇床中发酵5天，发酵条件为温度28 ℃，转速200rpm，获得含80 g/L的L-苹果酸钙发酵液；
其中，所述苹果酸发酵培养基为：葡萄糖100 g/L，酵母粉5 g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，碳酸钙80 g/L。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，其特征在于：所述步骤（1）和（6）中低速搅拌的转速均为100-300 r/min。
4.根据权利要求1至3任一项所述的从发酵液中分离提取L-苹果酸钙的方法，其特征在于：所述步骤（7）中L-苹果酸钙悬浊液脱水时的液相留用，并经过如下处理：
浓缩结晶：将所得液相加入真空旋转蒸发器中，在10 Kpa-20 Kpa、60 ℃条件下减压蒸发浓缩，使得氯化钠溶液达到过饱和，大于380 g/L，进一步冷却得到氯化钠固体；
溶解脱色、结晶干燥：将氯化钠固体用去离子水溶解后，通过脱色、重结晶、烘干得到氯化钠。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法在L-苹果酸钙分离提取方面中的应用。
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