CN116496222B - 一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵生产四氢嘧啶技术领域，具体公开了一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法。该方法包括以下步骤：将四氢嘧啶发酵液通过陶瓷膜、超滤膜过滤后，得到澄清预处理液；电渗析膜对澄清预处理液脱盐处理得到脱盐液；利用活性炭对脱盐液进行脱色处理得到脱色液；将脱色液减压浓缩后进行结晶，过滤得到四氢嘧啶湿晶体和过滤母液；对四氢嘧啶湿晶体进行真空干燥，得到四氢嘧啶晶体；再对母液回收得到合格的回收品，回收品与四氢嘧啶晶体合并得到所述的四氢嘧啶。该工艺步骤更加简单，产品回收率高，且产品色谱纯度可达99.5％以上，符合企业产业化生产的要求。

Description

一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生产四氢嘧啶技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法。

背景技术

四氢嘧啶是耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，因其特殊的嘧啶环状结构具有较强的电负性，也具有较强的亲水性，一个四氢嘧啶分子可携带多个水分子，并与水结合，形成“四氢嘧啶水电复合物”。因其特殊的理化特性，四氢嘧啶被广泛用于化妆品、医药、农业、食品等领域。

四氢嘧啶的生产方法有提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制，分离纯化困难，收率低，产品纯度低，污染环境严重，大量生产成本高，难以实现工业化生产。而发酵法生产具有原料成本低、反应条件温和、易于实现大规模生产等优点。目前，人们主要通过发酵工艺从中度嗜盐微生物细胞中提取获得四氢嘧啶。

中国专利CN104557729A提供了一种四氢嘧啶的提取工艺，主要包括预处理、四氢嘧啶溶出、脱色、电渗析脱盐、浓缩、离子交换、浓缩、冷冻结晶等步骤，该方法预处理涉及离心收集菌体、干燥、粉碎、加水使四氢嘧啶溶出等步骤，提取四氢嘧啶过程中需要电渗析和阳阴离子交换树脂两步脱盐工艺，含酸碱废水的排放量大。中国专利CN115417822A公开一种四氢嘧啶的提取纯化工艺，包括如下步骤：S1、取含四氢嘧啶发酵液，离心除菌，获得清液；S2、调清液pH值，将清液首先经过大孔吸附树脂吸附脱色，再经过离子交换树脂吸附，采用碱液对离子交换树脂洗脱，收集洗脱液；S3、将洗脱液浓缩，调洗脱液pH值，浓缩后的洗脱液通过大孔吸附树脂吸附二次脱色，收集脱色液；S4、将脱色液浓缩、结晶、离心、干燥即得四氢嘧啶成品，该方法要用到离子交换树脂，存在步骤冗长，收率损失和废水处理的问题。中国专利CN105669560A提供一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，从富含四氢嘧啶的发酵液中分离提取四氢嘧啶，首先利用双膜系统即微滤膜、超滤膜分离系统过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶晶体，该方法虽然能耗较低，但是菌体和蛋白很容易将膜孔径堵塞，大大缩短了膜的使用寿命，不符合实际生产的经济性。

所以目前需要一种能够节约资源、产生废水少且四氢嘧啶的收率和纯度高的分离纯化方法，能够符合生产经济性。

发明内容

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法，该方法操作简单、成本低、废水排放少且收率高，符合生产经济性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法，包括以下步骤：

S1、预处理：将四氢嘧啶发酵液通过陶瓷膜、超滤膜过滤后，得到澄清预处理液；

S2、脱盐：用电渗析膜对澄清预处理液进行脱盐处理，得到脱盐液；

S3、脱色：利用活性炭对脱盐液进行脱色处理，调节pH为6.5-9.0，过滤得到脱色液；

S4、浓缩结晶：脱色液减压浓缩至四氢嘧啶含量为30％-60％，在0-20℃下进行结晶，过滤得到四氢嘧啶湿晶体和过滤母液；

S5、干燥：对四氢嘧啶湿晶体进行真空干燥，得到四氢嘧啶晶体；

S6、母液回收：利用脱色剂对步骤S4的过滤母液脱色后减压浓缩进行二次结晶，过滤干燥得到合格的回收品，回收品与四氢嘧啶晶体结合得到所述的四氢嘧啶。

优选地，步骤S1所述陶瓷膜的的孔径为20-200nm，所述超滤膜的截留分子量为300-10000Dal。

优选地，步骤S2所述电渗析膜为合金电渗析膜，阳膜为CAM，阴膜为AAM；所述电渗析的电导率为0.1-1ms/cm。

优选地，步骤S3所述活性炭的质量为脱盐液的0.01％-0.3％。

进一步优选地，步骤S3所述活性炭的质量为脱盐液的0.17％。

优选地，步骤S4所述结晶中四氢嘧啶含量为45％-55％，结晶温度为0-10℃。

优选地，步骤S6所述脱色剂为活性炭、阴离子交换树脂或者大孔吸附树脂中的至少一种。

进一步优选地，步骤S6所述脱色剂为活性炭。

优选地，步骤S6所述二次结晶中四氢嘧啶的质量分数为30％-60％。

进一步优选地，步骤S6所述二次结晶中四氢嘧啶的质量分数为35％-55％。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明采用陶瓷膜过滤、电渗析脱盐、活性炭脱色、减压浓缩、结晶、干燥和母液回收的提取过程，工艺步骤更加简单，产品回收率高，且产品色谱纯度可达99.9％以上，不需要加入有机溶剂，分离纯化后的四氢嘧啶纯度更高；本发明采用电渗析法进行一步脱盐，不需要离子交换树脂，设备简单，运行时不需要使用酸碱进行再生处理，且产生废水少，环境污染小；采用陶瓷膜，在固液分离的同时还去除了大分子蛋白等杂质，步骤简单、除杂效果好、处理效率高。

附图说明

图1为实施例2所得成品液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

取发酵液22L(含四氢嘧啶923g)，通过50nm的陶瓷膜和截留分子量为500Dal的超滤膜过滤得到滤液42L。将陶瓷膜滤液用电渗析膜脱盐至脱盐液电导率0.9ms/cm，得到脱盐液46L，向脱盐液加入活性炭85g，在45℃下搅拌0.5小时后过滤，顶洗活性炭滤饼，调节pH为7.5，得脱色液52L，将脱色液65℃真空浓缩至四氢嘧啶含量为52％，搅拌下缓慢降温至10℃，继续搅拌2h后过滤，用10℃冷水淋洗后70℃真空干燥30min，得到四氢嘧啶成品701.5g，收率76％，色谱纯度99.5％。母液加活性炭脱色后在50℃浓缩至四氢嘧啶含量为30％，降温至10℃结晶2小时，湿晶体加热水溶解至四氢嘧啶含量为40％后降温至10℃结晶2小时后过滤、淋洗、真空干燥，得到四氢嘧啶母液回收品58g，色谱纯度99.5％，加母液回收后提取总收率82.2％。

实施例2

取发酵液25L(含四氢嘧啶950.8g)，通过50nm陶瓷膜和截留分子量为300Dal的超滤膜过滤后，得到滤液46L。将陶瓷膜滤液用电渗析膜脱盐至脱盐液电导率0.8ms/cm，得到脱盐液50L，向脱盐液加入活性炭85g，在48℃下搅拌0.8小时后过滤，顶洗活性炭滤饼，调节pH为7.2，得脱色液54L，将脱色液60℃真空浓缩至四氢嘧啶含量为50％，搅拌下缓慢降温至5℃，继续搅拌1.5h后过滤，用5℃冷水淋洗后真空干燥，得到四氢嘧啶成品744.5g，收率78.3％，色谱纯度99.3％。母液加活性炭脱色后在65℃浓缩至四氢嘧啶含量为35％，降温至15℃结晶1.5小时，湿晶体加热水溶解至四氢嘧啶含量为45％后降温至10℃结晶1.5小时后过滤、淋洗、真空干燥，得到四氢嘧啶母液回收品45.2g，色谱纯度99.5％，加母液回收后提取总收率83.0％。

实施例3

取发酵液48L(含四氢嘧啶2160.5g)，通过200nm陶瓷膜和截留分子量为800Dal的超滤膜过滤后，得到滤液85L。将陶瓷膜滤液用电渗析膜脱盐至脱盐液电导率0.85ms/cm，得到脱盐液92L，向脱盐液加入活性炭276g，在42℃下搅拌1小时后过滤，顶洗活性炭滤饼，调节pH为8.0，得脱色液95L，将脱色液80℃真空浓缩至四氢嘧啶含量为50％，搅拌下缓慢降温至5℃，继续搅拌2h后过滤，用5℃冷水淋洗后真空干燥，得到四氢嘧啶成品1555.6g，收率72％，色谱纯度99.5％。母液加活性炭脱色后在50℃浓缩至四氢嘧啶含量为40％，降温至5℃结晶2小时，湿晶体加热水溶解至四氢嘧啶含量为45％后降温至5℃结晶2小时后过滤、淋洗、真空干燥，得到四氢嘧啶母液回收品178.4g，色谱纯度99.5％，加母液回收后提取总收率80.26％。

对比例1

取发酵液40L(含四氢嘧啶1544g)，通过50nm陶瓷膜和截留分子量为300Dal的超滤膜过滤后得到滤液80L。将陶瓷膜滤液用电渗析膜脱盐至脱盐液电导率0.9ms/cm，得到脱盐液95L，向脱盐液加入活性炭380g，在45℃下搅拌0.5小时后过滤，顶洗活性炭滤饼，调节pH为5.0，得脱色液100L，将脱色液65℃真空浓缩至四氢嘧啶含量为65％，搅拌下缓慢降温至10℃，继续搅拌2h后过滤，用10℃冷水淋洗后真空干燥，得到四氢嘧啶成品1148.5g，收率74.3％，色谱纯度95.2％。母液加活性炭脱色后在75℃浓缩至四氢嘧啶含量为35％，降温至10℃结晶2小时，湿晶体加热水溶解至四氢嘧啶含量为65％后降温至10℃结晶2小时后过滤、淋洗、真空干燥，得到四氢嘧啶母液回收品157.6g，色谱纯度93.4％，加母液回收后提取总收率84.6％。

对比例2

取发酵液45L(含四氢嘧啶1867.5g)，用50nm陶瓷膜和截留分子量为300Dal的超滤膜过滤后，得到滤液88L。将陶瓷膜滤液用电渗析膜脱盐至脱盐液电导率0.9ms/cm，得到脱盐液94L，向脱盐液加入活性炭276g，在45℃下搅拌0.5小时后过滤，顶洗活性炭滤饼，调节pH为8.5，得脱色液98L，将脱色液65℃真空浓缩至四氢嘧啶含量为28.6％，搅拌下缓慢降温至5℃，继续搅拌0.2h后过滤，没有四氢嘧啶固体析出。

本发明实施例的提取方法使四氢嘧啶的收率在80％以上且纯度在99.5％以上，产品质量符合企业标准(收率>80％且纯度>99.5％)，工艺符合企业产业化生产，均为国内报道中的领先水平，且工艺简单；而对比例的提取工艺与实施例的工艺相比，其收率小于80％或纯度小于99.5％，存在明显的成本或是质量差距，不适合企业产业化生产。与其他相关专利，例如CN105669560A和CN115417822A等专利中使用树脂工艺比较，本发明工艺更简单，更适合工业化生产，而且工艺中产生的废水更少。比CN109053587A专利减少了有机溶剂乙醇的使用，本发明实施例的提取方法污染少，更节约资源。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种从发酵液中分离纯化四氢嘧啶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、预处理：将四氢嘧啶发酵液通过陶瓷膜、超滤膜过滤后，得到澄清预处理液；

S2、脱盐：用电渗析膜对澄清预处理液进行脱盐处理，得到脱盐液；

S3、脱色：利用活性炭对脱盐液进行脱色处理，调节pH为6.5-9.0，过滤得到脱色液；

S4、浓缩结晶：脱色液减压浓缩至四氢嘧啶含量为30％-60％，在0-20℃下进行结晶，过滤得到四氢嘧啶湿晶体和过滤母液；

S5、干燥：对四氢嘧啶湿晶体进行真空干燥，得到四氢嘧啶晶体；

S6、母液回收：利用脱色剂对步骤S4的过滤母液脱色后减压浓缩并进行二次结晶，过滤干燥得到合格的回收品，回收品与四氢嘧啶晶体结合得到所述的四氢嘧啶；

步骤S3所述活性炭的质量为脱盐液的0.01％-0.3％；步骤S6所述二次结晶中四氢嘧啶含量为30％-60％；所述二次结晶的温度为0-20℃；步骤S6所述脱色剂为活性炭。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1所述陶瓷膜的孔径为20-200nm，所述超滤膜的截留分子量为300-10000Dal。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2所述电渗析膜为合金电渗析膜，阳膜为CAM，阴膜为AAM；所述电渗析的电导率为0.1-1ms/cm。