CN112694413A - 从发酵液中提取l-高丝氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及L‑高丝氨酸提取领域，尤其涉及一种从发酵液中提取L‑高丝氨酸的方法。包括以下步骤：发酵液预处理、脱色、电去离子和浓缩过滤，得到L‑高丝氨酸。本发明首次采用电去离子技术对L‑高丝氨酸发酵液进行除盐处理，与电渗析技术相比电去离子技术的除盐率提高10%，与离子交换技术相比电去离子技术中添加的树脂不需要再生，减少了大量酸碱的使用，可节省用水量70%。
Description
技术领域
本发明涉及L-高丝氨酸提取领域，尤其涉及一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法。
背景技术
L-高丝氨酸（2-氨基-4-羟基丁酸）是一种非蛋白氨基酸，其衍生物不仅可以通过酶促反应转化为其他重要化工中间体，而且其衍生物具有丰富的生物活性，例如可以有效地抑制镰状红细胞、抗真菌药物。L-高丝氨酸还是合成手性除草剂--草铵膦的一种重要中间体，所以在药学和生物学等方面对L-高丝氨酸的研究越来越受到科研工作者的重视。
目前，工业生产L-高丝氨酸的方法主要是化学合成法和生物法；化学合成法主要是甲硫氨酸法：通过与碘甲烷反应形成翁盐，然后加水溶解回流，在碱性条件下生成L-高丝氨酸，此方法虽然收率高，但是碘甲烷价格昂贵，反应时间长，废料处理复杂。
专利CN101100438A提供一种以L-天冬氨酸为原料制备L-天冬氨酸甲酯或乙酯，再利用金属复氢化合物为还原剂在有机溶剂中常压制备L-高丝氨酸，此方法原料易得，收率较高，但是提纯步骤繁琐，环境污染严重。
专利CN105506014A提供了一种以丙酮酸和醛类化合物为底物在醛缩酶的作用下进行催化反应，所得产物依次经过层析分离、脱盐、脱色、浓缩结晶、干燥等步骤得到L-高丝氨酸，其在提取过程中采用离子交换树脂作为关键提取步骤，具有回收率高、杂质去除彻底、处理量大等优点，但再生过程中会消耗大量酸碱同时生成大量废水污染环境且其原料中有甲醛存在安全隐患。
L-高丝氨酸发酵液是一种成分复杂的混合物，除含有L-高丝氨酸外，还存在大量的菌体、蛋白质、残糖、色素和无机盐等成分。蛋白质、色素和无机盐的去除是提取L-高丝氨酸的关键，工业上常用的脱色和除盐方法为活性炭脱色、离子交换除盐或电渗析除盐。活性炭脱色会产生大量的废炭同时截留部分发酵液降低产物收率；离子交换除盐有废水产生并消耗大量酸碱；电渗析技术有处理时间长、除盐率不高，产物纯度低等缺点，因此急需一种新的提取L-高丝氨酸的方法。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的不足，提供一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、发酵液预处理：发酵液调PH值范围为4-5.8，加入20-80mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理20-40分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.8-5.0L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为0.5-10KDa，操作压力为2.0-4.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.7-5.0L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为30℃-50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.7-5.0L，脱色液透光率为78.3%-87.2%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电去离子：将步骤2中脱色液送入电去离子装置的淡室中，在30V电压下运行，连续检测淡室溶液的导电率，当导电率降到500μs/cm时停止运行，脱盐得到脱盐液，收集脱盐液4.6-5.0L；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%，浓缩液温度预冷至0℃-15℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液6-8倍体积时，停止搅拌育晶5-8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液10-12倍体积，在5℃条件下结晶16-20小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸。
优选地，所述步骤1中的发酵液浓度为30-50 g/L，是利用大肠杆菌ZFgs012发酵产生，该菌种于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21153，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
优选地，所述步骤1中的水溶性壳聚糖絮凝剂制备步骤包括:
步骤1-1、配制质量体积比为1:10的壳聚糖溶液；
步骤1-2、加入冰乙酸调节PH值至3.8，充分搅拌并静置12h，其中壳聚糖
的脱乙酰度为95%。
优选地，所述步骤3中电去离子装置中淡室所添加的树脂为Cl型717树脂和Na型732树脂混合，浓室中加入0.02mol/L的氯化钠溶液，极室中加入0.2mol/L的硫酸钠溶液，操作电压为30V，得到的脱盐液电导率小于500μs/cm。
优选地，所述步骤4中的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一、本发明使用活性炭纤维模块对发酵液进行脱色，活性炭纤维模块可重复使用100-350批次，相对活性炭粉末脱色工艺，发酵液截留量更少，同时无需废炭处理等工艺；脱色效果更好，脱色温度常温，可节省部分能耗。
第二、本发明首次采用电去离子技术对L-高丝氨酸发酵液进行除盐处理，与电渗析技术比较电去离子技术的除盐率提高10%，与离子交换技术比较电去离子技术中添加的树脂不需要再生，减少了大量酸碱的使用，可节省用水量70%。
第三、本发明通过控制有机溶剂流加速率，并结合中间过程育晶，改善L-高丝氨酸晶型，有效避免了L-高丝氨酸和微量无机盐形成共结晶，提高产物纯度。使用此方法提取发酵液中的L-高丝氨酸，纯度高，收率高，采用本方法提取L-高丝氨酸，最终收率大于70%，纯度大于98%。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为35g/L，发酵液调PH值为4，加入20mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理20分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.8L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为0.5KDa，操作压力为2.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.7L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为30℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.7L，脱色液透光率为78.3%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电去离子：将步骤2中脱色液送入电去离子装置的淡室中，在30V电压下运行，连续检测淡室溶液的导电率，当导电率降到500μs/cm时停止运行，脱盐得到脱盐液，收集脱盐液4.6L；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至0℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液6倍体积时，停止搅拌育晶5小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液10倍体积，在5℃条件下结晶16小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为122.85g，纯度99.3%，收率为70.2%。
所述步骤1中的发酵液浓度为30-50 g/L，是利用大肠杆菌ZFgs012发酵产生，该菌株于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21153，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
所述步骤1中的水溶性壳聚糖絮凝剂制备步骤包括:
步骤1-1、配制质量体积比为1:10的壳聚糖溶液；
步骤1-2、加入冰乙酸调节PH值至3.8，充分搅拌并静置12h，其中壳聚糖
的脱乙酰度为95%。
所述步骤3中电去离子装置中淡室所添加的树脂为Cl型717树脂和Na型732树脂混合，浓室中加入0.02mol/L的氯化钠溶液，极室中加入0.2mol/L的硫酸钠溶液，操作电压为30V，得到的脱盐液电导率小于500μs/cm。
所述步骤4中的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种。
实施例2
一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为35g/L，发酵液调PH值为5.8，加入80mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理40分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液5L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为10KDa，操作压力为4.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液5L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液5L，脱色液透光率为87.2%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电去离子：将步骤2中脱色液送入电去离子装置的淡室中，在30V电压下运行，连续检测淡室溶液的导电率，当导电率降到500μs/cm时停止运行，脱盐得到脱盐液，收集脱盐液5L；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至15℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液8倍体积时，停止搅拌育晶8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液12倍体积，在5℃条件下结晶20小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为130.9g，纯度98.2%，收率为74.8%。
所述步骤1中的发酵液浓度为30-50 g/L，是利用大肠杆菌ZFgs012发酵产生，该菌株于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21153，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
所述步骤1中的水溶性壳聚糖絮凝剂制备步骤包括:
步骤1-1、配制质量体积比为1:10的壳聚糖溶液；
步骤1-2、加入冰乙酸调节PH值至3.8，充分搅拌并静置12h，其中壳聚糖
的脱乙酰度为95%。
所述步骤3中电去离子装置中淡室所添加的树脂为Cl型717树脂和Na型732树脂混合，浓室中加入0.02mol/L的氯化钠溶液，极室中加入0.2mol/L的硫酸钠溶液，操作电压为30V，得到的脱盐液电导率小于500μs/cm。
所述步骤4中的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种。
实施例3
一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为40g/L，发酵液调PH值为4.5，加入50mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理30分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.9L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为5KDa，操作压力为3.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.8L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.8L，脱色液透光率为82%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电去离子：将步骤2中脱色液送入电去离子装置的淡室中，在30V电压下运行，连续检测淡室溶液的导电率，当导电率降到500μs/cm时停止运行，脱盐得到脱盐液，收集脱盐液4.8L；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至8℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液7倍体积时，停止搅拌育晶8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液11倍体积，在5℃条件下结晶18小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为145.1g，纯度99.1%，收率为72.5%。
所述步骤1中的发酵液浓度为30-50 g/L，是利用大肠杆菌ZFgs012发酵产生，该菌株于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21153，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
所述步骤1中的水溶性壳聚糖絮凝剂制备步骤包括:
步骤1-1、配制质量体积比为1:10的壳聚糖溶液；
步骤1-2、加入冰乙酸调节PH值至3.8，充分搅拌并静置12h，其中壳聚糖
的脱乙酰度为95%。
所述步骤3中电去离子装置中淡室所添加的树脂为Cl型717树脂和Na型732树脂混合，浓室中加入0.02mol/L的氯化钠溶液，极室中加入0.2mol/L的硫酸钠溶液，操作电压为30V，得到的脱盐液电导率小于500μs/cm。
所述步骤4中的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种。
对比例1
对上述实施例1制作的发酵液，采用电渗析的方法进行提取，具体步骤如下：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为35g/L，发酵液调PH值为4，加入20mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理20分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.8L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为0.5KDa，操作压力为2.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.7L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为30℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.7L，脱色液透光率为78.3%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电渗析：将步骤2中脱色液送入采用电渗析装置脱盐，将脱色液注入淡室进料速度5L/h，将2mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为20V，处理时间为3h，获得的解析液18L，解析液电导为800μS/cm；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至0℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液6倍体积时，停止搅拌育晶5小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液10倍体积，在5℃条件下结晶16小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为115.6g，纯度95.1%，收率为66.0%。
对比例2
对上述实施例2制作的发酵液，采用电渗析的方法进行提取，具体步骤如下：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为35g/L，发酵液调PH值为5.8，加入80mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理40分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液5L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为10KDa，操作压力为4.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液5L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液5L，脱色液透光率为87.2%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电渗析：将步骤2中脱色液送入采用电渗析装置脱盐，将脱色液注入淡室进料速度5L/h，将2mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为20V，处理时间为3h，获得的解析液18L，解析液电导为800μS/cm；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至15℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液8倍体积时，停止搅拌育晶8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液12倍体积，在5℃条件下结晶20小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为118.9g，纯度94.5%，收率为67.9%。
对比例3
对上述实施例3制作的发酵液，采用电渗析的方法进行提取，具体步骤如下：
步骤1、发酵液预处理：取5L上罐发酵液，高丝氨酸浓度为40g/L，发酵液调PH值为4.5，加入50mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理30分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.9L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为5KDa，操作压力为3.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.8L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.8L，脱色液透光率为82%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电渗析：将步骤2中脱色液送入采用电渗析装置脱盐，将脱色液注入淡室进料速度5L/h，将2mM的Na2SO4注入浓室，阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液，设备运行电压为20V，处理时间为3h，获得的解析液18L，解析液电导为800μS/cm；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%时，浓缩液温度预冷至8℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液7倍体积时，停止搅拌育晶8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液11倍体积，在5℃条件下结晶18小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸，L-高丝氨酸为137.0g，纯度96.1%，收率为68.5%。
为了更好地体现本发明专利的有益性，将上述实施例1-3及对比例1-3中各项指标测试结果描述如下：
上述对比例1-3中采用电渗析方法提取L-高丝氨酸，通过实施例1-3与对比例1-3的各项指标测试结果对比分析，从L-高丝氨酸质量、L-高丝氨酸纯度、L-高丝氨酸收率等方面来看，实施例相比对比例，都有明显的优势，因此电去离子比电渗析的方法更适合提取L-高丝氨酸。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、发酵液预处理：发酵液调PH值范围为4-5.8，加入20-80mg/L水溶性壳聚糖絮凝剂，加热至60-80℃处理20-40分钟，促使水溶性杂蛋白絮凝沉淀，微滤膜除去菌体及絮凝体，获得发酵液清液4.8-5.0L，利用卷式超滤膜分离系统，截留分子量为0.5-10KDa，操作压力为2.0-4.0MPa，将发酵液清液中的小分子肽及短链蛋白等物质去除，收集超滤膜透过液4.7-5.0L；
步骤2、脱色：将步骤1收集的超滤膜透过液通入规格为5英寸活性炭纤维模块装置脱色，脱色温度为30℃-50℃，操作压力0.5MPa，获得脱色液4.7-5.0L，脱色液透光率为78.3%-87.2%，脱色后用70℃热水通入活性炭纤维模块装置进行在线再生循环使用；
步骤3、电去离子：将步骤2中脱色液送入电去离子装置的淡室中，在30V电压下运行，连续检测淡室溶液的导电率，当导电率降到500μs/cm时停止运行，脱盐得到脱盐液，收集脱盐液4.6-5.0L；
步骤4、浓缩过滤：将步骤3得到的脱盐液减压浓缩至L-高丝氨酸含量为90%-100%，浓缩液温度预冷至0℃-15℃，按每小时1倍体积向浓缩液中缓慢加入有机溶剂并以50r/min的速度搅拌混匀，待有机溶剂添加量达到浓缩液6-8倍体积时，停止搅拌育晶5-8小时，继续按每小时1倍体积流加有机溶剂至浓缩液10-12倍体积，在5℃条件下结晶16-20小时，抽滤烘干得到L-高丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤1中的发酵液浓度为30-50 g/L，是利用大肠杆菌ZFgs012发酵产生，该菌株于2020年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.21153，分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤1中的水溶性壳聚糖絮凝剂制备步骤包括:
步骤1-1、配制质量体积比为1:10的壳聚糖溶液；
步骤1-2、加入冰乙酸调节PH值至3.8，充分搅拌并静置12h，其中壳聚糖
的脱乙酰度为95%。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3中电去离子装置中淡室所添加的树脂为Cl型717树脂和Na型732树脂混合，浓室中加入0.02mol/L的氯化钠溶液，极室中加入0.2mol/L的硫酸钠溶液，操作电压为30V，得到的脱盐液电导率小于500μs/cm。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取L-高丝氨酸的方法，其特征在于：所述步骤4中的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种。
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