CN1432559A - 从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,属于药用和保健用氨基酸制备技术领域。本方法是先对谷氨酰胺发酵液进行预处理,除去菌体和部分蛋白质、色素及多糖,控制预处理后发酵液的pH值,通过电渗析设备去除其中的无机盐,重新调节料液pH值,并通入处理好的OH型阴离子交换柱,杂质与树脂发生交换被吸附,谷氨酰胺流过离子交换柱得到分离,流出液先脱色、真空浓缩,然后等电结晶,粗晶体通过有机溶剂洗涤,干燥即可。利用本发明的工艺提取发酵液中谷氨酰胺,可以明显减少交换树脂的用量,有效避免谷氨酰胺在强碱和强酸环境中的转化问题,大大降低生产成本,谷氨酰胺的总提取收率达到70%左右,适用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,属于药用和保健用氨基酸制备技术领域。
背景技术
L-谷氨酰胺(Gln)是L-谷氨酸(Glu)的γ-羧基酰胺化物,是20种构成蛋白质的基本氨基酸之一。它的化学分子式为H2NCO·CH2·CH2·CH(NH2)·COOH,分子量146.15,分解温度184-185℃,等电点5.65,属于中性氨基酸。近年来医学发现表明谷氨酰胺是一种条件必需性氨基酸,在生物代谢中起着举足轻重的作用,缺乏时将引发多种疾病。
发酵法生产谷氨酰胺的主要生产国是日本和韩国。据估算,现全世界谷氨酰胺的年产量已达4000吨左右,而且呈增长趋势。发酵法生产谷氨酰胺技术研究在我国已有近二十年历史,但目前由于还没有成熟的下游分离技术,尚无一家企业采用发酵法大规模生产谷氨酰胺。国内外分离提取谷氨酰胺基本上都采用阴阳双柱离子交换法,只是在树脂的选择、阴阳离子柱的组合及具体操作方式上有所差别。1998年国内报道(离子交换与吸附,1998,14(2),97~103),采用双柱法分步洗脱,实验室收率可达56.6%。九十年代初国外专利(Miyazawa et al.Method for purifving L-glutamine,Int.Cl.C07C 227/00,United States Patent 4,966,994 Filed:July.11,1989 Date of Patent:Oct.30,1990.)通过发酵液粗结晶和离子交换相结合的工艺在实验室中收率达到70%以上。阴阳双柱分离工艺由于交换树脂用量庞大,洗脱和再生酸碱消耗太多,造成严重的环境污染,另外谷氨酰胺在强碱和强酸环境容易转化成谷氨酸,导致收率很低;粗结晶工艺则耗能较大。
发明内容
为解决现有离子交换法存在的问题,本发明的目的是提供一种收率和纯度高、产品成本低、耗能低及环保的从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法。
本发明提出的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:所述工艺方法是先对谷氨酰胺发酵液进行预处理,除去菌体和部分蛋白质、色素及多糖,控制预处理后发酵液的pH值,通过电渗析设备去除其中的无机盐,重新调节pH值料液,并通入处理好的OH型阴离子交换柱,杂质与树脂发生交换被吸附,谷氨酰胺流过离子交换柱得到分离,流出液先脱色、真空浓缩,然后等电结晶,粗晶体通过有机溶剂洗涤,干燥即可,其工艺步骤为:
(1)絮凝和超滤耦合预处理发酵液:将谷氨酰胺发酵液调节至pH3.0-7.0,缓慢搅拌下向发酵液加入高分子絮凝剂,最终质量浓度为500-1500ppm,然后快速搅拌,过滤除去固相,用去离子水洗涤固相,收集上清液和洗涤水,合并后超滤,超滤膜的截留分子量为5000-50000,透过液备用;
(2)电渗析脱盐:透过液调节pH4-7,进入电渗析装置脱盐,控制操作电压和电流,当电流密度降到10-30mA/cm2时,停止电渗析,收集料液备用;
(3)离子交换树脂的处理:碱性离子交换树脂按常规方法处理后装柱,然后转成OH型后备用;
(4)离子交换除去杂质:将步骤(2)所得的料液调节pH4.0-6.0,并通入步骤(3)所处理好的离子交换柱,监测流出液的pH值,确定料液开始和终止收集的时刻,确保谷氨酸和其它杂质没有穿透树脂;
(5)料液脱色:向上述流出液中加入活性炭,搅拌,过滤;
(6)料液的真空浓缩:将脱色后的料液真空浓缩;
(7)浓缩液结晶:调节脱色后的浓缩液pH值,降温结晶,过滤,收集晶体;
(8)初次结晶母液先按照步骤(6)进行浓缩,然后按照步骤(7)进行结晶,并将晶体与步骤(7)收集的晶体合并;
(9)谷氨酰胺晶体洗涤:按照1-3倍的比例向粗晶体中加入有机溶剂,搅拌均匀后过滤,收集晶体;
(10)谷氨酰胺晶体干燥:将步骤(9)所得晶体干燥,冷却后即得谷氨酰胺成品。
在上述工艺方法中,所述的发酵液为谷氨酰胺发酵液,除去菌体、杂蛋白和残糖外,谷氨酰胺的含量须高于30g/l,谷氨酸含量须低于10g/l,硫酸铵和氯化铵总量60g/l,还有少量磷酸盐其它盐类;步骤(1)所述的发酵液的pH值是用无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸中的任何一种调节的;步骤(1)所述的高分子絮凝剂为阴离子型、阳离子型、非离子型聚丙烯酰胺和壳聚糖中的任何一种;步骤(2)调节料液pH所用的酸为无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸中的任何一种,所用的碱为氢氧化钠、氨水、碳酸钠中的任何一种;步骤(3)所用的阴离子交换树脂是D296、D261、D290、201×4、201×7、D301、D380、D314、D392中的任何一种;步骤(9)所述的有机溶剂为无水乙醇,95%的乙醇和甲醇,丙酮和丁酮中的任何一种。
由于本发明采用了电渗析脱盐和单根阴离子交换柱除谷氨酸等杂质相耦合的工艺提取发酵液中谷氨酰胺,可以明显减少交换树脂的用量,有效地避免了谷氨酰胺在强碱和强酸环境中的转化问题,大大地降低了生产成本,谷氨酰胺的总提取收率达到70%左右,而且产品质量符合日本药典。也使得工业上通过发酵法生产谷氨酰胺成为可能。
具体实施方式
本发明是先对谷氨酰胺发酵液进行预处理,除去几乎全部的菌体和部分蛋白质、色素及多糖。将预处理后发酵液的pH值控制在一定范围内,通过电渗析设备去除其中的无机盐,主要是硫酸铵、氯化铵及磷酸盐类物质。然后料液重新调节pH值,并以适当的流速通入处理好的OH型阴离子交换柱,谷氨酸等杂质因为与树脂发生了交换被吸附,绝大部分谷氨酰胺则流过离子交换柱,从而得到分离。流出液先脱色、真空浓缩,然后等电结晶。粗晶体通过有机溶剂洗涤,干燥即可得到成品。
所述工艺方法的第一个关键点是发酵液的预处理,通过适当的预处理方式,包括絮凝、超滤或者传统离心工艺,除掉全部的菌体和部分杂蛋白、多糖,降低发酵液的粘度,不仅从根本上避免了电渗析操作时的膜的堵塞和污染,而且便于一次母液重结晶,易于提高整个工艺的收率。
所述工艺方法的第二个关键点是电渗析时料液pH的控制。通过加入适当的酸碱,并且控制好电渗析的操作时间,该过程就可以除掉绝大部分的无机盐,同时产品谷氨酰胺损失很少。
所述工艺方法的第三个关键点是离子交换树脂的选择以及离子交换时料液pH的调节。通过选择适当的树脂,并且保证料液pH在一定范围,就可以去除全部谷氨酸等杂质,而使绝大部分谷氨酰胺穿过离子交换柱得以分离。其工艺步骤为:
1、絮凝和超滤耦合预处理发酵液:将谷氨酰胺发酵液调节至pH3.0-6.0,温度25℃,缓慢搅拌下向发酵液加入高分子絮凝剂,最终质量浓度为500-1500ppm,然后快速搅拌10-30分钟,静置30-60分钟,过滤除去固相,用2-4倍去离子水洗涤固相,收集上清液和洗涤水,合并后超滤。超滤膜的截留分子量为5000-50000。透过液备用。
2、电渗析脱盐:透过液调节pH4-7,进入电渗析装置脱盐。电渗析设备由多对阳膜、阴膜和/或双极膜并联或串联组成,极板为不锈钢或者钛,控制操作电压和电流,维持料液温度10-40℃。当电流密度降到10-30mA/cm2时,停止电渗析,收集料液备用。
3、离子交换树脂的处理:碱性离子交换树脂按常规方法处理后装柱,然后转成OH型后备用。
4、离子交换除去谷氨酸等杂质:将步骤(2)所得的料液调节pH4.0-6.0,以1.0-4.0BV/小时的流速通入步骤(3)所处理好的离子交换柱。监测流出液的pH值,确定料液开始和终止收集的时刻,确保谷氨酸和其它杂质没有穿透树脂。
5、料液脱色:向上述流出液中,按0.5-2%的比例逐渐加入粒状或粉状药用级活性炭,30℃下搅拌20-60分钟,过滤。
6、料液的真空浓缩:将脱色后的料液在40-70℃下真空浓缩至谷氨酰胺含量为60-120g/l。
7、浓缩液结晶:将脱色后的浓缩液调节至pH4-6,然后以2-4℃/小时的速率降温。温度每降10℃左右保温1-4小时养晶,然后继续以同样的速率降温,直至料液温度降至3-5℃,在此温度下维持8-12小时养晶,过滤,收集晶体。
8、初次结晶母液先按照步骤(6)进行浓缩,然后按照步骤(7)进行结晶,并将晶体与步骤(7)收集的晶体合并。
9、谷氨酰胺晶体洗涤:按照1-3倍的比例向粗晶体中加入有机溶剂,在30-50℃下搅拌1-2小时,过滤收集晶体。
10、谷氨酰胺晶体干燥:将步骤(9)所得晶体在40-50℃下干燥3-6小时,然后80℃干燥1-2小时,冷却后即得谷氨酰胺成品。
所述的发酵液为谷氨酰胺发酵液,除去菌体、杂蛋白和残糖外,谷氨酰胺的含量须高于30g/l,谷氨酸含量须低于10g/l,硫酸铵和氯化铵总量60g/l左右,还有少量磷酸盐等其它盐类。
步骤1所述的发酵液的pH值是用无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸之一调节的。
步骤1所述的高分子絮凝剂为阴离子型、阳离子型、非离子型聚丙烯酰胺和壳聚糖之一。
步骤1所述的超滤设备是管式膜、平板膜、卷式膜和中空纤维膜之一。
步骤2所述的电渗析设备使用的阳膜、阴膜可以并联,也可以串联。
步骤2调节料液pH所用的酸为无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸之一,所用的碱为氢氧化钠、氨水、碳酸钠之一。
步骤3所用的阴离子交换树脂是D296、D261、D290、201×4、201×7、D301、D380、D314、D392之一。
步骤9所述的有机溶剂为醇类如无水乙醇、95%的乙醇和甲醇或者酮类如丙酮和丁酮之一。
下面结合实例对本发明作进一步阐述。
实施例1:
谷氨酰胺发酵液的主要成分为:谷氨酰胺35g/l,谷氨酸8g/l,硫酸铵50g/l,氯化铵10g/l,其它无机盐少量,pH6.7,发酵液体积5L。
5g阳离子型聚丙烯酰胺作絮凝剂,缓慢搅拌下加入到发酵液中,然后快速搅拌10分钟,静置30分钟,过滤。用500ml去离子水清洗固相。将上清液与洗涤水合并后通过管式膜组件进行超滤,超滤膜截留分子量为6000。用2M硫酸调节发酵液pH为6,进行电渗析,电渗析器由两个阳膜和一个阴膜组成。在此过程中用2M硫酸和2M氢氧化钠控制发酵液pH稳定在6左右,控制温度30℃左右。当电流降低到20mA/cm2时,停止电渗析。然后以上述酸碱调节pH为5.0,以3BV/小时的流速通入处理好的D380阴离子交换柱,柱床层体积为1升。监测流出液pH值不低于5,确保谷氨酸等杂质没有穿透树脂。收集流出液,加入粉状活性炭30g,缓慢搅拌20分钟后过滤两次。将脱色液真空浓缩至初始体积的1/5。用盐酸调节浓缩液的pH值为5.6,按照2℃/小时的速率降温,每降温10℃保温3小时,降至5℃后,保温10小时结晶。过滤,收集晶体。母液在上述条件下重新浓缩、结晶,并将二次晶体与一次晶体合并。向晶体中按1ml/g的量加入无水乙醇,35℃下搅拌1小时后过滤,晶体50℃下干燥5小时,80℃干燥2小时,冷却后即得谷氨酰胺成品。该过程谷氨酰胺的收率68.5%,纯度98.8%。
实施例2:
谷氨酰胺发酵液的主要成分为:谷氨酰胺32g/l,谷氨酸7g/l,硫酸铵50g/l,氯化铵6g/l,其它无机盐少量,pH6.6,发酵液体积5L。
6g壳聚糖作絮凝剂,缓慢搅拌下加入到发酵液中,然后快速搅拌15分钟,静置30分钟,过滤。用500ml去离子水清洗固相。将上清液与洗涤水合并后通过平板膜超滤装置进行超滤,超滤膜截留分子量为10000。用2M盐酸调节发酵液pH为5,进行电渗析,电渗析器由两个阳膜和一个阴膜组成。在此过程中用2M盐酸和20%氨水控制发酵液pH稳定在5左右,控制温度35℃左右。当电流降低到25mA/cm2时,停止电渗析。然后以上述酸碱调节pH为4.5,以1.5BV/小时的流速通入处理好的201×7阴离子交换柱,柱床层体积为1升。监测流出液pH值不低于5,确保谷氨酸等杂质没有穿透树脂。收集流出液,加入粒状活性炭25g,缓慢搅拌30分钟后过滤两次。将脱色液真空浓缩至初始体积的1/4。用盐酸调节浓缩液的pH值为5.6,按照3℃/小时的速率降温,每降温10℃保温4小时,降至5℃后,保温10小时结晶。过滤,收集晶体。母液在上述条件下重新浓缩、结晶,并将二次晶体与一次晶体合并。再向合并后的晶体中按1ml/g的量加入甲醇,30℃下搅拌1.5小时后过滤,晶体45℃下干燥3小时,80℃干燥2小时,冷却后即得谷氨酰胺成品。该过程谷氨酰胺的收率67.6%,纯度99.3%。
实施例3:
谷氨酰胺发酵液的主要成分为:谷氨酰胺38g/l,谷氨酸10g/l,硫酸铵40g/l,氯化铵20g/l,其它无机盐少量,pH6.7,发酵液体积5L。
7g非离子型聚丙烯酰胺作絮凝剂,缓慢搅拌下加入到发酵液中,然后快速搅拌15分钟,静置30分钟,过滤。用500ml去离子水清洗固相。将上清液与洗涤水合并后通过中空纤维膜装置超滤,超滤膜截留分子量为30000。用2M硝酸调节发酵液pH为6.5,进行电渗析,电渗析器由两个阳膜和一个阴膜组成。在此过程中用2M硫酸和2M氢氧化钠控制发酵液pH稳定在6.5左右,控制温度25℃左右。当电流降低到15mA/cm2时,停止电渗析。然后以上述酸碱调节pH为5.5,以2BV/小时的流速通入处理好的D330阴离子交换柱,柱床层体积为1升。监测流出液pH值不低于5.5,确保谷氨酸等杂质没有穿透树脂。收集流出液,加入粉状活性炭28g,缓慢搅拌20分钟后过滤两次。将脱色液真空浓缩至初始体积的1/4。用盐酸调节浓缩液的pH值为5.6,按照3℃/小时的速率降温,每降温10℃保温3小时,降至4℃后,保温12小时结晶。过滤,收集晶体。母液在上述条件下重新浓缩、结晶,并将二次晶体与一次晶体合并。向粗晶体中按1ml/g的量加入95%乙醇,30℃下搅拌1小时后过滤,晶体55℃下干燥4小时,80℃干燥2小时,冷却后即得谷氨酰胺成品。该过程谷氨酰胺的收率70.8%,纯度99.0%。
Claims (7)
1、一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:所述工艺方法是先对谷氨酰胺发酵液进行预处理,除去菌体和部分蛋白质、色素及多糖,控制预处理后发酵液的pH值,通过电渗析设备去除其中的无机盐,重新调节料液pH值,并通入处理好的OH型阴离子交换柱,杂质与树脂发生交换被吸附,谷氨酰胺流过离子交换柱得到分离,流出液先脱色、真空浓缩,然后等电结晶,粗晶体通过有机溶剂洗涤,干燥即可,其工艺步骤为:
(1)絮凝和超滤耦合预处理发酵液:将谷氨酰胺发酵液调节至pH3.0-7.0,缓慢搅拌下向发酵液加入高分子絮凝剂,最终质量浓度为500-1500ppm,然后快速搅拌,过滤除去固相,用去离子水洗涤固相,收集上清液和洗涤水,合并后超滤,超滤膜的截留分子量为5000-50000,透过液备用;
(2)电渗析脱盐:透过液调节pH4-7,进入电渗析装置脱盐,控制操作电压和电流,当电流密度降到10-30mA/cm2时,停止电渗析,收集料液备用;
(3)离子交换树脂的处理:碱性离子交换树脂按常规方法处理后装柱,然后转成OH型后备用;
(4)离子交换除去杂质:将步骤(2)所得的料液调节pH4.0-6.0,并通入步骤(3)所处理好的离子交换柱,监测流出液的pH值,确定料液开始和终止收集的时刻,确保谷氨酸和其它杂质没有穿透树脂;
(5)料液脱色:向上述流出液中加入活性炭,搅拌,过滤;
(6)料液的真空浓缩:将脱色后的料液真空浓缩;
(7)浓缩液结晶:调节脱色后的浓缩液pH值,降温结晶,过滤,收集晶体;
(8)初次结晶母液先按照步骤(6)进行浓缩,然后按照步骤(7)进行结晶,并将晶体与步骤(7)收集的晶体合并;
(9)谷氨酰胺晶体洗涤:按照1-3倍的比例向粗晶体中加入有机溶剂,搅拌均匀后过滤,收集晶体;
(10)谷氨酰胺晶体干燥:将步骤(9)所得晶体干燥,冷却后即得谷氨酰胺成品。
2、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:所述的发酵液为谷氨酰胺发酵液,除去菌体、杂蛋白和残糖外,谷氨酰胺的含量须高于30g/l,谷氨酸含量须低于10g/l,硫酸铵和氯化铵总量60g/l,还有少量磷酸盐其它盐类。
3、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:步骤(1)所述的发酵液的pH值是用无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸中的任何一种调节的。
4、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:步骤(1)所述的高分子絮凝剂为阴离子型、阳离子型、非离子型聚丙烯酰胺和壳聚糖中的任何一种。
5、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:步骤(2)调节料液pH所用的酸为无机酸如盐酸、硫酸和磷酸,有机酸如乙酸、醋酸和乳酸中的任何一种,所用的碱为氢氧化钠、氨水、碳酸钠中的任何一种。
6、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:步骤(3)所用的阴离子交换树脂是D296、D261、D290、201×4、201×7、D301、D380、D314、D392中的任何一种。
7、按照权利要求1所述的一种从发酵液中提取谷氨酰胺的工艺方法,其特征在于:步骤(9)所述的有机溶剂为无水乙醇,95%的乙醇和甲醇,丙酮和丁酮中的任何一种。
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