CN108285913A - 一种制备提取l-谷氨酰胺的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体公开了一种制备提取L‑谷氨酰胺的工艺，包括制备L‑谷氨酰胺料液，进行超滤处理，除去菌体蛋白及其他大分子物质，之后再使超滤液经过活性炭脱色、强酸性阳离子交换、减压浓缩、等电点冷却结晶和离心等过程得到粗品；然后再将粗品回溶并依次经弱酸、弱碱性离子交换树脂除杂、减压浓缩、等电点冷却结晶、离心和烘干，制得精品L‑谷氨酰胺。本发明提高了L‑谷氨酰胺发酵效率，成品纯度和总收率高，且该工艺生产技术简便，并显著降低了交换树脂的用量，同时也大大减少了酸、碱用量，从而减少废水排放，有利于环保。

Description

一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺
技术领域
本发明涉及一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺，属于发酵技术领域。
背景技术
L-谷氨酰胺(L-Gln)是一种条件必需性氨基酸，且其也是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，在体内可以由葡萄糖转变而来，是哺乳动物非必需氨基酸。近年来研究表明L-谷氨酰胺是机体含量最丰富的氨基酸，占全部游离氨基酸60％以上，主要储存在脑、骨骼肌和血液中，具有许多特殊功能。临床上将L-谷氨酰胺应用于治疗酒精中毒、精神萎靡及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外L-谷氨酰胺还具有增进神经机能，改善脑出血后的记忆障碍，提高机体免疫力，促进智力发育不良儿童的智力发展，防止癫痫发作等功能，目前被广泛应用于临床医药、保健食品和动物饲料工业上。
谷氨酰胺的生产主要有三种方法：化学合成法，酶法，发酵法。化学合成法是以谷氨酸为起始物质，经过酸化、氨解、酸解三步反应生成谷氨酰胺。化学合成法收率可达80％，但由于所需原料和试剂价格比较高，因此成本也高，并且原料产品有轻微的特殊的怪味不宜被食品和医药界接受，所以化学法生产谷氨酰胺距离大规模工业化生产还有一定的难度。酶法合成谷氨酰胺在消耗ATP的情况下，由谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和NH4 +向谷氨酰胺的转化。酶法合成谷氨酰胺具有许多优点，如反应步骤简单、副反应少、易于分离、容易实现自动化等，但上述过程中必需的ATP价格昂贵，难以在工业上应用。同酶法、化学合成法相比，发酵法生产谷氨酰胺易于工业化，且其工业化水平越来越高，是最重要的生产方法。如何提高菌株发酵产量是需要解决的技术问题。
发酵法生产L-谷氨酰胺得以工业化生产还依赖于L-谷氨酰胺分离提取技术。目前国内外L-谷氨酰胺的分离提取几乎都采用以离子交换树脂为填料的柱层析法，虽然可以进行大规模制备，但是产品成本高，且交换树脂用量庞大，洗脱和再生酸碱消耗太多，造成严重的环境污染，另外L-谷氨酰胺在强碱和强酸环境容易转化成谷氨酸，导致收率很低。
发明内容
为解决现有提取方法存在的问题，本发明的目的是提供一种发酵效率高，纯度和收率高，生产周期短、成本低、工艺简单、节能降耗减排效果明显的制备提取L-谷氨酰胺的新工艺。本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺，其包括如下步骤：1)发酵，2)超滤，3)活性炭脱色，4)减压浓缩，5)等电冷却结晶，6)粗品回溶，7)离子交换，8)减压浓缩，9)二次结晶，10)干燥。
具体地，所述工艺包括如下步骤：
1)发酵：
(a)将黄色短杆菌种子液按照5-7％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵40-50小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.8，发酵过程中控制葡萄糖浓度不低于15g/L；
(b)利用无机陶瓷膜过滤L-谷氨酰胺发酵液，得到滤液A和湿菌体；往湿菌体中添加2-3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至50-55℃，保温60-90s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养3-5h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液B；
2)超滤：合并滤液A和滤液B，用盐酸调至pH5-6，并通过超滤膜除去可溶性蛋白及色素，得澄清透明超滤液；
3)活性炭脱色：向超滤液中添加2wt％活性炭，以60rpm的速度搅拌脱色2h，待料液无色透明时，抽滤除去料液中的活性炭，制得脱色液；
4)减压浓缩：将脱色液打入浓缩锅，调节pH5-6，浓缩至原体积的1/5-1/6；
5)等电冷却结晶：将步骤4)所得浓缩液放入结晶罐中，调节pH在5.65，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以5-7℃/h的速度缓慢降温，降温到5-10℃时停止降温，育晶12小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺粗晶体；
6)粗品回溶：向L-谷氨酰胺粗晶体中加入去离子水，搅拌溶解完全，用醋酸调pH4，制得粗品溶解液；
7)离子交换：将粗品溶解液依次经过弱酸、弱碱离子交换柱，进一步去除离子以及谷氨酸，收集料液；
8)减压浓缩：调节料液的pH5-6，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/5-1/6；
9)二次结晶：将步骤8)所得浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时以5-7℃/h的速度缓慢降温，降温到5-10℃时停止降温，育晶数小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺湿结晶；
10)干燥：将步骤9)所得湿结晶经过干燥得到L-谷氨酰胺成品。
优选地，
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖15％、玉米浆2％、硫酸铵1％、硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.001％、硫酸亚铁0.001％、VB10.0001％，pH 6.8，以上为质量百分比。
优选地，
所述透析培养基的组分为：磷酸二氢钾1.2％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.02％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8，以上为质量百分比。
优选地，所述无机陶瓷膜的膜孔径50-60nm。
优选地，所述超滤膜的截留分子量为1000-5000Da，超滤温度为25-45℃，超滤进口压为5bar、出口压为1.5bar；
优选地，
所述干燥参数为：真空度为-0.098Mpa，使用温度为80℃的热水循环保持干燥温度≤40℃，干燥10h。
本发明的技术方案具有以下突出的优点及独特性：
本发明针对发酵工序的进行改进，避免谷氨酰胺浓度积累到引起反馈抑制，针对发酵后的废弃菌体进行二次产酸处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力，发酵周期延长；
适当时间和温度的热处理可以提高菌株的产谷氨酰胺的能力以及细胞膜通透性，配合透析培养基，使得谷氨酰胺的产率大大提高；
电气石能够自动释放负离子，负离子具有较强的氧化性，还持续发生直流静电，释放矿物质和微量元素，对菌株繁殖起促进作用；本发明采用透析培养基对菌株进行培养，能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运，同时使得谷氨酰胺积累引起的反馈抑制调节大大降低，产酸效率提高，而且后续的残糖少，不会造成菌株黏着絮凝成团，有利用后续的膜过滤分离；
本发明采用超滤膜过滤技术除去发酵液中的菌体、色素、小分子有机物和高分子物质，使得料液中杂质大大降低，提高了料液的透光率，降低了活性炭的用量；
本发明技术工艺采用双结晶工序可以明显减少L-谷氨酰胺提取过程料液中菌体和杂质的含量，提高L-谷氨酰胺纯度和收率，同时也降低了离子树脂的用量，降低了生产成本；
本发明技术工艺采用弱碱性阴树脂交换量大，可吸附谷氨酸、色素和可溶性蛋白；
本发明技术工艺采用弱酸性阴树脂交换量大，其除去Ca2+、Mg2+时基本不挂L-谷氨酰胺；
本发明技术工艺采用强酸性离子交换与弱酸、弱碱性离子交换相结合的方法除去发酵液中阴阳离子和副产物谷氨酸，既提高了产品质量，又降低了酸碱的用量，减少了对环境的污染。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺，其包括如下步骤：
1)发酵：将黄色短杆菌ATCC14067种子液(1×108cfu/ml)按照5％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵50小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.8，发酵过程中控制葡萄糖浓度不低于15g/L；
其中发酵培养基为(质量百分比)：葡萄糖15％、玉米浆2％、硫酸铵1％、硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.001％、硫酸亚铁0.001％、VB1 0.0001％，pH 6.8；
利用无机陶瓷膜过滤发酵液得到滤液A(L-谷氨酰胺含量为2.91％)和湿菌体分离；往湿菌体中添加2wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至55℃，保温60s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养5h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液B；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.2％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.02％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8；所述无机陶瓷膜的膜孔径50-60nm；
2)超滤：合并滤液A和滤液B，用盐酸调至pH5-6，并以80L/(m2.h)流速通过超滤膜除去可溶性蛋白及色素等杂质，得澄清透明超滤液；其中，超滤膜的截留分子量为3000Da，超滤温度为35℃，超滤进口压为5bar、出口压为1.5bar；
3)活性炭脱色：向超滤液中添加2wt％活性炭，于30℃，以60rpm的速度搅拌脱色2h，待料液无色透明时，抽滤除去料液中的活性炭，制得脱色液，其中脱色液透光98.9％；
4)减压浓缩：将脱色液打入浓缩锅，调节pH5.6，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/5；
5)等电冷却结晶：将浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65左右，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以5℃/h的速度缓慢降温，降温到6℃时停止降温，育晶12小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺粗晶体；
6)粗品回溶：向粗晶体中加入去离子水，搅拌溶解完全，用醋酸调pH4，制得粗品溶解液；
7)弱酸、弱碱性离子交换：将粗品溶解液依次经过弱酸、弱碱离子交换柱，进一步去除离子以及谷氨酸，收集料液；
8)减压浓缩：调节料液的pH5.5，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/5；
9)二次结晶：将浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65左右，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以5℃/h的速度缓慢降温，降温到5℃时停止降温，育晶数小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺湿结晶；
10)干燥：将湿结晶经过双锥干燥器干燥得到L-谷氨酰胺成品，L-谷氨酰胺含量98.1％，总提取收率86.3％，其条件是：真空度-0.098Mpa，使用温度为80℃的热水循环保持干燥温度≤40℃，干燥10h。
实施例2
一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺，其包括如下步骤：
1)发酵：将黄色短杆菌ATCC14067种子液(1×108cfu/ml)按照5-7％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵45小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.8，发酵过程中控制葡萄糖浓度不低于15g/L；
其中发酵培养基为(质量百分比)：葡萄糖15％、玉米浆2％、硫酸铵1％、硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.001％、硫酸亚铁0.001％、VB1 0.0001％，pH 6.8；
利用无机陶瓷膜过滤发酵液得到滤液A(L-谷氨酰胺含量为2.83％)和湿菌体分离；往湿菌体中添加3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至53℃，保温90s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养4h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液B；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾1.2％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.02％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8；所述无机陶瓷膜的膜孔径50-60nm；
2)超滤：合并滤液A和滤液B，用盐酸调至pH5-6，并以80L/(m2.h)流速通过超滤膜除去可溶性蛋白及色素等杂质，得澄清透明超滤液；其中，超滤膜的截留分子量为2000Da，超滤温度为30℃，超滤进口压为5bar、出口压为1.5bar；
3)活性炭脱色：向超滤液中添加2wt％活性炭，于30℃，以60rpm的速度搅拌脱色2h，待料液无色透明时，抽滤除去料液中的活性炭，制得脱色液，其中脱色液透光98.9％；
4)减压浓缩：将脱色液打入浓缩锅，调节pH5.6，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/6；
5)等电冷却结晶：将浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65左右，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以7℃/h的速度缓慢降温，降温到10℃时停止降温，育晶12小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺粗晶体；
6)粗品回溶：向粗晶体中加入去离子水，搅拌溶解完全，用醋酸调pH4，制得粗品溶解液；
7)弱酸、弱碱性离子交换：将粗品溶解液依次经过弱酸、弱碱离子交换柱，进一步去除离子以及谷氨酸，收集料液；
8)减压浓缩：调节料液的pH5，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/5-1/6；
9)二次结晶：将浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65左右，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以7℃/h的速度缓慢降温，降温到5℃时停止降温，育晶数小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺湿结晶；
10)干燥：将湿结晶经过双锥干燥器干燥得到L-谷氨酰胺成品，L-谷氨酰胺含量98.3％，总提取收率85.8％，其条件是：真空度-0.098Mpa，使用温度为80℃的热水循环保持干燥温度≤40℃，干燥10h。
实施例3
以实施例1-2为例，分别检测了滤液B中谷氨酰胺的含量；同时还设置对照组，其中，对照组1为：只进行透析培养处理，不采用电气石粉和热处理，其余同实施例1；对照组2：发酵完成之后，进行电气石粉以及透析培养处理，不采用热处理，其余同实施例1；对照组3：发酵完成之后，进行热处理以及透析培养处理，不采用电气石粉处理，其余同实施例1；检测各组别滤液B中谷氨酰胺的含量，具体结果见表1：
表1
结论：如表1所示，对发酵废弃菌体进行透析培养处理，仍能产生较高浓度的谷氨酰胺，实施例1-2组与对照组1-3均能够产生一定量的谷氨酰胺，但是实施例1-2采用电气石粉处理、热处理以及透析培养处理三者协同方式的产酸效果最好，明显优于采用单一方式处理或者两种方式处理。
以上所述，为本发明的较佳实施案例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (7)

1.一种制备提取L-谷氨酰胺的工艺，其包括如下步骤：1)发酵，2)超滤，3)活性炭脱色，4)减压浓缩，5)等电冷却结晶，6)粗品回溶，7)离子交换，8)减压浓缩，9)二次结晶，10)干燥。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
1)发酵：
(a)将黄色短杆菌种子液按照5-7％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵40-50小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.8，发酵过程中控制葡萄糖浓度不低于15g/L；
(b)利用无机陶瓷膜过滤L-谷氨酰胺发酵液，得到滤液A和湿菌体；往湿菌体中添加2-3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至50-55℃，保温60-90s，自然冷却至室温，再添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养3-5h，无机陶瓷膜过滤收集菌体和滤液B；
2)超滤：合并滤液A和滤液B，用盐酸调至pH5-6，并通过超滤膜除去可溶性蛋白及色素，得澄清透明超滤液；
3)活性炭脱色：向超滤液中添加2wt％活性炭，以60rpm的速度搅拌脱色2h，待料液无色透明时，抽滤除去料液中的活性炭，制得脱色液；
4)减压浓缩：将脱色液打入浓缩锅，调节pH5-6，浓缩至原体积的1/5-1/6；
5)等电冷却结晶：将步骤4)所得浓缩液放入结晶罐中，调节pH在5.65，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时也以5-7℃/h的速度缓慢降温，降温到5-10℃时停止降温，育晶12小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺粗晶体；
6)粗品回溶：向L-谷氨酰胺粗晶体中加入去离子水，搅拌溶解完全，调pH为4，制得粗品溶解液；
7)离子交换：将粗品溶解液依次经过弱酸、弱碱离子交换柱，进一步去除离子以及谷氨酸，收集料液；
8)减压浓缩：调节料液的pH5-6，于40℃下真空度-0.098MPa浓缩，浓缩至原体积的1/5-1/6；
9)二次结晶：将步骤8)所得浓缩液放入密闭的结晶罐中，调节pH在5.65，并以25rpm的速度缓慢搅拌，同时以5-7℃/h的速度缓慢降温，降温到5-10℃时停止降温，育晶数小时，然后抽滤得到L-谷氨酰胺湿结晶；
10)干燥：将步骤9)所得湿结晶经过干燥得到L-谷氨酰胺成品。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖15％、玉米浆2％、硫酸铵1％、硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钠0.1％、硫酸锰0.001％、硫酸亚铁0.001％、VB10.0001％，pH6.8，以上为质量百分比。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述透析培养基的组分为：磷酸二氢钾1.2％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.06％，硫酸亚铁0.02％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.01％，调整pH为6.8，以上为质量百分比。
5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述无机陶瓷膜的膜孔径50-60nm。
6.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为1000-5000Da，超滤温度为25-45℃，超滤进口压为5bar、出口压为1.5bar。
7.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述干燥参数为：真空度为-0.098Mpa，使用温度为80℃的热水循环保持干燥温度≤40℃，干燥10h。
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